Diese Arbeit wurde in erster Linie durch 5-UO1-ES016045 unterstützt mit teilweiser Unterstützung von 1-R21-R44-und ES019498 ES021116. DMW wurde von der Ausbildungsförderung in NIEHS Umwelttoxikologie T32-ES007020 unterstützt. Ausrüstung wurde vom Zentrum für Umweltgesundheitswissenschaften P30-ES002109 vorgesehen.

1. Herstellung von Chip <ol style="margin-left: 40px;"><li> Entfernen Chip-Gel aus dem Paket und in einen Ein-und rechteckige Platte, Gel Folienseite nach unten. </li><li> Waschen Gel in 25 ml 1x PBS für 15 min, zwei Mal wiederholen. </li><li> Set Gel auf Glasplatte und Etiketten Orientierung des Gels entsprechend. </li><li> Drücken Sie vorsichtig einen umgekehrten boden 96-Well-Platte auf das Gel; stellen Sie sicher, dass alle Vertiefungen der Platte sind auch boden im Bereich des Gels. </li><li> Verwenden 1.5 &#39;&#39; Binder Clips auf jeder Seite der Platte, um mit der Glasklemm sichern. </li><li> Absaugen überschüssigen PBS-Puffer in jede Vertiefung. </li></ol> 2. Laden Cells <ol style="margin-left: 40px;"><li> Bereiten Zellsuspensionen: <ol><li> Für Suspensionszelllinien, verdünnte Zellsuspension in Medium bis zu einer Endkonzentration von 10 5 -10 6 Zellen / ml zu erhalten. </li><li> Für adhärenten Zelllinien, folgen normalen Abnehmen / Trypsinierung Protokolle und dilute abgelösten Zellen in Medium auf eine Endkonzentration von 10 5 -10 6 Zellen / ml. Wenn Zellen aggregieren, vorbei Zellsuspension in einer Zelle Filter, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. </li></ol></li><li> 100 ul der Zellsuspension in jede Vertiefung der 96-Well-Platte. </li><li> Platte mit der Gel-Film um das Verdampfen von Medien zu verhindern. </li><li> Sodass die Zellen für mindestens 30 min in 37 ° C-Inkubator laden. </li><li> Entfernen Chip von Inkubator und saugen Medien aus jeder Vertiefung. </li><li> Entfernen Bindemittel Clips und boden 96-Well-Platte; halten den Chip mit der Glasplatte in einem Winkel und sanft spülen Sie mit 1x PBS, um überschüssige Zellen auf Agarose zu entfernen. </li><li> Überprüfen Zellbeladung mit einer Hellfeld-Mikroskop mit einem 4X Objektiv. Wenn nicht genügend Lade beobachtet wird, wiederholen Sie die Schritte 2.1. </li><li> Zeigen geladen Chip auf einer ebenen Fläche (Labortisch). Bei 37 ° C Overlay-Chip mit 1% niedriger Schmelzpunkt (LMP) Agarose, die vorgewärmt. Verwenden Sie etwa 2̵1, 3 ml LMP-Agarose ist für jeden Chip benötigt. </li><li> Ermöglichen Overlay bei RT erstarren zunächst für 3 min und dann auf 4 ° C Kühlschrank bewegen für 5 min für eine vollständige Gelbildung. </li></ol> 3. Dosierung und Reparatur HINWEIS: Um Baseline-DNA-Schäden Ebene zu studieren, fahren Sie mit Schritt 4 fort. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Sorgfältig ausrichten Vertiefungen der Chip (von früheren Klemm erstellt) mit den Vertiefungen einer neuen boden 96-Well-Platte. Wieder drücken Sie die bodenlose 96-Well-Platte auf der Oberseite und sicheres Spannen mit Bindemittel Clips. </li><li> 100 ul des chemischen gewünschte Dosis in jede Vertiefung der 96-Well-Platte; führen Dosierung / Behandlung auf Eis oder in 4 ° C Kühlschrank gewünschte Höhe der Zeit. </li><li> Nach der Dosierung, saugen Chemikalien aus jeder Vertiefung und abspülen Rest chemischen mit 1x PBS. Wenn direkte Schäden hier studiert, fahren Sie mit Schritt 4 fort. </li><li> Reparatur Kinetik zu untersuchen, sodass die Zellen auf dem Chip zu reparieren inMedien bei 37 ° C aufweist. Lyse (gehen Sie zu Schritt 4) zu bestimmten Zeitpunkten. HINWEIS: Die Reparatur kann auf dem Chip mit einem boden 96-Well-Platte befestigt geführt werden, oder der Chip kann nach dem Entfernen des bodenlosen 96-Well-Platte in einzelne Stücke geschnitten werden. </li></ol> 4. Lyse <ol style="margin-left: 40px;"><li> Bis alkalischen Comet-Assay durchzuführen: <ol><li> Die Arbeit der alkalischen Lyse-Puffer durch Zugabe von 1% Triton X-100, um die Lyse-Stammlösung (2,5 M NaCl, 100 mM Na 2 EDTA, 10 mM Tris, pH 10) alkalisch. Bereiten Sie etwa 25 ml der Arbeits Lyse-Puffer für jeden Chip. </li><li> Pre-Chill-Arbeitsalkalischen Lyse-Puffer bei 4 ° C. </li><li> Tauchen Chip in kühlen Arbeitsalkalischen Lyse-Puffer und ermöglichen Lyse zu O / N in 4 ° C Kühlschrank durchzuführen. </li></ol></li><li> Neutral Comet-Assay durchzuführen: <ol><li> Machen die Arbeit neutral Lyse-Puffer durch Zugabe von 1% Triton X-100 und 10% DMSO auf neutral Lyse-Stammlösung (2,5 M NaCl, 100 mM Na 2 EDTA, 10mM Tris, 1% N -Lauroylsarcosine, pH 9.5). Bereiten Sie ca. 25 ml Arbeits Lyse-Puffer für jeden Chip. </li><li> Pre-warmen Arbeits neutral Lyse-Puffer bei 43 ° C. </li><li> Tauchen Chip in warmen Arbeits neutral Lyse-Puffer und ermöglichen Lyse zu O / N in 43 ° C-Inkubator durchzuführen. </li></ol></li></ol> 5. Die Elektrophorese <ol style="margin-left: 40px;"><li> Bis alkalischen Comet-Assay durchzuführen: <ol><li> Entfernen Lyse-Puffer und schnell spülen Chip mit 1x PBS. </li><li> Sichere Chips in einer Elektrophorese-Kammer mit Gel-Film Seite nach unten mit doppelseitigem Klebeband. </li><li> Bringen der Kammer auf einen 4 ° C kalten Raum. </li><li> Füllen Sie die Kammer mit kaltem alkalischen Elektrophorese-Puffer (0,3 M NaOH, 1 mM Na 2 EDTA) auf ein Niveau, das gerade deckt das Gel. </li><li> Lassen Sie für alkalische Abwickeln für 40 min. </li><li> Führen Elektrophorese bei 1 V / cm und 300 mA für 30 min in einem kalten Raum. Stellen Sie die Lautstärke von Elektrophorese-Puffer in der chamber, um gewünschte Laufstrom zu erreichen. </li></ol></li><li> Neutral Comet-Assay durchzuführen: <ol><li> Entfernen Lysepuffer und spülen Chip mit neutralen Elektrophorese-Puffer (2 mM Na 2 EDTA, 90 mM Tris, 90 mM Borsäure, pH 8,5) für 2 x 15 min bei 4 ° C ist. </li><li> Sichere Chips in einer Elektrophorese-Kammer mit Gel-Film Seite nach unten mit doppelseitigem Klebeband. </li><li> Bringen der Kammer auf einen 4 ° C kalten Raum. </li><li> Füllen Sie die Kammer mit kaltem neutral Elektrophorese-Puffer (2 mM Na 2 EDTA, 90 mM Tris, 90 mM Borsäure, pH 8,5) auf ein Niveau, das gerade deckt das Gel. </li><li> Lassen Sie das Gel in Kühlraum für 60 min sitzen. </li><li> Führen Elektrophorese bei 0,6 V / cm und 6 mA für 60 min in einem kalten Raum. Stellen Sie die Lautstärke von Elektrophorese-Puffer in der Kammer, um die gewünschte Laufstrom zu erreichen. </li></ol></li></ol> 6. Fluorescent Imaging <ol style="margin-left: 40px;"><li> Entfernen Chip von Elektrophorese Kammer von cold Raum. </li><li> Neutralisieren die Gele in Neutralisationspuffer (0,4 M Tris, pH 7,5) für 2 x 15 min in 4 ° C Kühlraum. </li><li> Flecken auf der Chip mit fluoreszierenden DNA-Farbstoff der Wahl (dh, SYBR Gold, Ethidiumbromid) unter Fabrik empfohlenen Verfahren. Bild mit Fluoreszenz-Mikroskopie. </li></ol> 7. Datenanalyse Kometen analysieren Bilder von Standard-Comet-Assay-Software wie Komet 5.5.

