Mein Name ist Dr. Shankari Nair und ich bin Postdoktorand in der Abteilung für Strahlenbiophysik in der Abteilung für Nuklearmedizin am NRF, iThemba LABS. In diesem Video demonstrieren wir die Verwendung eines automatisierten Gamma H2AX-Foci-Assays an menschlichen peripheren Blutlymphozyten für den Einsatz in Batch-Symmetrieanwendungen. Die Strahlenrisiken für das Personal werden streng kontrolliert.
Ionisierende Strahlung beeinflusst direkt die Struktur der DNA, indem sie DNA-Brüche induziert. Vor allem Doppelstrangbrüche. Einer der frühesten Schritte im DNA-Doppelstrangbrucherkennungsprozess ist die Phospohorilisierung der Histonvariante H2AX und die Rekrutierung von Reparaturproteinen.
Dieses Video zeigt die Verwendung der Mikroskopie zur Bewertung der Anzahl der Gamma-H2AX-Brennpunkte mithilfe eines automatisierten Objektträger-Scanning-Systems und einer Analyseplattform, die das Fluoreszenzmikroskop integriert. Lymphozyten werden aus Vollblut isoliert. Verdünnen Sie Vollblut mit PBS in einem Verhältnis von eins zu eins und legen Sie dann das verdünnte Blut vorsichtig auf ein Volumen des Dichtegradientenmediums.
Schichte das Blut allmählich, indem du das Rohr um 45 Grad schräg hältst. Die Suspension in eine Zentrifuge geben und bei Raumtemperatur 20 Minuten bei 900 G drehen.Nach der Zentrierung bilden sich vier Schichten. Übertragen Sie die trübe Schicht, die die Lymphozyten enthält, vorsichtig in einen neuen sterilen konischen Schlauch.
Waschen Sie die Lymphozyten mit PBS und zählen Sie mit einem Hämozytometer. Sobald die Gesamtzahl der Lymphozyten bestimmt ist, verdünnen Sie den Lymphozyten und die Suspension auf eine Konzentration von etwa 800.000 Lymphozyten in einem Milliliter vollständiger RPMI. Die Proben und sind bereit für unsere Strahlung.
Die Lymphozyten werden mit Gammastrahlen aus einer Kobalt-60-Quelle bestrahlt und anschließend eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten 5%-Kohlendioxid-Inkubator inkubiert. Für jede Bestrahlungsbedingung oder jedes Röhrchen werden drei Objektträger vorbereitet. Legen Sie den Schieber in den Cliphalter, gefolgt von der Filterkarte und schließlich dem Trichter.
Schlittenclips sichern und in die Zytozentrifuge legen. 250 Mikroliter der Zellsuspension auf jeden Trichter geben und fünf Minuten lang 30 G drehen. Die Verwendung der Zytozentrifuge ist unerlässlich, um standardisierte Bedingungen auf der Objektträgerautomatisierung zu erhalten.
Entfernen Sie nach dem Drehen die Objektträger aus dem Clip und zeichnen Sie dann mit dem hydrophoben Stift einen Kreis um die Stelle, an der sich die Zellen befinden. Jetzt, da die Objektträger hergestellt wurden, müssen die Zellen am Objektträger befestigt werden, damit die Immunfluoreszenzfärbung auftreten kann. Die Zellen werden mit einem 3% igen Paraformaldehyd oder PFA und einer PBS-Lösung für 20 Minuten fixiert.
Nach der Fixierung fünf Minuten in einem Coplin Glas mit PBS waschen. Bedecken Sie dann die Zellen mit Triton X, um eine Permeabilisierung zu ermöglichen. Der Permeabilisierungsschritt entfernt mehr zelluläre Membranlipide, damit Antikörper in den Zellkern gelangen können.
Von hier an verwenden wir eine Blockierlösung aus 1% BSA in PBS, um Objektträger zu waschen, um mögliche unspezifische Bindungen zu reduzieren. Nach drei Waschschritten von 10 Minuten mit 1% BSA und PBS werden die Objektträger bei Raumtemperatur mit einem bis 500 primären Anti-Gamma-H2AX-Antikörpern für eine Stunde in der Befeuchtungskammer inkubiert, was leicht durch Zugabe von Nassemklammerpapier am Boden der rechteckigen Objektträgeraufbewahrungsbox erreicht werden kann. Nach der Inkubation mit einem primären Antikörper die Flüssigkeit abkippen und die Folien erneut in einer 1% BSA-Lösung waschen.
