Wir danken Dr. Christophe Masselon (IRTV, CEA, Grenoble) und die Mitglieder der Virusinfektion und Krebs-Gruppe an der IBS, für die kritische Bewertung des Manuskripts und für hilfreiche Diskussionen. Wir sind dankbar, dass Cyril Dian für die Art Geschenk des Proteins Crm1. Diese wissenschaftliche Arbeit fand in der Massenspektrometrie-Anlage von Grenoble Weisen Centre (ISBG; UMS 3518 CNRS-CEA-UJF-EMBL). Es wurde von der Französisch-Infrastruktur für Integrated Structural Biology Initiative (FRISBI, ANR-10-InSb-05-02) unterstützt wird, GRAL (ANR-10-LABX-49-01) [in der Grenoble Partnerschaft für Strukturbiologie] und durch die Französisch Nationalen Zentrum für wissenschaftliche Forschung (CNRS).

1. Protein-Probenvorbereitung: Puffer Exchange (Optional) 5-25 ul mikromolaren Konzentrationen von Protein (1 bis 20 um) erforderlich. Pufferaustausch kann mit Kreiselultrafiltrationseinheiten (z. B. Vivaspin, Sartorius) oder Mikro Gelfiltrationssäulen (zB Micro Bio-Spin-6-Säulen, Bio-Rad) 29,30 durchgeführt werden. Pufferaustausch Schritte können wiederholt werden, 2-3x. Ausführliche Beschreibung des Pufferaustausch wurde zuvor vorgestellt 29,30. Zum Beispiel nutzen wir 20 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethan (dh Tris) pH 8 als endgültige Puffer. Anmerkung: Dieser Schritt könnte in vielen Fällen weggelassen werden. Es sollte ausgeführt werden, wenn eine Proteinprobe enthält Moleküle oder Puffer, die stark mit MS-Detektion stören können [z. B. Glycerin, 4 - (2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure, HEPES]. Es ist auch sinnvoll, die qu verbessernnalität der Spektren. 2. Umkristallisation von Matrizen, um ihre Reinheit (Optional) verbessern <ol><li> Gießen von 10 ml 40% Ethanol (EtOH) in einem Pyrex-Kolben. </li><li> Add 600 mg einer Matrix. </li><li> Verwendung eines Wasserbades und einer Widerstandsheizung, erwärmt die Matrixlösung und rühren, bis die Matrix vollständig mit einem Glasstab oder einem Magnetrührer gelöst. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2, bis Sie eine gesättigte Lösung zu haben. </li></ol> Anmerkung: Die Verwendung einer zu großen Menge des Lösungsmittels oder durch Auflösen der Matrix weit unter dem Siedepunkt der Lösung eine schlechte Ausbeute der Kristalle oder gar keine Kristalle führen. <ol start="5"><li> Lassen Sie die Lösung langsam abkühlen. Sie können es bei Raumtemperatur für mehrere Stunden bei 4 ° C über Nacht verlassen und wieder. Hinweis: Wenn keine Kristalle gebildet werden, kann die Kristallisation durch Kratzen der Innenseite des Bechers (gerade unterhalb der Oberfläche der Lösung) mit einem Glasstab ausgelöst werden. </li><li> Sammle die Matrix Kristalle durch Filtration. </li><li> Mit einem Mindestbetrag von eiskaltem Lösungsmittel Spülen der Kristalle und filtrieren sie. </li><li> Ermöglichen, dass die Kristalle zu trocknen. Sie können Vakuum für diesen Schritt zu verwenden. </li></ol> 3. Reinigung von MALDI Edelstahl Ziel <ol><li> Spülen Sie die MALDI-Platte mit Methanol (MeOH) und wischen Sie vorsichtig mit einem Reinigungstuch speziell für Laboranwendungen (zB Kimwipe) gefertigt. </li><li> Mit H 2 O spülen das Ziel und wischen Sie sie mit einem Reinigungstuch. </li><li> Legen Sie die MALDI-Platte in einem 600 ml-Becherglas und decken Sie es mit 50% EtOH. </li><li> Beschallen das Ziel in der EtOH-Lösung für 10 min in ein Ultraschallbad. </li><li> Wenn es noch Reste auf dem Teller, wiederholen Sie die Schritte 1-4 erneut. </li><li> Schließlich spülen Sie das Ziel mit MeOH (oder mit Wasser, siehe Hinweis unten), kippen sie in einer Weise, die alle die Flüssigkeit auf einem Reinigungstuch gesammelt. Lassen die Ziel trocknen bei Raumtemperatur oder unter Verwendung einer stickstoffGasstrom. </li></ol> Hinweis: Ein ähnliches Verfahren wurde zuvor beschrieben 15. Hinweis: Die für die letzte Spülung der Ziel verwendete Lösungsmittel (MeOH oder Wasser) bestimmt einige Zielfunktionen. Wenn das Ziel mit MeOH gespült, breitet sich die Probe auf der Ziel viel mehr als bei der Verwendung von Wasser. 4. α-CHCA Dünnschicht-Lösung: Vorbereitung und Deposition auf dem MALDI-Target <ol><li> Lösen α-CHCA in Aceton, um eine gesättigte Lösung zu machen. </li><li> Von Hand (ohne Pipette) tauchen Sie ein 10 ul Spitze (zB GELoader Tipp, Eppendorf) in α-CHCA gesättigte Lösung: eine kleine Menge der Lösung wird in der Spitze (aufgrund der Kapillarwirkung) fließen. </li><li> Berühren Sie sehr schnell (dh 1 sec) die MALDI-Target mit Pipettenspitze und die Hinterlegung der α-CHCA Aceton-Lösung auf der MALDI-Target. Dies wird die Matrix dünne Schicht, in der das Protein bildenProbe aufgebracht werden. Versuchen Sie, eine dünne Schicht vor Ort so gering wie möglich zu generieren. </li></ol> Hinweis: Bei der Verwendung von SA als Matrix, bereiten wir eine dünne Schicht mit einer gesättigten Lösung von SA in Aceton. 5. Vorbereitung der Natrix Lösungen: SA, α-CHCA, DHB und CHCA_DHB Mischung 25 <ol><li> Vorbereitung einer 20 mg / ml SA-Lösung in ACN, 0,1% TFA (70:30, v / v). </li><li> Es werden 20 mg / ml α-CHCA Lösung in ACN und 5% Ameisensäure (70:30, v / v) [als &quot;α-CHCA-Lösung&quot; bezeichnet]. </li><li> Vorbereitung einer 20 mg / ml Lösung in DHB ACN und 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) (70:30, v / v) [als &quot;DHB-Lösung&quot; bezeichnet]. </li><li> Mix &quot;α-CHCA Lösung&quot; und &quot;DHB-Lösung&quot; im Verhältnis 1:1 (v / v), um die &quot;CHCA_DHB Lösung&quot; zu erhalten. </li></ol> Hinweis: Man kann &quot;α-CHCA Lösung&quot; und &quot;DHB-Lösung&quot; in unterschiedlichen Verhältnissen zu mischen, bei der Analyse von Proteinen mit einer Masse von weniger als 100 kDa. Für example ein Verhältnis von 40:60 zwischen α-CHCA und DHB (vol / vol) ergibt eine bessere Auflösung, aber weniger Empfindlichkeit (siehe Diskussion). 6. Probenabnahme auf das MALDI-Target <ol><li> Kaution 0,5 ul der Proteinprobe auf der zuvor hergestellten α-CHCA dünne Schicht. Unmittelbar danach werden 0,5 &amp;mgr; l der Matrix-Lösung (dh der SA-Lösung oder die α-CHCA Lösung oder das &quot;CHCA_DHB mix&quot;). Dies bedeutet, Mischen der Probe und der Matrix auf dem Ziel. </li></ol> Hinweis: Die mit der Matrix in einem Verhältnis von 1:1 in der Regel ein mischt die Proteinprobe. Dieses Verhältnis ist entscheidend für die gute Qualität der MALDI-Spektren. Wenn Sie möchten, um verschiedene Probenkonzentrationen zu testen, können Sie die ACN_formic-Lösung (oben beschrieben) verwenden, um die Probe zu verdünnen. Hinweis: Wenn Sie möchten, können Sie die Probe und die Matrix in einem Rohr zu mischen und dann die Hinterlegung der gemischten &quot;sample_matrix Lösungention &quot;auf der dünnen Schicht. Hinweis: Wir empfehlen Ihnen, verschiedene Probenkonzentrationen testen, weil Verdünnen der Probe können Sie die Störung von Schadstoffen zu reduzieren. Um die Probe zu verdünnen, können Sie die ACN_formic-Lösung (oben beschrieben) verwenden, um die Probe zu verdünnen. 7. Calibrant Deposition <ol><li> Kaution 0,5 ul der Kalibrierungsstandard (zB &quot;Protein Standard II&quot;, Bruker Daltonics, Bremen), dann mit 0,5 ul der Matrix-Lösung. </li></ol> Hinweis: Legen Sie das Kalibrierungs auf der MALDI-Platte neben den Probenflecken Protein (siehe Diskussion). 8. MALDI Spectra Erwerb von Calibrant und Protein-Proben Sobald die Proben und die Eich werden getrocknet, können Sie die &quot;Spots&quot; unter dem Mikroskop beobachten. Diese Beobachtung ist optional und kann vor allem interessant sein, Novizen. Um den Probenspektren erwerben, legen the Ziel in der MALDI-TOF-Instruments und der Auswahl der geeigneten Geräteparameter, die für jeden Gerätetyp unterschiedlich sind. Um die am besten geeignete Set-up zu bekommen sollte man die Empfehlungen des Herstellers zu folgen. Als allgemeine Überlegungen bei der Analyse intakter Proteine, sollte man das Gerät im linearen Modus (nicht im Reflektor-Modus, der für Peptide entsprechende Analysen ist) zu verwenden. Normalerweise nutzen wir unser Instrument in Positiv-Ionen-Modus. Darüber hinaus ist ein Schlüsselparameter der &quot;gepulsten Ionenextraktion&quot;, die die instrumentelle Auflösung 31 verbessert. In einfachen Worten kann die &quot;gepulster Ionenextraktion&quot; als eine Pause zwischen der Erzeugung der Probenionen und der Zeit, wenn die Ionen in Richtung auf den Detektor beschleunigt definiert werden. Bei der Analyse intakter Proteine, sollte man verwendet eine &quot;gepulste Ionenextraktion&quot; (zB 500 ns) größer als bei der Beobachtung Peptide (zB 80 ns). Wählen Sie den entsprechenden m / z-Bereich erwerben, die Spektren of das Kalibrierungs, und das Instrument kalibriert. Wenn Sie die Spektren von Ihren Proben zu erwerben, verwenden Sie die entsprechende Laserintensität (siehe Diskussion).