<ol>
	<li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Comet+Assay+for+DNA+Damage+and+Repair+Principles,+Applications,+and+Limitations.">The Comet Assay for DNA Damage and Repair Principles, Applications, and Limitations.</a> Molecular biotechnology. 26 (3), (2004).</li><li>Olive, P. L., Ban&#225;th, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+a+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells.">The comet assay a method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nature. 1 (1), 23-29 (2006).</li><li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrophoretic+study+of+radiation+induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells.">Microelectrophoretic study of radiation induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochemical and biophysical research communications. 123 (1), 291-298 (1984).</li><li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells.">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Experimental cell research. 175 (1), 184-191 (1988).</li><li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair:+principles,+applications,+and+limitations.">The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations.</a> Molecular biotechnology. 26 (3), 249-261 (2004).</li><li>Wood, D. K., Weingeist, D. M., Bhatia, S. N., Engelward, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+trapping+and+DNA+damage+analysis+using+microwell+arrays.">Single cell trapping and DNA damage analysis using microwell arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10008-10013 (2010).</li><li>Weingeist, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microarray+enables+high-throughput+evaluation+of+DNA+double-strand+breaks+and+DNA+repair+inhibitors.">Single-cell microarray enables high-throughput evaluation of DNA double-strand breaks and DNA repair inhibitors.</a> Cell cycle. 12 (6), 907-915 (2013).</li><li>Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+comet+assay:+use+and+status+in+genotoxicity+testing.">The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing.</a> Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).</li><li>Witte, I., Plappert, U., de Wall, H., Hartmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+toxicity+assessment:+employing+the+best+science+for+human+safety+evaluation+part+III:+the+comet+assay+as+an+alternative+to+in+vitro+clastogenicity+tests+for+early+drug+candidate+selection.">Genetic toxicity assessment: employing the best science for human safety evaluation part III: the comet assay as an alternative to in vitro clastogenicity tests for early drug candidate selection.</a> Toxicological sciences : an official journal of the Society of Toxicology. 97 (1), 21-26 (2007).</li><li>Valverde, M., Rojas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+and+occupational+biomonitoring+using+the+Comet+assay.">Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay.</a> Mutation research. 681 (1), 93-109 (2009).</li><li>M&#248;ller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotoxicity+of+environmental+agents+assessed+by+the+alkaline+comet+assay.">Genotoxicity of environmental agents assessed by the alkaline comet assay.</a> Basic &amp; clinical pharmacology &amp; toxicology. 96, 1-42 (2005).</li><li>Dusinska, M., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+in+human+biomonitoring:+gene-environment+interactions.">The comet assay in human biomonitoring: gene-environment interactions.</a> Mutagenesis. 23 (3), 191-205 (2008).</li><li>Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comet+assay:+a+reliable+tool+for+the+assessment+of+DNA+damage+in+different+models.">Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models.</a> Cell biology and toxicology. 25 (1), 5-32 (2009).</li><li>McKenna, D. J., McKeown, S. R., McKelvey-Martin, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+use+of+the+comet+assay+in+the+clinical+management+of+cancer.">Potential use of the comet assay in the clinical management of cancer.</a> Mutagenesis. 23 (3), 183-190 (2008).</li><li>Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidatively+generated+damage+to+the+guanine+moiety+of+DNA:+mechanistic+aspects+and+formation+in+cells.">Oxidatively generated damage to the guanine moiety of DNA: mechanistic aspects and formation in cells.</a> Accounts of chemical research. 41 (8), 1075-1083 (2008).</li><li>Forchhammer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+measurement+of+DNA+damage+by+comet+assay+measured+by+the+ECVAG&#8224;+inter-laboratory+validation+trial.">Variation in the measurement of DNA damage by comet assay measured by the ECVAG&#8224; inter-laboratory validation trial.</a> Mutagenesis. 25 (2), 113-123 (2010).</li><li>Olive, P. L., Wlodek, D., Ban&#225;th, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-strand+breaks+measured+in+individual+cells+subjected+to+gel+electrophoresis.">DNA double-strand breaks measured in individual cells subjected to gel electrophoresis.</a> Cancer research. 51 (17), 4671-4676 (1991).</li><li>Frelon, S., Douki, T., Ravanat, J. L., Pouget, J. P., Tornabene, C., Cadet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+liquid+chromatography--tandem+mass+spectrometry+measurement+of+radiation-induced+base+damage+to+isolated+and+cellular+DNA.">High-performance liquid chromatography--tandem mass spectrometry measurement of radiation-induced base damage to isolated and cellular DNA.</a> Chemical research in toxicology. 13 (10), 1002-1010 (2000).</li><li>Georgakilas, A. G., Holt, S. M., Hair, J. M., Loftin, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+oxidatively-induced+clustered+DNA+lesions+using+a+novel+adaptation+of+single+cell+gel+electrophoresis+(comet+assay).">Measurement of oxidatively-induced clustered DNA lesions using a novel adaptation of single cell gel electrophoresis (comet assay).</a> Current protocols in cell biology. , (2010).</li><li>Fortini, P., Raspaglio, G., Falchi, M., Dogliotti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+DNA+alkylation+damage+and+repair+in+mammalian+cells+by+the+comet+assay.">Analysis of DNA alkylation damage and repair in mammalian cells by the comet assay.</a> Mutagenesis. 11 (2), 169-175 (1996).</li><li>Collins, A. R., Dusinsk&#225;, M., Horsk&#225;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+alkylation+damage+in+human+lymphocyte+DNA+with+the+comet+assay.">Detection of alkylation damage in human lymphocyte DNA with the comet assay.</a> Acta biochimica Polonica. 48 (3), 611-614 (2001).</li><li>Ge, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+fluorescent+imaging+of+live+cells+is+highly+genotoxic.">Standard fluorescent imaging of live cells is highly genotoxic.</a> Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83 (6), 552-560 (2013).</li><li>Trzeciak, A. R., Barnes, J., Evans, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+alkaline+comet+assay+for+measuring+DNA+repair+capacity+in+human+populations.">A modified alkaline comet assay for measuring DNA repair capacity in human populations.</a> Radiation research. 169 (1), 110-121 (2008).</li><li>Marcon, F., Andreoli, C., Rossi, S., Verdina, A., Galati, R., Crebelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+individual+sensitivity+to+ionizing+radiation+and+DNA+repair+efficiency+in+a+healthy+population.">Assessment of individual sensitivity to ionizing radiation and DNA repair efficiency in a healthy population.</a> Mutation research. 541 (1-2), 1-8 (2003).</li></ol>