Inkubieren Sie Objektträger mit einem ein- bis tausendfach verdünnten sekundären Esel-Anti-Maus-TRITC-Antikörper für eine Stunde in der Befeuchtungskammer. Entfernen Sie den Antikörper, bevor Sie drei 10-minütige Wäschen in PBS durchführen. Decken Sie das Coplin-Glas mit Aluminiumfolie ab, um lichteinwirkung für die Dauer der Waschschritte zu vermeiden.
Entfernen Sie die Objektträger und wischen Sie überschüssiges PBS außerhalb des hydrophoben Kreises mit staubfreiem Seidenpapier ab. Schließlich fügen Sie ein bis zwei Tropfen DAPI hinzu, was zu einem Montagemedium führt, und bedecken Sie die Dias vorsichtig mit dem Abdeckzettel. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen eingeschlossen sind, und lagern Sie die Proben dann über Nacht an einem dunklen Ort bei vier Grad Celsius.
Wischen Sie dias vorsichtig mit einem 70%igen Ethanol ab und legen Sie die Dias auf die automatisierte Scanplattform oder dia stage, die am Zite Axial Images ZED-2 Mikroskop befestigt ist. Wählen Sie das Klassifizierungssetup unter der Registerkarte MetaCyte aus, um den Klassifikator zu bearbeiten. Der ausgewählte Klassifikator wird vom System zum Scannen und Bewerten der Dias verwendet und basiert auf einer Reihe vordefinierter Parameter, die bestimmen, wie das System Zellen auswählt und Schwerpunkte bewertet.
Der Klassifikator kann basierend auf einer Reihe von vorklassifizierten Bildfeldern optimiert und trainiert werden. Abhängig von der Mikroskopvergrößerung, der Art der und den Antikörpern, die für die Färbung verwendet werden, kann ein anderer Klassifikator optimiert werden. Daher variieren Klassifikatoren im Allgemeinen von Labor zu Labor, aber wir werden einen Überblick über die grundlegendsten Schritte geben, die berücksichtigt werden, wenn ein Klassifikatoraufbau angepasst werden muss.
Unter der Registerkarte Capture', kann man den Filter finden, der verwendet wird, hier DAPI und TRITC, mit einer maximalen Integrationszeit von 1,04 Sekunden. Letzteres basiert auf dem ursprünglichen Klassifikator, der von der Firma zur Verfügung gestellt und später für die Antikörperintensität und das Hintergrund-Gamma-H2AX- oder TRITC-Signal in diesem spezifischen Zelltyp, nämlich Lymphozyten, angepasst wurde. Unter der Registerkarte 'Exposure' wird die minimale Integrationszeit definiert.
Der Klassifikator bleibt immer innerhalb der minimalen und maximalen Integrationszeit, wodurch eine Über- oder Unterbelichtung des Objektträgers verhindert wird. Auf der Registerkarte Zellauswahl wurden die minimalen und maximalen Objektbereiche basierend auf der Größe und Form der analysierten Zellen definiert. Zum Beispiel sind der vorbestimmte Konkavitätswert und das Aspektverhältnis spezifisch für Lymphozyten, die im Allgemeinen runde Formen haben.
Auf der Registerkarte Features können Sie die Galerie- und Histogrammansicht ändern und bestimmen, was das Mikroskop für die Punktzahl benötigt. Das System kann zahlreiche Elemente bewerten, abhängig von den Funktionen, die der Benutzer ausgewählt hat. Ein Beispiel ist der Schwellenwert, wie die Software einzelne Objekte bewertet.
Sobald ein geeigneter Klassifikator identifiziert wurde, wählen Sie das Setup in der Seitenleiste aus und geben Sie jeder Folie einen eindeutigen Namen, gefolgt von der Auswahl des entsprechenden Klassifikators. Wählen Sie "Maximale Zellzahl" und fügen Sie die maximale Anzahl von Zellen hinzu, die gescannt werden müssen. Die Suche wird auch dann beendet, wenn das ausgewählte Suchfenster noch nicht vollständig gescannt wurde, sobald die maximale Zellzahl erreicht ist.