<ol>
	<li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular Crystallography : Principles, Practice, and Application to Structural Biology. , (2010).</li><li>Cohen, S. L., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+as+a+tool+for+protein+crystallography.">Mass spectrometry as a tool for protein crystallography.</a> Annual review of biophysics and biomolecular structure. 30, 67-85 (2001).</li><li>Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry--a+useful+tool+for+the+protein+X-ray+crystallographer+and+NMR+spectroscopist.">Mass spectrometry--a useful tool for the protein X-ray crystallographer and NMR spectroscopist.</a> Structure. 2, 465-467 (1994).</li><li>Gans, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereospecific+isotopic+labeling+of+methyl+groups+for+NMR+spectroscopic+studies+of+high-molecular-weight+proteins.">Stereospecific isotopic labeling of methyl groups for NMR spectroscopic studies of high-molecular-weight proteins.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49, 1958-1962 (2010).</li><li>Wilm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+electrospray+ionization.">Principles of electrospray ionization.</a> Molecular &amp; cellular proteomics : MCP. 10, M111 009407 (2011).</li><li>Urban, P. L., Amantonico, A., Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-a-plate:+extending+the+functionality+of+MALDI-MS+and+LDI-MS+targets.">Lab-on-a-plate: extending the functionality of MALDI-MS and LDI-MS targets.</a> Mass spectrometry reviews. 30, 435-478 (2011).</li><li>De Hoffmann, E., Stroobant, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mass Spectrometry: Principles and Applications. , (2007).</li><li>Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+desorption+ionization+of+proteins+with+molecular+masses+exceeding+10,000+daltons.">Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons.</a> Analytical chemistry. 60, 2299-2301 (1988).</li><li>Spengler, B., Cotter, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry+of+proteins+above+100,000+daltons+by+pulsed+ion+extraction+time-of-flight+analysis.">Ultraviolet laser desorption/ionization mass spectrometry of proteins above 100,000 daltons by pulsed ion extraction time-of-flight analysis.</a> Analytical chemistry. 62, 793-796 (1990).</li><li>Beavis, R. C., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-accuracy+molecular+mass+determination+of+proteins+using+matrix-assisted+laser+desorption+mass+spectrometry.">High-accuracy molecular mass determination of proteins using matrix-assisted laser desorption mass spectrometry.</a> Analytical chemistry. 62, 1836-1840 (1990).</li><li>Hillenkamp, F., Karas, M., Beavis, R. C., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry+of+biopolymers.">Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers.</a> Analytical chemistry. 63, 1193A-1203A (1991).</li><li>Beavis, R. C., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption+ionization+mass-spectrometry+of+proteins.">Matrix-assisted laser desorption ionization mass-spectrometry of proteins.</a> Methods in enzymology. 270, 519-551 (1996).</li><li>Xiang, F., Beavis, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+increase+contaminant+tolerance+in+protein+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+by+the+fabrication+of+thin+protein-doped+polycrystalline+films.">A method to increase contaminant tolerance in protein matrix-assisted laser desorption/ionization by the fabrication of thin protein-doped polycrystalline films.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).</li><li>Cadene, M., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust,+detergent-friendly+method+for+mass+spectrometric+analysis+of+integral+membrane+proteins.">A robust, detergent-friendly method for mass spectrometric analysis of integral membrane proteins.</a> Analytical chemistry. 72, 5655-5658 (2000).</li><li>Fenyo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+sample+preparation:+the+ultra+thin+layer+method.">MALDI sample preparation: the ultra thin layer method.</a> J. Vis. Exp.. (3), e192 (2007).</li><li>Gabant, G., Cadene, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+of+full-length+integral+membrane+proteins+to+define+functionally+relevant+structural+features.">Mass spectrometry of full-length integral membrane proteins to define functionally relevant structural features.</a> Methods. 46, 54-61 (2008).</li><li>Hook, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+range+allosteric+control+of+cytoplasmic+dynein+ATPase+activity+by+the+stalk+and+C-terminal+domains.">Long range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains.</a> The Journal of biological chemistry. 280, 33045-33054 (2005).</li><li>Vorm, O., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+sequence+information+derived+by+partial+acid+hydrolysis+and+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry.">Peptide sequence information derived by partial acid hydrolysis and matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry.</a> Biological mass spectrometry. 23, 734-740 (1994).</li><li>Beavis, R. C., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cinnamic+acid+derivatives+as+matrices+for+ultraviolet+laser+desorption+mass+spectrometry+of+proteins.">Cinnamic acid derivatives as matrices for ultraviolet laser desorption mass spectrometry of proteins.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 3, 432-435 (1989).</li><li>Madler, S., Boeri Erba, ., E, R., Zenobi, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-ToF+Mass+Spectrometry+for+Studying+Noncovalent+Complexes+of+Biomolecules.">MALDI-ToF Mass Spectrometry for Studying Noncovalent Complexes of Biomolecules.</a> Topics in current chemistry. , (2012).</li><li>Wortmann, A., Pimenova, T., Alves, S., Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+first+shot+phenomenon+in+MALDI+mass+spectrometry+of+protein+complexes.">Investigation of the first shot phenomenon in MALDI mass spectrometry of protein complexes.</a> The Analyst. 132, 199-207 (2007).</li><li>Beavis, R. C., Chaudhary, T., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-Cyano-4-hydroxycinnamic+Acid+as+a+Matrix+for+Matrix-assisted+Laser+Desorption+Mass+Spectrometry.">Alpha-Cyano-4-hydroxycinnamic Acid as a Matrix for Matrix-assisted Laser Desorption Mass Spectrometry.</a> Organic Mass Spectrometry. 27, 156-158 (1992).</li><li>Liu, Z., Schey, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+MALDI+TOF-TOF+mass+spectrometer+for+intact+protein+analysis.">Optimization of a MALDI TOF-TOF mass spectrometer for intact protein analysis.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16, 482-490 (2005).</li><li>Gorka, J., Bahr, U., Karas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphite+supported+preparation+(GSP)+of+alpha-cyano-4-hydroxycinnamic+acid+(CHCA)+for+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry+(MALDI-MS)+for+peptides+and+proteins.">Graphite supported preparation (GSP) of alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) for matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS) for peptides and proteins.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23, 1949-1954 (2012).</li><li>Laugesen, S., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+two+matrices+results+in+improved+performance+of+MALDI+MS+for+peptide+mass+mapping+and+protein+analysis.">Combination of two matrices results in improved performance of MALDI MS for peptide mass mapping and protein analysis.