The CometChip has been licensed to Trevigen, Inc. based upon a patent submission that includes Wood, Weingeist, Bhatia and Engelward.

Ubiquitous Genotoxinen in der Umwelt und auch in menschlichen Zellen ausüben unvermeidlichen Stress und Schäden an zelluläre DNA. Tatsächlich wird geschätzt, dass es 1000e DNA-Schäden in menschlichen Zellen vorhanden ist im stationären Zustand 18. Verständnis Schäden und Reparaturanfälligkeit Kinetik im Menschen bringt nicht nur Einblick in die Grundlagenforschung, sondern profitiert auch die Arzneimittelentwicklung. Ironischerweise trotz der Fähigkeit der DNA-Schäden zu fördern Krebs, DNA-schädigende Mittel sind auf sehr hohem Niveau zur Behandlung von Krebs, so dass das Wissen über DNA-Schäden und Reparatur relevanten personalisierten Medizin. Die CometChip ist ein neuartiges Gerät, das Mikroforschungspraktiken nutzt, um eine langfris existierte Assay DNA-Schäden zu revolutionieren. Aufbauend auf den gleichen Prinzipien der traditionellen Comet-Assay bietet der Chip deutlich höheren Durchsatz und eine bessere Reproduzierbarkeit. Wir beschreiben hier Methoden für die Verwendung dieser Chips. Um Nutzen und Robustheit zu verdeutlichen, zeigen wir Ergebnisse herm verschiedene Experimente, in denen der Chip verwendet worden, um eine Beschädigung durch mehrere verschiedene DNA-schädigende Mittel induziert bewerten und, wo es verwendet wurde, um die DNA-Reparatur zu bewerten. Zusammen, hier vorgestellten Ergebnisse liefern hilfreiche Informationen für die Verwendung der Chips und zeigen ihre breite Anwendbarkeit, die Forschung über DNA-Schäden und Reparatur. Einer der wichtigsten Schritte dieses Protokolls ist die effektive Zellenbelastung zu erreichen. Viele Zelllinien wurden auf diesem System getestet, darunter sowohl Federung und adhärenten Zellen. Beladungseffizienz hängt von vielen Variablen, wie Zelltyp, Zellgröße, Beladungskonzentration und Zeit. Suspensionszelllinien wie Lymphoblastoidzellen sind am einfachsten zu handhaben. Konzentration der Zellsuspension von 10 4 bis 10 6 Zellen pro 96-well variieren und Laden beendet normalerweise in 15-30 min. Höhere Zelldichte erleichtert Lade und verkürzt die Zeit für die Zellen, in die Vertiefungen abwickelt. Ladeparameter für adhärenten Zellen aus Suspensionszellen unterscheiden. Zelllinien, wie chinesische Hamster-Eierstockzellen (CHO), wurde gefunden, dass ähnliche Ladeeffizienz als Suspensionszellen (nach Trypsinbehandlung) aufweisen und somit verwenden ähnliche Lastbedingungen. Andere Zelltypen, wie beispielsweise Tumorzellen, die sich leicht bilden, Zellaggregate in Suspension, zusätzliche Handhabung. Passieren Zellsuspensionen durch eine einzelne Zellenfilter und Zugabe von Trypsin zum Suspensionsmedium kann die Bildung von Zellaggregaten während des Ladens zu unterdrücken. Schließlich, im Hinblick auf die Ladezeit, die Zeit für die Erfassung adhärenten Zelllinien in Vertiefungen kann von 20 min bis 1 Stunde variieren, erforderlich. Als Ergebnis, ist es empfehlenswert, die Benutzer ausführen Pilotversuche, um eine optimale Ladebedingungen, bevor Sie mit weiteren Untersuchungen zu bestimmen. Laden Wirksamkeit kann unter einer Hellfeld-Mikroskop oder durch Färbung der eingekapselten Zellen mit DAPI oder andere DNA sichtbar gemacht werden genauer aufgedecktFlecken vor der Auswertung unter dem Fluoreszenzmikroskop. Ein wesentlicher Vorteil dieses Verfahrens und dieser Chip ist die Vielseitigkeit. Zuerst werden die Forscher nicht auf eine bestimmte Arbeitszellkonzentration beschränkt, da überschüssige Zellen werden abgewaschen, und die Microarray gewährleistet eine einheitliche Dichte Kometen. Zweitens können die Vertiefungen mit variabler Größe, um Zelltypen unterschiedlicher Größe aufzunehmen. Unter Umständen, die mehrere Zellen in einem einzigen Mikrowell erfasst, sind Multi-Zell-Kometen im Vergleich zu einzelnen Zelle Kometen 6,7 Selbst kalibriert und konsistente Ergebnisse liefern. Ein weiterer Vorteil der Musterung Zellen in einem Mikroarray ist, dass alle Kometen dann bei der gleichen Brennebene mit festen Positionen, wodurch Rauschen aufgrund unfokussiert Kometen und Erleichterung der automatisierten Bildverarbeitung und Analyse. Die wesentlichen