Für Biodissymmetrie-Anwendungen ist ein automatisiertes Scoring von 1000 Zellen pro Objektträger ausreichend, wenn man bedenkt, dass drei Objektträger pro Blutprobe vorbereitet werden. Klicken Sie auf OK, um die Einstellungen zu bestätigen. Um Folien zu scannen, wählen Sie in der Seitenleiste 'Suchen'.
Wenn in der Folieneinrichtung die Einstellung ''Manuelles Suchfenster' ausgewählt wurde, öffnet sich eine Dialogzeile zur Bestimmung des Scanbereichs. Mit dem 10-fachen Ziel wird der rechteckige Suchbereich auf der Folie interaktiv ausgewählt, indem zwei Ecken des Suchfeldes per Linksklick fixiert werden. Dies kann mit der Schaltfläche OK bestätigt werden.
Passen Sie eine Fokusstartposition an. Die Software fordert einen Fokus auf und zentriert einen Referenzkern mit dem 40-fachen Ziel für jede Folie und bestätigt die Einstellungen mit OK. Das System bewegt sich automatisch nacheinander zu allen Seiten. Passen Sie bei Bedarf die Live-Image-Einrichtung und die Integrationszeit für diesen Schritt an.
Überprüfen Sie alle Mikroskopeinstellungen. Stellen Sie sicher, dass sich der Hebel des Mikroskopröhrchens in einer Position befindet, die das gesamte Licht zur Kamera umleitet, und bestätigen Sie die Systemaufforderung mit OK. Das System startet den Gitter-Autofokus an der Rasterposition, die dem Referenzfeld am nächsten liegt. Es konzentriert sich weiterhin auf das reguläre Raster und bewegt sich in einem Mäander nach vorne und hinten zum Suchfenster.
Der Scanvorgang beginnt, wenn der Raster-Autofokus abgeschlossen ist. Die Bühne wird in einem MäandermusterFeld nach Feld bewegt, um Daten zu erfassen. Wenn eine Zelle erkannt wird, wird sie positioniert und das Galeriebild wird gespeichert und auf dem Bildschirm angezeigt, und die Zellenanzahl wird aktualisiert.
Die Suche wird beendet, wenn die gesamte Suche gescannt wurde, wenn die maximale Zellenanzahl erreicht wurde oder wenn die Suche abgebrochen wurde. Wenn der Scan abgeschlossen ist, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Leiste unten und öffnen Sie eine Probe. Überprüfen Sie die Galerie, die aus kleinen Bildern von erkannten Zellen besteht.
In diesem Fenster können Sie die in der Galerie gespeicherten Zellen über das Kriterium angeben, das aus dem Dropdown-Menü ausgewählt werden soll. Zellen werden im Allgemeinen in der Reihenfolge angezeigt, in der sie erkannt wurden. Klicken Sie auf Qualitätshistogramm oder Merkmalswertdiagramm, um die Verteilung der erkannten Zellen sowie die Mittelwerte und die Standardabweichung der bewerteten Brennpunkte anzugeben.
Hier vergleichen wir die Null-Grau-Gegen-1,5-Grau-Samples. Dies ist typischerweise ein Kontrollobjektträger mit einem Mittelwert von 0,124 Herden pro Zelle, bei dem die Zelle nicht bestrahlt wurde. In einem Kontext der Biodissymmetrie würde dies darauf hindeuten, dass eine Person keiner hochdosierten Strahlung ausgesetzt war.
In der Grafik können wir sehen, dass die Mehrheit der Zellen fast null Herde pro Zelle hat und es keine Seite der Normalverteilung gibt. Wenn wir dies mit einer Dosis von 1,5 Gray vergleichen, kann deutlich gesehen werden, dass es sich um eine bestrahlte Probe handelt. Im Kontext der Biodissymmetrie ist diese Normalverteilung ein deutliches Zeichen dafür, dass die Probe Strahlung ausgesetzt war.
Das automatisierte Scannen ist empfindlich genug, um herbeigeführte Herde bei niedrigen Dosen zu erkennen. Die Ergebnisse zeigen einen deutlichen linearen Anstieg der Anzahl der Herde pro Zelle mit Dosis. Die automatisierte Methode der DNA-Doppelstrangbruchdetektion ist nützlich für schnelle und biologische Dyssymmetrieanwendungen mit hohem Durchsatz.
Danke für das Aufpassen.