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 14, 992-1002 (2003).</li><li>Sparkman, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mass Spectrometry Desk Reference. , (2000).</li><li>Kussmann, M., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+techniques+for+peptides+and+proteins+analyzed+by+MALDI-MS.">Sample preparation techniques for peptides and proteins analyzed by MALDI-MS.</a> Methods Mol Biol. 146, 405-424 (2000).</li><li>Wang, R., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-accuracy+mass+measurement+as+a+tool+for+studying+proteins.">High-accuracy mass measurement as a tool for studying proteins.</a> Current opinion in biotechnology. 5, 77-84 (1994).</li><li>Kirshenbaum, N., Michaelevski, I., Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+large+protein+complexes+by+structural+mass+spectrometry.">Analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry.</a> J. Vis. Exp. (40), e1954 (2010).</li><li>Hernandez, H., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+stoichiometry+and+interactions+of+macromolecular+assemblies+from+mass+spectrometry.">Determining the stoichiometry and interactions of macromolecular assemblies from mass spectrometry.</a> Nature protocols. 2, 715-726 (2007).</li><li>Vestal, M. L., Juhasz, P., Martin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+extraction+matrix-assisted+laser+desorption+time-of-flight+massspectrometry.">Delayed extraction matrix-assisted laser desorption time-of-flight massspectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 9, 1044-1050 (1995).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir präsentierten ein Detail-Protokoll, um qualitativ hochwertige Massenspektren von großen intakten Proteine ​​mit Molekulargewichten von mehr als 100 kDa zu erwerben, mit einem MALDI-TOF-Instrument. Eine Reihe von kritischen Aspekten der Probenvorbereitung sollten sorgfältig, um die Qualität der Massenspektren zu verbessern berücksichtigt werden. Matrizen und Lösungsmittel von hoher Reinheit von entscheidender Bedeutung, weil alle in den Matrizen und Lösungsmitteln vorhandene Verunreinigungen auf der MALDI-Target konzentriert sind nach der Lösungsmittelverdampfung. Um die Reinheit der MALDI-Matrix zu verbessern, ist es möglich, sie zu reinigen, unter Verwendung klassischer Methoden, Umkristallisation (siehe oben). Wir empfehlen auch frisch Herstellung der Matrizen-Lösungen (mindestens einmal pro Woche), um die Matrix zu verbessern Kristallisation und Matrixabbau zu vermeiden. Die Matrixabscheidung Ansatz ist sehr entscheidend für die endgültige Qualität der Spektren. Wie oben beschrieben, ist die Dünnschichtverfahren unserer Methode of Wahl 12. Außerdem optimiert man den Ansatz für die Abscheidung der ersten Schicht. Wenn die Matrix in Aceton gelöst, um eine gesättigte Lösung zu erhalten, kann das Propanon schnelle Verdampfung des Lösungsmittels, sondern macht auch die Größe der ersten Schicht sehr schwierig zu steuern. Wir schlagen vor, mit einem GELoader Spitze so wenig Bürste, die Sie im matrix_acetone Lösung zu tauchen, um ein Mindestvolumen, der Sie schnell auf der Ziel Einzahlung. Die Größe der ersten Schicht irgendwie steuert die endgültige Größe des MALDI Punkt: Ein kleiner Fleck (dh 0,5-0,75 mm Durchmesser) ist bevorzugt, da in diesem Fall die Probenkonzentration höher ist als im Falle eines großen Fleck. Die Erteilung einer kleinen Stelle unterscheidet sich von der ultra-dünnen Schicht Ansatz zuvor in einem Video JOVE 15 vorgeschlagen. In Fenyo et al. Die dünne Schicht Lösung ist in der ganzen MALDI-Target mit der Seite einer Pipettenspitze verteilt. Dieser Ansatz erfordert die Prüfung der dünnen Schicht, die bestimmte Kriterien erfüllen sollte(Z. B. Geschwindigkeit der Lösungsmittelverdampfung). Wenn das Kriterium nicht erfüllt ist, sollte das MALDI-Target gewaschen werden und eine neue dünne Schicht hergestellt werden soll. Das macht die Vorbereitung recht mühsam für einen Anfänger. Darüber hinaus die Abscheidung von Probe / Matrix-Mischung auf der Platte erfordert die Absaugung des überschüssigen Lösungsmittels mit einer Vakuumleitung und einen Waschschritt mit TFA 15 ist erforderlich, so dass die Fenyo et al. Vorbereitung ein bisschen schwieriger als unser Ansatz. Das Volumenverhältnis zwischen der Matrix und der Probe ist sehr wichtig für eine erfolgreiche Analyse von intakten Proteinen durch MALDI-TOF. Nach der Prüfung verschiedener Verhältnisse schlagen wir vor, ein Verhältnis von 1:1 zu verwenden. Eine andere Matrix: Stichprobenanteil könnte die Qualität der Spektren gefährden, wahrscheinlich aufgrund der inhomogenen Kristallisation. Die Reihenfolge, in der Matrix und der Probe abgeschieden ist ebenfalls kritisch. Nach dem Aufbringen der Matrix dünne Schicht wird die Probe aufgebracht und unmittelbar nach (vor dem sample Stelle wird trocken) die CHCA_DHB Mischung zugesetzt. Dieses Verfahren ist als &quot;Sandwich-Verfahren&quot; 27, wobei die Probe allein zwischen zwei Matrixschichten abgelagert definiert. Als Alternative kann die CHCA_DHB Lösung und die Probe in 0,5 ml-Röhrchen gemischt und dann auf der dünnen Schicht 12 CHCA gesichtet. Dies ergibt einen Spot mit einer homogenen Schicht der Kristalle, was zu hohen Qualität Spektren. Bei der Analyse von Proteinen mit einer Masse von weniger als 100 kDa, der Konzentration des DHB kann erhöht werden (zB 60:40 DHB: CHCA), dies kann schärfer Spitzen produzieren, konnte aber die Messempfindlichkeit (dh weniger intensiven Peaks) zu gefährden. Für eine korrekte Gerätekalibrierung, ist es wichtig, die Kalibrierungsstandards sehr nahe an den Probenstellen zu hinterlegen, so dass man eine bessere Massengenauigkeit zu erhalten. Eine &quot;Pseudo-internen Kalibrierungsverfahren&quot; wurde zuvor vorgeschlagen 15: nach dem Erwerb eines Probenspektrum, das Kalibrierungs Stelle is Laserschuss und Signal des Eich werden dem Probenspektrum aufgenommen. Dies ermöglicht Ihnen, intern kalibrieren Probenspektrum mit den Eichspitzen. Die Laserenergie sollte auch sorgfältig während der Spektrenaufnahme gesteuert werden. In den meisten Fällen erhöht die Empfindlichkeit höhere Energie, senkt aber die Auflösung. Wir schlagen vor, mit dem minimal möglichen Laserenergie, ohne die Empfindlichkeit des Erwerbs. Darüber hinaus, um spektrale Qualität zu verbessern, kann man mehr Schüsse auf jede Probe vor Ort zu erwerben. Normalerweise werden die mehr Schüsse, die Sie erwerben (1000-2000 Aufnahmen), desto höher die Intensität des Signals. Beim Auftreffen auf die Stelle mit dem Laser, muss man die richtige Position (dh &quot;sweet spot&quot;) zu finden, da die Probe nicht homogen verteilt. Sie können auf der gleichen Fläche zu schießen, bis das Signal zu, und dann versuchen, einen anderen Bereich mit der Probe zu finden. Abschließend hohen Reinheit von Matrizen und solvEltern, die für die Probe und Matrizen Abscheidung auf der Ziel verwendeten Methoden, die Position der für die Kalibrierung, die Intensität der Laserenergie, die zum Erwerbszeitpunkt (Anzahl der Aufnahmen / Ort) verwendeten Standards sind entscheidende Faktoren, die man berücksichtigen sollte, wenn Analyse von intakten Proteinen durch MALDI-TOF MS. Autor Beiträge LS und EBE entwarf die Experimente durchgeführt, die massenspektrometrische Experimente, die Daten analysiert und schrieb das Manuskript.