Verbesserungen im Durchsatz und die Empfindlichkeit des CometChip vorgesehen ermöglichen die Anwendung des Assays für großformatigen Untersuchungen. Zusammengenommen bieten die Chipsa wertvolles Werkzeug für die DNA-Schadensbewertung für Forscher, Toxikologen, Ärzte und Epidemiologen. Während der Comet-Assay ist für seine ausgezeichnete Empfindlichkeit bei der Erkennung eine Vielzahl von DNA-Schäden bekannt ist, leidet dieser Test auch von geringen Spezifität. Über dieses Protokoll die Reproduzierbarkeit und Durchsatz des Assays verbessert, aber nicht Fortschritt in der Spezifität zu demonstrieren. Dennoch Multiplexen der Assay mit anderen Methoden ist berichtet worden, bei der Erzielung höherer Spezifität sein. Ein Beispiel ist die Einbeziehung von gereinigtem Läsion spezifischen Enzymen. Diese Enzyme können sonst nicht nachweisbar Basis Läsionen nachweisbar in Strangbrüchen und abasische Stellen 1,19-21 konvertieren. Ein weit verbreitetes Beispiel ist die Reparatur Endonuklease Formamidopyrimidin-DNA Glykosylase (FPG), die oxidative DNA-Modifikationen 19,22 enthüllt. Da die Enzymverdauungsschritt nach der Zelllyse verwendet, kann das System behandelt werden, auf die gleiche Weise einsa traditionellen Agarose Rutsche ohne Änderungen des Protokolls. Obwohl der detaillierte Protokoll wird hier nicht beschrieben, hat diese Vorgehensweise viele traditionelle Comet-Assay Benutzer in der Vergangenheit angepasst und die Protokolle können leicht gefunden werden. In einer früheren Veröffentlichung, haben wir diese Methode, um fluoreszierende Lichtschäden 22 zu identifizieren. Der große Vorteil dieses Verfahrens ist der Durchsatz bietet es, die Türen zu Studien, die bislang praktisch unmöglich war geöffnet. Die Fähigkeit, 96 Proben auf der gleichen Plattform Verfahren reduziert nicht nur die Arbeit und Zeit, sondern reduziert auch experimentelle Rauschen kann und verbessert die Reproduzierbarkeit. Inter Probenvariation deutlich geringer ist als die herkömmliche Schlitten zu Schlitten Variante, die 2-fach höher als die mit diesem Chip 6,7 beobachtete Variation sein. Reduziert Lärm führt auch zu einer verbesserten Empfindlichkeit, eine Erfassung von mehr feine Unterschiede zwischen den Proben. Da das Gerät verwendet ein standard 96-Well-Format, ist es mit der allgemeinen Forschungsgeräten kompatibel und HTS-Technologien. Betrachten wir eine Studie, die Bewertung der 100 Proben benötigt, unter der Annahme, daß eine durchschnittliche Forscher kann 30 Glasobjektträger über den Verlauf von mehreren Tagen ~ verarbeiten. Da jede Probe muss dreifach durchgeführt werden, würde es etwa einen Monat dauern, bis eine solche Studie, die auch zwangsläufig leiden würde von Probe zu Probe Variation abzuschließen. Im Gegensatz dazu Verarbeitung 100 Bedingungen, die jeweils in dreifacher Ausfertigung, mit diesem Chip benötigt nur ein paar Platten und kann in drei Tagen durchgeführt werden. Diese wesentliche Verbesserung des Durchsatzes öffnet die Tür zu Studien, die bisher unerreichbar waren. Die hier vorgestellte Protokoll beschreibt sowohl die grundlegenden Verfahren für die Durchführung des Standard-Comet-Assay und die erforderlich, um die Plattform zu nutzen CometChip veränderten Schritte. Mit der Fähigkeit, sowohl DNA-Schädigung verbundenen Ebenen und die anschließende Reparatur Reaktion zu messen, ist der Test sehr relevanteine Vielzahl von biologischen und klinischen Anwendungen. Informationen über die Auswirkungen von spezifischen chemischen Expositionen auf dem Genom erleichtert Prävention und Behandlung. Weiterhin besteht auch großes Interesse an der Bestimmung der Veränderungen in der DNA-Schadensempfindlichkeit und Reparaturkapazität zwischen Individuen 23,24. Diese Technik bietet die für solche groß angelegte Studien erforderlich Durchsatz. Kenntnisse über inter-individuelle Variationen ist entscheidend für die Identifizierung empfindlichen Menschen und für die Gestaltung von individualisierten Therapien oder Verhinderungen Strategien. Zusammengenommen ist die hier vorgestellte Technologie bietet einen hohen Durchsatz, objektive und quantitative Analyse von DNA-Schäden Plattform, die das Potenzial zu einem Standardverfahren in naher Zukunft hat.