Strukturbiologie stützt sich auf die Produktion von qualitativ hochwertigen Proteinen ein und muss daher mit effizienten und zuverlässigen Techniken zur Proteinanalyse 2,3 gekoppelt werden. In unserem Massenspektrometrie (MS) in einem Labor Institut für Strukturbiologie müssen wir Primärsequenz von Proteinen bestätigen, bewerten die Anwesenheit von Mutationen und posttranslationale Modifikationen der Abbau von Proteinen, die Probenhomogenität, und die Qualität der Isotopenmarkierung (zB deuterierte Proteine, die für magnetische Kernresonanzuntersuchungen 4). Da Strukturbiologen verwenden limitierte Proteolyse strukturell starren Domänen aus flexiblen Teilen zu unterscheiden, müssen wir zuverlässig charakterisieren solchen verkürzten Proteinen unter Verwendung von MS. Wenn Biomoleküle durch MS analysiert werden zwei mögliche Ansätze genutzt werden, um so schwere und labile Moleküle ionisieren leise. Elektrospray-Ionisation (ESI) ionisiert Moleküle direkt aus demFlüssigphase 5; Matrix-unterstützte Laser-Desorptions-Ionisierung (MALDI) erfordert, dass die Biomoleküle mit UV-absorbierenden organischen Molekülen (dh Matrixmolekülen) 6 co-kristallisiert. ESI Time-of-Flight (TOF) MS Flüssigchromatographie gekoppelt hat sich zu einem Routineverfahren für die Analyse von intakten Proteinen, weil es Massenbestimmung mit hoher Genauigkeit (≤ 50 ppm). Es ist jedoch ziemlich anfällig für die Zusammensetzung des Probenpuffers (insbesondere Salze und Detergenzien) und Verunreinigungen (z. B. Polymere), die manchmal schwer zu beseitigen, wodurch die Unterdrückung des Analyten Signal. MALDI-TOF-MS stellt eine Alternative zu ESI-MS, da die Leistung weniger von Pufferkomponenten, Waschmittel und Verunreinigungen beeinflußt und können intakte Protein Massenbestimmung mit ausreichender Genauigkeit (≤ 500 ppm) zur Sequenzvalidierung. Nach protein Verdauung kann MALDI-TOF-MS auch verwendet werden, um die erhaltenen Peptide zur weiteren Primärsequenzbestätigung durch das sogenannte &quot;Peptid-Massenfingerprinting&quot; analysieren. In unseren Händen, die Massenbestimmung intakter Proteine, die größer als 100 kDa und heterogene (wegen Änderungen oder Verkürzungen) sind, ist durch MALDI-MS einfacher als durch ESI-MS. Dies ist auf das Fehlen von überlappenden Ladezustand in ESI-Spektren vorhanden Distributionen. Da darüber hinaus die MALDI-Prozess ist nicht abhängig von der Analyt-Größe 7, ein solches Verfahren ergibt eine hohe Empfindlichkeit, wenn ein Biomolekül Masse über 100 kDa. Bemerkenswert Analysen intakter Proteine ​​wurden mit selbstgemachten Instrumenten zwischen dem Ende der 1980er und Anfang der 1990 von 8-11 durchgeführt. MALDI-TOF kann auch als Screening-Werkzeug, um die Qualität der Proteinproben beurteilen verwendet werden, da es weniger Zeit für die Probenvorbereitung und ist weniger anfällig für interferences aufgrund gemeinsamer Verunreinigungen (z. B. Salze). Nach einer ersten, schnellen Auswertung durch MALDI-MS kann eine Probe durch ESI-TOF analysiert, um seine Masse mit höherer Genauigkeit zu bestimmen. Darüber hinaus erzeugt MALDI-Ionen, die weniger Gebühren als ESI und damit den Erwerb und die Interpretation der MALDI-Daten einfacher. Dies ermöglicht es den Studierenden, die in der Strukturbiologie ihre rekombinante Proteine ​​nur nach einem kurzen Training zu analysieren. Zwei wesentliche Faktoren beeinflussen die Qualität der MALDI-Spektren: die Matrix und die Technik für die Abscheidung der Matrix (zB Tröpfchen getrocknet und 8 dünne Schicht 12-16,17,18) verwendet. Eine einzelne organische Matrix [zB Sinapinsäure (SA) 19-21 oder α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure (α-CHCA) 14,22,23] wird oft für die MS Untersuchung von intakten Proteinen und vernetzte Proteinkomplexen . Mit α-CHCA, Chait Gruppe zuvor einen detaillierten Protokoll für preparing eine ultradünne Schicht vor der MALDI-Analyse von löslichen und Membranproteine ​​14,15. Kürzlich Gorka et al. Illustriert die Graphitbasis Zielbeschichtungs die MALDI-Analyse von Peptiden und Proteinen unter Verwendung von α-CHCA als Matrix 24 zu verbessern. Hier stellen wir ein einfaches Protokoll für die Analyse von intakten Proteinen durch MALDI-TOF-MS unter Verwendung einer Mischung von zwei Matrizen: 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB) und α-CHCA 25. Wir systematisch bewertet die Leistung des DHB-CHCA Mischung im Vergleich zu den SA-und α-CHCA Matrizen für die Steuerung von intakten Proteinen. Die Matrix-Gemisch ermöglicht eine bessere Auflösung (dh die Protein-Gipfel sind viel schärfer). Darüber hinaus ist die Präsenz der intensiven mehrere Ladungen Ionen (dh M +2 H 2 +, M 3 H 3 +, etc.) ermöglicht eine genaue Massenbestimmung, weil die Auflösung von axialen MALDI-TOF-Instrumente ist höher bei niedrigeren Massen über Gebühr (m / z) 26. Dies ist besonders nützlich für die Bestimmung des Molekulargewichts von Proteinen, die größer als 100 kDa. Höhere Empfindlichkeit wird auch mit dem DHB-CHCA Gemisch (0,5 pmol Protein auf einem MALDI-Target) erreicht. Wie oben erwähnt, ist ein wichtiger Faktor, der bei der Verwendung von MALDI-Instrument betrachtet werden, falls der Matrixablagerung. Laugesen et al. Vorgeschlagen, die Verwendung von DHB-CHCA Gemisch zum ersten Mal 25 unter Verwendung des getrockneten Niederschlag von Tröpfchen. Wir beobachteten jedoch bessere Ergebnisse (z. B. viel höhere Empfindlichkeit) verwendet, wenn wir das Dünnschichtverfahren, wo die erste Schicht von der α-CHCA in Aceton gelöst ist. Das Dünnschichtverfahren 12,27 impliziert die Bildung eines homogenen Substrat der Matrix-Kristalle auf das MALDI-Target, das in einem Video Jupiter zuvor 15 beschrieben wurde. Dann wird die Probe auf diesem Substrat abgeschieden wird, und schließlichzusätzliche Matrix abgeschieden (siehe unten). In diesem Artikel werden wir auch zeigen, wie die Probe auf das MALDI-Target hinterlegen, sondern auch, wie man das Ziel 15 zu reinigen, umzukristallisieren, und bereiten die Matrizen. Zum Schluss wollen wir alle notwendigen Informationen für die Analyse intakter Proteine ​​an Wissenschaftler (insbesondere Strukturbiologen), die die Qualität der produzierten Proteine ​​auf eine schnelle und einfache Art und Weise zu bewerten, die brauchen und bieten nicht so vertraut mit MALDI-TOF-MS. Wie in Mitte der 1990er Jahre 28 vorhergesagt hat MS eine erhöhte Auswirkungen auf die biologische Forschung hatte, wie die Erreichbarkeit für Biologen hat sich erhöht. Wir hoffen, dass die Informationen, die wir zur Verfügung gestellt wird nützlich MALDI-TOF zugänglich Biologen und Wissenschaftler, die gerne starten mit Hilfe der Massenspektrometrie zu machen.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizima</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin 6 chromatography columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>732-6221</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 500</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0122</td>
			<td>various molecular weight cut off</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>14262</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>02860</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIMTECH SCIENCE Precision Wipes Tissue Wipers</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>05511</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&alpha;-cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8982</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>650501</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,5-dihydroxybenzoic acid</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>39319</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GELoader Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 001.222</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>09676</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>302031</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Standard II</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>207234</td>
			<td>It contains Trypsinogen, Protein A, Serum Albumin-Bovine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunoglobulin G</td>
			<td>ABSciex</td>
			<td>GEN602151</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water purifier PURELAB Ultra Analytic</td>
			<td>ELGA LabWater</td>
			<td>89204-052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoflex MALDI-TOF instrument</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOF target</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (maldi-tof) mass spectrometric analysis of intact proteins larger than 100 kda

Effektiv Bestimmung Massen von Proteinen ist entscheidend für viele biologische Studien (zB für Strukturbiologie Untersuchungen). Genaue Massenbestimmung erlaubt, die Richtigkeit der Proteinprimärsequenzen zu bewerten, die Anwesenheit von Mutationen und / oder post-translationale Modifikationen, die mögliche Proteinabbau, die Probenhomogenität, und das Ausmaß der Isotopen Einbau in Falle der Markierung (z. B. 13 C-Markierung ). Elektrospray-Ionisations (ESI)-Massenspektrometrie (MS) ist weit verbreitet für die Massenbestimmung von denaturierten Proteinen verwendet, aber ihre Wirksamkeit ist von der Zusammensetzung des Probenpuffers beeinflusst. Insbesondere untergräbt die Anwesenheit von Salzen, Detergenzien und Verunreinigungen die Wirksamkeit der Proteinanalyse durch ESI-MS. Matrix-unterstützte Laserdesorption / Ionisation (MALDI) MS ist eine attraktive Alternative, aufgrund seiner Salztoleranz und der Einfachheit der Erfassung und Interpretationtion. Darüber hinaus ist der Massenbestimmung von großen heterogenen Proteinen (größer als 100 kDa) einfacher durch MALDI-MS aufgrund der Abwesenheit von überlappenden hohen Ladezustand Verteilungen in ESI-Spektren vorhanden sind. Hier präsentieren wir Ihnen eine zugängliche Ansatz für die Analyse von Proteinen, die größer als 100 kDa durch MALDI-Flugzeit-(TOF). Wir veranschaulichen die Vorteile der Verwendung einer Mischung von zwei Matrizen (dh 2,5-Dihydroxybenzoesäure und α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure) und die Nützlichkeit der Dünnschicht Verfahren Ansatz zur Probenablagerung. Wir diskutieren auch die kritische Rolle der Matrix und Lösungsmittelreinheit, die für die Kalibrierung verwendeten Standards, der Laserenergie und der Erfassungszeit. Insgesamt bieten wir Ihnen notwendigen Informationen, um einen Neuling für die Analyse intakter Proteine ​​größer als 100 kDa durch MALDI-MS.