Die einzelne Zelle Gelelektrophorese (SCGE) Test (auch bekannt als der Comet-Assay) ist eine weit verbreitete Technik für die Quantifizierung von einem breiten Spektrum von DNA-Schäden, einschließlich Basis Läsionen, Leerstellen-, Einzelstrangbrüche, Doppelstrangbrüche, Vernetzungen und alkaliempfindlichen Websites. Das zugrunde liegende Prinzip des Tests ist, dass geschädigte DNA wandert leichter als unbeschädigt DNA aufgrund der Fragmentierung und Verlust der Superhelix-Struktur. Das Ausmaß der Wanderung proportional zu der Menge an DNA-Schäden, und kann unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops. Bild-Capture-und Intensitätsprofil Analyse einzelner Kometen-förmige DNA dann liefern Parametermessungen wie Schwanzlänge, Schwanz Moment, und% DNA in tail, um das Niveau von DNA-Schäden innerhalb einer Zelle 1-4 offenbaren. Derzeit gibt es zwei häufig verwendete Versionen der Comet-Assay: a) alkalischen Comet-Assay und b) neutralen Comet-Assay. Die alkalische Comet-Assay ist das am häufigstengebrauchte Version, die einen hohen pH-Puffer verwendet, um DNA vor der Elektrophorese zu entspannen und somit erkennt alle Arten von Strangbrüchen und alkaliempfindlichen Seiten. Die neutrale Comet-Assay, auf der anderen Seite weniger geübten weil es eine neutrale Puffer die Doppelhelices zu erhalten und zu erfassen Doppelstrangbrüche 2,5. Für chemische und physikalische Einwirkungen, die DSB zu induzieren, sind SSB im Konzert erstellt und werden bei sehr viel höheren Ebenen gebildet (zB γIR-induzierten ESBs sind eine Größenordnung häufiger als DSB). Für die meisten DNA-schädigenden Expositionen sind DSBs viel weniger häufig als andere Klassen von DNA-Schäden und sind daher schwerer zu erkennen. Wir haben in früheren Publikationen die Nachweisfenster der beiden Versionen 6,7 demonstriert. Obwohl die Comet-Assay wurde routinemäßig für die Grundlagenforschung auf DNA-Schädigung und-Reparatur und Genotoxizität 1,2,8-15 verwendet wird, wurde der Test wurde berichtet, mit einer schlechten Reproduzierbarkeit durch Probe-zu-Probe, Person-zu-Person-und Labor zu Labor Variabilität. Zusätzlich wird der Test geringen Durchsatz, zum Teil, weil die Bildaufnahme und Datenanalyse sind aufwendig. Zusammen bilden diese Einschränkungen dazu beitragen, die relativ geringe Akzeptanz in großen Studien. Durch die Integration von Engineering-Technologien und Prinzipien, bringt das CometChip eine Lösung für die Probleme des Durchsatzes und Inkonsistenzen, die mit dem traditionellen Comet-Assay 6,7 zugeordnet sind. Kurz gesagt, um den Chip zu erstellen, eine Form mittels Photolithographie zu microposts mit Durchmessern so klein wie die von einer einzigen Zelle erstellen mikrofabriziert. Die Form wird dann verwendet, um geschmolzene Agarose Stempel, was zu einer Reihe von Vertiefungen, nachdem das Gel verfestigt. Chips werden entwickelt, um Forschern variabler Größe Vertiefungen mit unterschiedlichen Zelltypen kompatibel ist. Um den Chip zu laden, werden die Zellen in Medien erlaubt, in die Vertiefungen durch die Schwerkraft zu regeln; Über Zellen weggewaschen. Gefangen Zellen werden dann uns gekapselting eine dünne Schicht aus niedrigschmelzender Agarose und eine boden 96-Well-Platte wird dann auf die Gel-Oberfläche geklemmt macrowells 96, die jeweils mit Hunderten von Mikrovertiefungen auf seiner unteren Oberfläche. Dieses Protokoll beschreibt die allgemeinen Verfahren für die Experimente mit diesem Chip, der Gelzubereitung, Zellenbelastung, Dosieren und Reparatur, Zelllyse, Elektrophorese und Fluoreszenz-Bildgebung umfassen. Wir zeigen zwei Beispiele für Dosis-Antwort-Experimente mit Lymphoblastenzellen ausgesetzt bekannten DNA-schädigenden Mitteln mit alkalischen und neutralen Versionen des Tests auf. Zwei Reparaturversuche sind ebenfalls dargestellt, um zu beschreiben, wie die Reparatur Antwortpostexpositions können mit dem System ausgewertet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="797">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Name of Reagent/Material</td>
			<td style="width:129px;">Company</td>
			<td style="width:101px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:373px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">UltraPure LMP Agarose (low melting point)</td>
			<td style="width:129px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">16520</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td style="width:129px;">Gibco by life technologies</td>
			<td style="width:101px;">14190</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline NaCl</td>
			<td style="width:129px;">Macron Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">7581-06</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline Na2EDTA</td>
			<td style="width:129px;">Macron Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">4931-04</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline Tris (base)</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T1503</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline Tris (acid)</td>
			<td style="width:129px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:101px;">4106</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Crystalline N-lauroylsarcosine</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">L9150</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Highly toxic by inhalation, Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">X100</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Harmful by ingestion., Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D4540</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Combustible Liquid, Target Organ Effect</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline NaOH</td>
			<td style="width:129px;">Macron Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">7708-06</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">BDH3871</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Crystalline boric acid</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">B6768</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Target Organ Effect, Teratogen, Reproductive hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Name of Equipments</td>
			<td style="width:129px;">Company</td>
			<td style="width:101px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:373px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">CometChip</td>
			<td style="width:129px;">Trevigen</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;">Under development for distribution, contact Trevigen directly to obtain materials necessary</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1-well dish</td>
			<td style="width:129px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:101px;">73521-420</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Bottomless 96-wel plate</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">655000-06</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1.5&#8243; binder clips</td>
			<td style="width:129px;">Staples</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glass plate</td>
			<td style="width:129px;">Tag Hardware</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;">Customized to size of 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Owl Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">27372-131</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td style="width:129px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:101px;">164-5050</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cometchip: a high-throughput 96-well platform for measuring dna damage in microarrayed human cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

In diesem ersten Beispiel beschreiben wir den Ansatz zur Quantifizierung Ausgangsniveaus von DNA-Schäden in humanen lymphoblastoiden Zellen nach Exposition gegenüber oxidativer Schädigung unter Verwendung von H 2 O 2. Um H 2 O 2-induzierten Läsionen und Basiseinzelstrangbrüche zu beurteilen, werden alkalischen Komet Bedingungen verwendet. Nach dem Laden abgeschlossen ist, und die Zellen wurden mit Agarose-Overlay eingekapselt wurde, wird eine boden 96-Well-Platte auf die Oberfläche gedrückt wird, um mit 96 Fächern auf dem Chip zu schaffen. Jeder der 96 Vertiefungen können mit einer anderen Art oder Konzentration von Chemikalien dosiert werden. Hier vier verschiedenen Dosen von H 2 O 2 verwendet wurden und 1x PBS wurde als Negativkontrolle verwendet. Repräsentative Bilder angeordnet Kometen in 1A, wobei nicht-behandelten (oben), 50 uM (Mitte) und 100 uM (unten) H 2 O 2 -exposed Proben zeigten verschiedene Ebenen der Kometenschweife gezeigt. Analyse von Kometen Bilder können Perfor werdenmed unter Verwendung kommerziell verfügbarer Software, die allgemein quantifiziert Schadenshöhe bezogen auf die Gesamtfluoreszenzintensität und die Laufstrecke von jedem Kometenschweif. Messungen werden üblicherweise auf 50 bis 100 Kometen pro Zustand und dem Medianwert (entweder% Schwanz-DNA oder Schwanzlänge) durchgeführt wird, berechnet. 1B zeigt den Prozentsatz Schwanz-DNA-Antwort-Kurve aus den TK6 lymphoblastoiden Zell Kometen zu vier verschiedenen Konzentrationen von H ausgesetzt analysiert 2 O 2. Die Konsistenz zwischen unabhängigen Experimenten demonstriert die Wirksamkeit dieses Ansatzes bei der Beurteilung der DNA-Schadensantwort von den verschiedenen Ebenen der chemischen Behandlung in Zellen. Bis etwa Variation zwischen Proben (zB unter macrowells) und unter Wiederholung des gleichen Experiments zu lernen, wurde zwischen den Stichproben und inter experimentellen Variabilität in 2A und 2B dargestellt. Innerhalb jedes Experiments wurde jede Vertiefung der 96-Well-Chip entspricht einer unterschiedlichen Probe und damit die wohl gut Variation zeigt die inter Probe Variante der Vorrichtung. Hier wurden TK6-Zellen in 12 Vertiefungen von 96-Well-Chip geladen mit der gleichen Dosis des H 2 O 2 behandelt wird und unmittelbar nach der Behandlung lysiert. Alle anderen experimentellen Schritte wurden parallel durchgeführt und die Mittelwerte von mindestens 50 Kometen aus jeder macrowell wurden in 2A dargestellt. Der Durchschnitt der Mediane ist 77,53% DNA in Schwanz, mit einer Standardabweichung ist 3.99%. Aus diesen Daten berechnen wir, dass der Variationskoeffizient zwischen den Proben beträgt 5,2%, was ein Vielfaches niedriger als die traditionellen Test ist, was die verbesserte Robustheit des Assays 6,16. Um über die Reproduzierbarkeit des Tests zu erfahren, setzten wir TK6 Zellen in einem Chip mit 75 um H 2 O 2 und die sofortige Ebene der DNA-Schäden zu analysieren. Dieses Experiment wurde sechsmal wiederholt und die Daten von jedem Experiment wurde in F aufgetragenBBILDUNG 2B. Unter identischen Versuchsbedingungen erhalten wir Ergebnisse, die von 41.76% auf 57.87%, als graue Balken in der Abbildung dargestellt. Der Durchschnitt von sechs Wiederholungen ist 49,57%, mit Standardfehler des Mittelwertes von nur 2,04%. Die geringe Unterschiede zwischen den Wiederholungen bedeutet, dass der Comet-Assay auf diesem neuartigen Gerät durchgeführt ist sehr gut reproduzierbar. Reparatur Kinetik zu bewerten, werden Zellen erlaubt, ihre DNA in frische Medien nach der Behandlung zu reparieren. Lyse macrowells zu verschiedenen Zeitpunkten zeigt die Veränderung der DNA-Schaden über Zeit. Ein Beispiel ist in Abbildung 3 dargestellt. In diesem Experiment wurden TK6-Zellen zuerst in der Chip eingekapselt ist, mit 50 uM H 2 O 2 behandelt, und das Instandsetzen von bis zu 60 min nach der Belichtung. Zellen wurden bei 0, 20, 45 und 60 min jeweils lysiert. Repräsentative Kometen Bilder zu verschiedenen Zeitpunkten sind in Figur 3A gezeigt, und die Veränderung der DNA-Schadensstufen über der Zeit ist in Abbildung aufgetragen3B. Diese Daten ergab, dass fast alle der Schaden innerhalb von 45 Minuten nach der H 2 O 2-Behandlung repariert. Viele Variablen können die Rate der Reparatur beeinflussen, einschließlich der Art der Zelllinie und der chemischen Mittel verwendet. Daher können die Forscher Veränderungen am Protokoll (dh Verlängerung der Reparaturzeit), um zusätzliche Bedürfnisse in ihren Untersuchungen unterzubringen. Hier stellen wir ein weiteres Beispiel für Reparaturversuch mit diesen Chip, wobei TK6-Zellen werden mit einem anderen genotoxisch Mittel N-Methyl-N &#39;N -Nitro- -Nitrosoguanidine (MNNG) herausgefordert wird ein Alkylierungsmittel bekannt, Basis Läsionen, darunter 7-Methylguanin induzieren und 3-Methyladenin. Diese Läsionen sind umgerechnet auf Websites entweder durch spontane Depurinierung oder durch enzymatische Entfernung von DNA-Glycosylasen abasische. Die resultierende Leerstelle kann unter alkalischen Bedingungen gespalten werden und so auf dem Chip detektiert. Anfangsexposition bewirkt eine signifikante Erhöhung der Schädigung, erkennbar an der langenSchwänze, und im Laufe der Zeit diese Schwänze reduziert, wenn die Zellen wiederherzustellen intakte DNA während der Reparatur. Obwohl Alkylierung und oxidative Schädigung sowohl primär durch die Basenexzisionsreparatur Weg repariert, die Menge von Läsionen erzeugt, und die Proteine ​​in Reparatur beteiligt variieren. Diese Schwankungen können zu unterschiedlichen Umsetzungsraten führen zu Websites, sowie