Wir untersuchten eine intakte Protein (Chromosomenregion Wartungs 1-Protein, Crm1, Molekulargewicht: 123386 Da) mit zwei unterschiedlichen Matrizen zwei Abscheidungsverfahren, und die gleiche Laserintensität (Abbildung 1). SA und CHCA_DHB Mischung wurden als Matrizen verwendet. Die Mischung ergab Massenspektren von hoher Qualität in Bezug auf Signal-Rausch-Verhältnis und die Empfindlichkeit (Fig. 1A und B). Insbesondere könnte man 0,5 pMol Protein auf das MALDI-Target (Fig. 1C) abgeschieden erfassen. Die gleiche Menge an Protein wurde unter Verwendung von SA kaum nachweisbar (Fig. 1D). Darüber hinaus mit der Matrizen-Mischung, war die Methode der Wahl für die Matrixablagerung der &quot;dünne Schicht&quot;-Ansatz (Abbildung 1A). Mit Hilfe der &quot;Dried Droplet&quot;-Methode, haben wir nicht jedes Protein mit einer Masse von mehr als 100 kDa (Daten nicht gezeigt) zu erkennen. Verwendung der Mischung CHCA_DHB (1A und 1C), mehrfach geladene Ionen des Protein beobachtet, so dass die Massenbestimmung mit höherer Genauigkeit, da die Peak-Auflösung in axialer MALDI-TOF-Instrumenten ist umgekehrt proportional zum m / z 26. Wir analysierten auch monomeren beta-Galactosidase (116.300 Da) (Abbildung 2). Die CHCA_DHB Spektren waren besser als die SA-Spektren in Bezug auf Empfindlichkeit und Auflösung. Darüber hinaus erlaubt das Vorhandensein von mehrfach geladenen Ionen (M 2 +, M 3 + und M 4 +) uns die Masse des Proteins mit einer höheren Genauigkeit (2A und 2C) zu bestätigen. Mit der dünnen Schicht Ansatz, verglichen wir die Performance des CHCA_DHB Mischung, SA und allein α-CHCA für die Analyse von einem Immunglobulin IgG (148.500 Da) (Abbildung 3). Wenn wir die verschiedenen Daten korrelieren, waren Proteinsignale höher und mit besserer Auflösung in der CHCA_DHB Spektren. Abschließend ist die Verwendung der Mischung CHCA_DHB und der Dünnschicht-Abscheidungsverfahren<html> zeigte signifikante Verbesserungen in der Qualität der großen mit einem MALDI-TOF-Instrument erworben intakte Protein-Massenspektren. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50635/50635fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50635/50635fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. MALDI-TOF-Analyse des intakten Chromosomenregion Wartungs 1 Protein (Crm1), Molekulargewicht: 123386 Da. . A) 1 pmol Crm1 wurde mit der DHB_CHCA Mix als Matrix B) analysiert Menge: 1 pmol; Matrix:. SA C) Höhe: 0,5 pmol; Matrix:. DHB_CHCA D) Höhe: 0,5 pmol; Matrix: SA. Das Signal der Peaks, ausgedrückt in einer beliebigen Einheit Intensität Skala ist normiert auf die in jedem Spektrum maximalen Barwert. pg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50635/50635fig2.jpg &quot;/&gt; 2. MALDI-TOF-Analyse von intakten beta-Galactosidase (116.300 Da). A) Betrag: 20 pmol; Matrix DHB_CHCA B) Betrag:. Pmol 20; Matrix:. SA C) Betrag: 5 pmol; Matrix:. DHB_CHCA D) Betrag: 5 pmol; Matrix: SA. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50635/50635fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50635/50635fig3.jpg" /> 3. MALDI-TOF-Analyse einer intakten Immunglobulin IgG (148.500 Da), Menge:. 1,7 pmol mit der Mischung CHCA_DHB Die Spektren erhalten wurden, waren viel intensiver (maximal: 8200 willkürliche Einheit, au) als die SA-Spektren (maximal 1.200 au) und α-CHCA Spektren (maximal: 4500 au)