unterschiedlichen Geschwindigkeiten der Reparatur der entstandenen Leerstellen-abasische. In 4 Kinetik der Reparatur TK6-Zellen auf 0,1, 1 belichtet und 3 ug / ml MNNG gezeigt. Bei diesem Experiment haben wir das Experiment Zeit auf 2 Stunden nach der Exposition durch MNNG-induzierten Schäden scheint länger andauern und wird bei einer langsameren Rate gelöscht Vergleich zu H 2 O 2-induzierten Schäden. Analyse DSB mit neutralen Bedingungen sehr ähnlich zu dem Protokoll zur Analyse von Einzelstrang-Läsionen mit den alkalischen Bedingungen. Zu Anfangsschaden Ebenen zeigen, wurden TK6 Zellen auf variable Ebenen der Gir ausgesetzt,<html> und die resultierenden Zellen wurden lysiert und einer Elektrophorese bei einem neutralen pH-Wert (5A). Es ist bemerkenswert, dass die Morphologie der Kometenschweife unterscheidet sich von den Alkali-Testbedingungen. Zu beobachtbaren fragmentierten DNA zu erreichen unter Verwendung dieses Tests ist die IR-Dosis verwendet signifikant höher (0-100 Gy) als die erforderlich ist, um Schäden zu sehen mit den alkalischen Bedingungen Dosis. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass die Schwanzlänge ist der empfindlichste Parameter, die den Grad der DNA-Schäden bei der Verwendung der neutralen Comet-Assay 7. Die analysierte Dosis-Antwort-Kurve ist in Figur 5B dargestellt. Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüche in den Zellen beurteilt werden kann, und ist von Weingeist et gezeigt. al. 7. Zusammengenommen bietet die neutrale CometChip ein wertvolles Werkzeug für die Hochdurchsatz-Analyse von DNA-DSBs. 1highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Abbildung 1. H 2 O 2 Dosiswirkung von TK6 Zellen mit alkalischen Comet-Assay. (A) Angeordnete Mikrotiterplatten Kometen aus unbehandelten TK6 Lymphoblasten (oben) und TK6 Zellen bis 50 um (Mitte) und 100 uM ausgesetzt (unten) H 2 O 2 für 20 min bei 4 ° C ist. Maßstab ist 100 um. (B) H 2 O 2 Dosisantwort TK6-Zellen auf verschiedene Pegel von H 2 O 2 ausgesetzt. Jeder Datenpunkt ist der Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten, wobei der mittlere Prozentsatz Schwanz-DNA von mindestens 50 einzelnen Kometen wurde in jedem Experiment erhalten. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert aus drei unabhängigen Experimenten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. Inter-Sample und Inter-Experimental Variabilität. (A) Probe zu Probe Variation. TK6 menschlichen Lymphoblasten-Zellen wurden in 12 Vertiefungen einer 96-Well-Chip geladen. Jede Vertiefung wurde zu 100 ul von 50 uM H 2 O 2 ausgesetzt für 20 min bei 4 ° C ist. Die Zellen wurden lysiert und sofort für% Tail DNA untersucht. Daten von jeder Vertiefung wird hier gezeigt. Jede Box stellt den Median mindestens 50 Einzel Kometen aus jeder Vertiefung. Der Mittelwert der 12 Wells ist 77,53%, Standardabweichung ist 3,99% und der Variationskoeffizient berechnet, um 5,2% zu sein. (B) Experiment zu Experiment Variation. TK6 menschlichen Lymphoblasten-Zellen wurden in 96-Well-Chip geladen, um 100 ul von 75 uM H 2 O 2 für 20 min bei 4 ° C ausgesetzt. Die Zellen wurden lysiert und sofort für% Tail DNA untersucht.Das gleiche Experiment wurde 6-mal wiederholt, und die Daten von jeder Wiederholung wird als graue Balken dargestellt. Jede Box stellt den Median% Schwanz-DNA von mindestens 100 einzelnen Kometen aus jeder Wiederholung. Der Durchschnitt der 6 Wiederholungen ist 49,57%, wie der Rücken bar angezeigt. Die Standardabweichung von 6 Wiederholungen ist 4,99%, und die Standardfehler des Mittelwertes berechnet, um 2,04% sein, da die Fehlerbalken in der Abbildung dargestellt. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3. Reparatur von H 2 O 2-induzierten Schäden in TK6 Lymphoblasten. (A) Schematische Darstellung der Reparatur Studie mit repräsentativen Kometen. TK6-Zellen werden mit schädigenden Mitteln behandelt und in Medien bei 37 ° C vor der Lyse zu reparieren. (B) Reparatur Kinetik TK6-Zellen nach Behandlung mit 50 uM H 2 O 2 für 20 Minuten bei 4 und #176, c. Jeder Datenpunkt ist der Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten, wobei der mittlere Prozentsatz Schwanz-DNA von mindestens 50 einzelnen Kometen wurde in jedem Experiment erhalten. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert von der Wiederholung der Experimente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig4highres.jpg" width="500" /> Figur 4. Reparatur von MNNG-induzierten Schäden in TK6 Lymphoblasten. TK6-Zellen werden mit 0,1, 1 und 3 ug / ml MNNG für 30 min bei 4 ° C behandelt und in Medien bei 37 ° C bis zu 120 min nach der Reparatur Belichtung. Der mittlere Prozentsatz Schwanz-DNA von mindestens 50 einzelnen Kometen wurde für jede der drei unabhängigen Experimenten erhalten. Fehlerbalken stellen den Standardfehlerder Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten. <img alt="Figur 5" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig5highres.jpg" width="300" /> Abbildung 5. IR Dosiswirkung von TK6 Zellen mit neutralen Comet-Assay. (A) Angeordnete Mikrotiterplatten Kometen aus unbehandelten TK6 Lymphoblasten (oben) und TK6 Zellen bis 40 Gy (Mitte) und 80 Gy (unten) Gamma-Bestrahlung ausgesetzt. Maßstab ist 100 um. (B) IR-Dosiswirkung von TK6 Zellen auf verschiedenen Ebene der Gamma-Bestrahlung ausgesetzt. Jeder Datenpunkt stellt die mittleren Schwanzlänge (um) von mindestens 300 Kometen aus sechs macrowells auf dem Chip vereinigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig5highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells at JoVE.com

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

Wir beschreiben hier eine Plattform, die Comet-Assay Nachweis von DNA-Schäden mit beispielloser Durchsatz ermöglicht. Die Gerätemuster Säugerzellen in einem Microarray und ermöglicht die parallele Verarbeitung von 96 Proben. Der Ansatz erleichtert Analyse der Ausgangsniveau von DNA-Schäden, die Exposition induzierten DNA-Schäden und DNA-Reparatur-Kinetik.

CometChip: Eine Hochdurchsatz-96-Well-Plattform für Mess DNA-Schäden in menschlichen Zellen Microarray

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

cometchip-high-throughput-96-well-platform-for-measuring-dna-damage

Research

JoVE Journal

Bioengineering

17.2K Aufrufe.  Massachusetts Institute of Technology.  Wir beschreiben hier eine Plattform, die Comet-Assay Nachweis von DNA-Schäden mit beispielloser Durchsatz ermöglicht. Die Gerätemuster Säugerzellen in einem Microarray und ermöglicht die parallele Verarbeitung von 96 Proben. Der Ansatz erleichtert Analyse der Ausgangsniveau von DNA-Schäden, die Exposition induzierten DNA-Schäden und DNA-Reparatur-Kinetik. 

Serie: CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

Alginat-Mikrokapseln als 3D-Plattform für die Vermehrung und Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) auf verschiedenen Linien

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Forschung

Biotechnik

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

High-throughput Protein Expression Generator mit einem mikrofluidischen Plattform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher neutrophil counts in the blood are usually an indicator of ongoing infections, while low neutrophil counts are a warning sign for higher risks for infections. To accomplish their functions, neutrophils also have to be able to move effectively from the blood where they spend most of their life, into tissues, where infections occur. Consequently, any defects in the ability of neutrophils to migrate can increase the risks for infections, even when neutrophils are present in appropriate numbers in the blood. However, measuring neutrophil migration ability in the clinic is a challenging task, which is time consuming, requires large volume of blood, and expert knowledge. To address these limitations, we designed a robust microfluidic assays for neutrophil migration, which requires a single droplet of unprocessed blood, circumvents the need for neutrophil separation, and is easy to quantify on a simple microscope. In this assay, neutrophils migrate directly from the blood droplet, through small channels, towards the source of chemoattractant. To prevent the granular flow of red blood cells through the same channels, we implemented mechanical filters with right angle turns that selectively block the advance of red blood cells. We validated the assay by comparing neutrophil migration from blood droplets collected from finger prick and venous blood. We also compared these whole blood (WB) sources with neutrophil migration from samples of purified neutrophils and found consistent speed and directionality between the three sources. This microfluidic platform will enable the study of human neutrophil migration in the clinic and the research setting to help advance our understanding of neutrophil functions in health and disease.

This protocol details an assay designed to measure human neutrophil chemotaxis from one droplet of whole blood with robust reproducibility. This approach circumvents the need for neutrophil separation and requires only a few minutes of assay preparation time. The microfluidic chip enables the repeated measure of neutrophil chemotaxis over time in infants or small mammals, where sample volume is limited.

Mikrofluidik-Plattform zur Messung der Neutrophilen-Chemotaxis von Rohboden Vollblut

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Verwendung Tomoauto: Ein Protokoll für die Hochdurchsatz-Automated Kryo-Elektronentomographie

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Ein Mikrofluidik-Plattform für Hochdurchsatz-Einzelzell-Isolierung und Kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

Ein Hochdurchsatz-Zellarray-Plattform für korrelative Analyse von Zelldifferenzierung und Zugkräften

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Einsatz von Hochdurchsatz-automatisierte Microbioreactor-System für die Produktion des Modells IgG1 in CHO-Zellen

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct libraries of millions of genetically distinct strains, screening for a desired phenotype remains a significant obstacle. With existing screening techniques, there is a tradeoff between information output and throughput, with high-throughput screening typically being performed on one product of interest. Therefore, we present an approach to accelerate strain screening by adapting single cell RNA sequencing to isogenic picoliter colonies of genetically engineered yeast strains. To address the unique challenges of performing RNA sequencing on yeast cells, we culture isogenic yeast colonies within hydrogels and spheroplast prior to performing RNA sequencing. The RNA sequencing data can be used to infer yeast phenotypes and sort out engineered pathways. The scalability of our method addresses a critical obstruction in microbial engineering.

A bottleneck in the &#8216;design-build-test&#8217; cycle of microbial engineering is the speed at which we can perform functional screens of strains. We describe a high-throughput method for strain screening applied to hundreds to thousands of yeast cells per experiment that utilizes droplet-based RNA sequencing.

Hefestamm-Phänotypisierung mit Droplet-basierter RNA-Sequenzierung mit hohem Durchsatz

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Erzeugung dynamischer Umgebungsbedingungen mit einem hochdurchsatzstarken mikrofluidischen Gerät

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart muscle, the myocardium, is notoriously difficult to accomplish in vitro. Mainly, obstacles lie in the need for human cardiomyocytes (CMs) that are either adult or exhibit adult-like phenotypes and can successfully replicate the myocardium&#39;s cellular complexity and intricate 3D architecture. Unfortunately, due to ethical concerns and lack of available primary patient-derived human cardiac tissue, combined with the minimal proliferation of CMs, the sourcing of viable human CMs has been a limiting step for cardiac tissue engineering. To this end, most research has transitioned toward cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) as the primary source of human CMs, resulting in the wide incorporation of hiPSC-CMs within in vitro assays for cardiac tissue modeling.
Here in this work, we demonstrate a protocol for developing a 3D mature stem cell-derived human cardiac tissue within a microfluidic device. We specifically explain and visually demonstrate the production of a 3D in vitro anisotropic cardiac tissue-on-a-chip model from hiPSC-derived CMs. We primarily describe a purification protocol to select for CMs, the co-culture of cells with a defined ratio via mixing CMs with human CFs (hCFs), and suspension of this co-culture within the collagen-based hydrogel. We further demonstrate the injection of the cell-laden hydrogel within our well-defined microfluidic device, embedded with staggered elliptical microposts that serve as surface topography to induce a high degree of alignment of the surrounding cells and the hydrogel matrix, mimicking the architecture of the native myocardium. We envision that the proposed 3D anisotropic cardiac tissue-on-chip model is suitable for fundamental biology studies, disease modeling, and, through its use as a screening tool, pharmaceutical testing.

The goal of this protocol is to explain and demonstrate the development of a three-dimensional (3D) microfluidic model of highly aligned human cardiac tissue, composed of stem cell-derived cardiomyocytes co-cultured with cardiac fibroblasts (CFs) within a biomimetic, collagen-based hydrogel, for applications in cardiac tissue engineering, drug screening, and disease modeling.

Entwicklung von 3D-organisiertem menschlichem Herzgewebe innerhalb einer mikrofluidischen Plattform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...