Watch this Scientific Journal Video about Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa at JoVE.com

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Genaue Massenmessung stellt einen wichtigen Schritt bei der Untersuchung von Proteinen. Matrix-unterstützte Laserdesorption / Ionisation (MALDI) Massenspektrometrie (MS) für eine solche Bestimmung verwendet werden, und deren wesentliche Vorteil ist die Toleranz zu Salzen, Detergenzien und Verunreinigungen. Hier veranschaulichen wir eine zugängliche Ansatz für die Analyse von Proteinen, die größer als 100 kDa durch MALDI-MS.

Matrix-assistierte Laser Desorptions / Ionisations-Flugzeit (MALDI-TOF)-Massenspektrometrie-Analyse von intakten Proteinen mit mehr als 100 kDa

Effectively determining masses of proteins is critical to many biological studies (e.g. for structural biology investigations). Accurate mass ...

matrix-assisted-laser-desorptionionization-time-flight-maldi-tof-mass

Research

JoVE Journal

Chemistry

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

80.1K Aufrufe.  Université J. Fourier.  Genaue Massenmessung stellt einen wichtigen Schritt bei der Untersuchung von Proteinen. Matrix-unterstützte Laserdesorption / Ionisation (MALDI) Massenspektrometrie (MS) für eine solche Bestimmung verwendet werden, und deren wesentliche Vorteil ist die Toleranz zu Salzen, Detergenzien und Verunreinigungen. Hier veranschaulichen wir eine zugängliche Ansatz für die Analyse von Proteinen, die größer als 100 kDa durch MALDI-MS. 

Serie: Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry

The mammalian integument includes sebaceous glands that secrete an oily material onto the skin surface. Sebum production is part of the innate immune system that is protective against pathogenic microbes. Abnormal sebum production and chemical composition are also a clinical symptom of specific skin diseases. Sebum contains a complex mixture of lipids, including triacylglycerides, which is species-specific. The broad chemical properties exhibited by diverse lipid classes hinder the specific determination of sebum composition. Analytical techniques for lipids typically require chemical derivatizations that are labor-intensive and increase sample preparation costs. This paper describes how to extract lipids from mammalian integument, separate broad lipid classes by thin-layer chromatography, and profile the triacylglyceride contents using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. This robust method enables a direct determination of the triacylglyceride profiles among species and individuals, and it can be readily applied to any taxonomic group of mammals.

Mammalian integument contains solvent-extractable lipids that can provide chemical compositions characteristic of individual species. This paper presents a routine method for separating broad lipid classes isolated from integumentary tissues using thin layer chromatography and determining the triacylglyceride profile by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.

Profilierung der Triacylglycerid Inhalt in Bat Integumentary Lipide durch präparative Dünnschicht-Chromatographie und MALDI-TOF-Massenspektrometrie

The mammalian integument includes sebaceous glands that secrete an oily material onto the skin surface. Sebum production is part of the innate immune ...

Forschung

Chemie

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for characterizing lyophilized formulations of protein therapeutics. Labeling followed by suitable proteolytic digestion allows the protein structure and interactions to be mapped with peptide-level resolution. Since the protein structural elements are stabilized by a network of chemical bonds from the main-chains and side-chains of amino acids, specific labeling of atoms in the amino acid residues provides insight into the structure and conformation of the protein. In contrast to routine methods used to study proteins in lyophilized solids (e.g., FTIR), ssHDX-MS and ssPL-MS provide quantitative and site-specific information. The extent of deuterium incorporation and kinetic parameters can be related to rapidly and slowly exchanging amide pools (Nfast, Nslow) and directly reflects the degree of protein folding and structure in lyophilized formulations. Stable photolytic labeling does not undergo back-exchange, an advantage over ssHDX-MS. Here, we provide detailed protocols for both ssHDX-MS and ssPL-MS, using myoglobin (Mb) as a model protein in lyophilized formulations containing either trehalose or sorbitol.

Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design.

Massenspektrometrische Ansätze zur Proteinstruktur und Wechselwirkungen zu untersuchen in lyophilisierte Pulver

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental exposure in a non-invasive manner. In this work, we present a protocol to characterize the exhaled VOCs in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry (Sec-nanoESI-HRMS). The homemade Sec-nanoESI source was readily set up based on a commercial nanoESI source. Hundreds of peaks were observed in the background-subtracted mass spectra of exhaled breath, and the mass accuracy values are -4.0-13.5 ppm and -20.3-1.3 ppm in the positive and negative ion detection modes, respectively. The peaks were assigned with accurate elemental composition according to the accurate mass and isotopic pattern. Less than 30 s is used for one exhalation measurement, and it takes approximately 7 min for six replicated measurements.

A protocol for characterizing chemical composition of exhaled breath in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry is demonstrated.

Echtzeit-Atem-Analyse mithilfe von sekundären Nanoelectrospray Ionisation mit hochauflösenden Massenspektrometrie gekoppelt

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometry

There are many techniques that can be employed in the characterization of synthetic homopolymers, but few provide as useful of information for end group analysis as matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). This tutorial demonstrates methods for optimization of the sample preparation, spectral acquisition, and data analysis of synthetic polymers using MALDI-TOF MS. Critical parameters during sample preparation include the selection of the matrix, identification of an appropriate cationization salt, and tuning the relative proportions of the matrix, cation, and analyte. The acquisition parameters, such as mode (linear or reflector), polarization (positive or negative), acceleration voltage, and delay time, are also important. Given some knowledge of the chemistry involved to synthesize the polymer and optimizing both the data acquisition parameters and the sample preparation conditions, spectra should be obtained with sufficient resolution and mass accuracy to enable the unambiguous determination of the end groups of most homopolymers (masses below 10,000) in addition to the repeat unit mass and the overall molecular weight distribution. Though demonstrated on a limited set of polymers, these general techniques are applicable to a much wider range of synthetic polymers for determining mass distributions, though end group determination is only possible for homopolymers with narrow dispersity.

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometry

A protocol for the matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) characterization of synthetic polymers is described including the optimization of sample preparation, spectral acquisition, and data analysis.

Charakterisierung von synthetischen Polymeren Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation Zeit der Massenspektrometrie Flug (MALDI-TOF)

There are many techniques that can be employed in the characterization of synthetic homopolymers, but few provide as useful of information for end group ...

An Efficient Sample Preparation Method to Enhance Carbohydrate Ion Signals in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry

Sample preparation is a critical process in mass spectrometry (MS) analysis of carbohydrates. Although matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) MS is the method of choice in carbohydrate analysis, poor ion signal and data reproducibility of carbohydrate samples continue to be severe problems. For quantitative analysis of carbohydrates, an effective analytical protocol providing superior data quality is necessary. This video demonstrates sample preparation protocols to improve signal intensity and minimize data variation of carbohydrates in MALDI-MS. After drying and crystallization of sample droplets, the crystal morphology is reformed by methanol before mass spectrometric analysis. The enhancement in carbohydrate signal is examined with MALDI imaging mass spectrometry (IMS). Experimental results show that crystal reformation adjusts crystalline structures and redistributes carbohydrate analytes. In comparison with the dried droplet preparation method in conventional MALDI-MS, reforming carbohydrate crystal morphologies with methanol shows significantly better signal intensity, ion image distribution, and data stability. Since the protocols demonstrated herein do not involve changes in sample composition, they are generally applicable to various carbohydrates and matrixes.

A protocol for enhancing carbohydrate ion signals in MALDI mass spectrometry by reforming crystalline structures during sample preparation processes is demonstrated.

Eine effiziente Vorbereitung Beispielmethode Kohlenhydrat Ionen-Signale in der Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung Massenspektrometrie verbessern

Sample preparation is a critical process in mass spectrometry (MS) analysis of carbohydrates. Although matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) ...

Imaging Corrosion at the Metal-Paint Interface Using Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS), illustrating that SIMS is a suitable technique to study the chemical distribution at a metal-paint interface. The painted Al alloy coupons are immersed in a salt solution or exposed to air only. SIMS provides chemical mapping and 2D molecular imaging of the interface, allowing direct visualization of the morphology of the corrosion products formed at the metal-paint interface and mapping of the chemical after corrosion occurs. The experimental procedure of this method is presented to provide technical details to facilitate similar research and highlight pitfalls that may be encountered during such experiments.

Time-of-flight secondary ion mass spectrometry is applied to demonstrate the chemical mapping and corrosion morphology at the metal-paint interface of an aluminum alloy after being exposed to a salt solution compared with a specimen exposed to air.

Bildkorrosion an der Metal-Paint-Schnittstelle mit zeitweiliger Ionenmassenspektrometrie

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass ...

Analysis of Complex Molecules and Their Reactions on Surfaces by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry

Desorption/Ionization Induced by Neutral SO2 Clusters (DINeC) is employed as a very soft and efficient desorption/ionization technique for mass spectrometry (MS) of complex molecules and their reactions on surfaces. DINeC is based on a beam of SO2 clusters impacting on the sample surface at low cluster energy. During cluster-surface impact, some of the surface molecules are desorbed and ionized via dissolvation in the impacting cluster; as a result of this dissolvation-mediated desorption mechanism, low cluster energy is sufficient and the desorption process is extremely soft. Both surface adsorbates and molecules of which the surface is composed of can be analyzed. Clear and fragmentation-free spectra from complex molecules such as peptides and proteins are obtained. DINeC does not require any special sample preparation, in particular no matrix has to be applied. The method yields quantitative information on the composition of the samples; molecules at a surface coverage as low as 0.1 % of a monolayer can be detected. Surface reactions such as H/D exchange or thermal decomposition can be observed in real-time and the kinetics of the reactions can be deduced. Using a pulsed nozzle for cluster beam generation, DINeC can be efficiently combined with ion trap mass spectrometry. The matrix-free and soft nature of the DINeC process in combination with the MSn capabilities of the ion trap allows for very detailed and unambiguous analysis of the chemical composition of complex organic samples and organic adsorbates on surfaces.

Neutral SO2 clusters of low kinetic energy (&#60; 0.8 eV/constituent) are used to desorb complex surface molecules such as peptides or lipids for further analysis by means of mass spectrometry using an ion trap mass spectrometer. No special sample preparation is required, and real-time observation of reactions is possible.

Analyse komplexer Moleküle und ihrer Reaktionen auf Oberflächen mittels Cluster-induzierter Desorption/Ionisationsmassspektrometrie

Desorption/Ionization Induced by Neutral SO2 Clusters (DINeC) is employed as a very soft and efficient desorption/ionization technique for mass ...

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain using antibiotic induction, and identified by MALDI-TOF-TOF tandem mass spectrometry and top-down proteomic analysis with software developed in-house. The immunity protein of colicin E3 (Im3) and the immunity protein of bacteriocin (Im-Bac) were identified from prominent b- and/or y-type fragment ions generated by the polypeptide backbone cleavage (PBC) on the C-terminal side of aspartic acid, glutamic acid, and asparagine residues by the aspartic acid effect fragmentation mechanism. The software rapidly scans in silico protein sequences derived from the whole genome sequencing of the bacterial strain. The software also iteratively removes amino acid residues of a protein sequence in the event that the mature protein sequence is truncated. A single protein sequence possessed mass and fragment ions consistent with those detected for each immunity protein. The candidate sequence was then manually inspected to confirm that all detected fragment ions could be assigned. The N-terminal methionine of Im3 was post-translationally removed, whereas Im-Bac had the complete sequence. In addition, we found that only two or three non-complementary fragment ions formed by PBC are necessary to identify the correct protein sequence. Finally, a promoter (SOS box) was identified upstream of the antibacterial and immunity genes in a plasmid genome of the bacterial strain.

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

Here we present a protocol for the rapid identification of proteins produced by genomically sequenced pathogenic bacteria using MALDI-TOF-TOF tandem mass spectrometry and top-down proteomic analysis with software developed in-house. Metastable protein ions fragment because of the aspartic acid effect and this specificity is exploited for protein identification.

Identifizierung antibakterieller Immunitätsproteine in Escherichia coli mittels MALDI-TOF-TOF-MS/MS und Top-Down-Proteomanalyse

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain ...

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of protein therapeutics and the determination of the conformational transition pathways critical for biological functions, ranging from molecular recognition to enzymatic catalysis. Hydrogen/deuterium exchange (HDX) reaction coupled with top-down mass spectrometric (MS) analysis provides a means to characterize protein higher-order structures and dynamics in a conformer-specific manner. The conformational resolving power of this technique is highly dependent on the efficiencies of separating protein states at the intact protein level and minimizing the residual non-deuterated protic content during the HDX reactions. 
Here we describe a capillary electrophoresis (CE)-based variant of the HDX MS approach that aims to improve the conformational resolution. In this approach, proteins undergo HDX reactions while migrating through a deuterated background electrolyte solution (BGE) during the capillary electrophoretic separation. Different protein states or proteoforms that coexist in solution can be efficiently separated based on their differing charge-to-size ratios. The difference in electrophoretic mobility between proteins and protic solvent molecules minimizes the residual non-deuterated solvent, resulting in a nearly complete deuterating environment during the HDX process. The flow-through microvial CE-MS interface allows efficient electrospray ionization of the eluted protein species following a rapid mixing with the quenching and denaturing modifier solution at the outlet of the sprayer. The online top-down MS analysis measures the global deuteration level of the eluted intact protein species, and subsequently, the deuteration of their gas-phase fragments. This paper demonstrates this approach in differential HDX for systems, including the natural protein variants coexisting in milk.

Presented here is a protocol for a capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange (HDX) approach coupled with top-down mass spectrometry. This approach characterizes the difference in higher-order structures between different protein species, including proteins in different states and different proteoforms, by conducting concurrent differential HDX and electrophoretic separation.

Kapillarelektrophorese-basierter Wasserstoff/Deuterium-Austausch zur Konformationscharakterisierung von Proteinen mit Top-down-Massenspektrometrie

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus

Neuropeptides are signaling molecules that regulate almost all physiological and behavioral processes, such as development, reproduction, food intake, and response to external stressors. Yet, the biochemical mechanisms and full complement of neuropeptides and their functional roles remain poorly understood. Characterization of these endogenous peptides is hindered by the immense diversity within this class of signaling molecules. Additionally, neuropeptides are bioactive at concentrations 100x - 1000x lower than that of neurotransmitters and are prone to enzymatic degradation after synaptic release. Mass spectrometry (MS) is a highly sensitive analytical tool that can identify, quantify, and localize analytes without comprehensive a priori knowledge. It is well-suited for globally profiling neuropeptides and aiding in the discovery of novel peptides. Due to the low abundance and high chemical diversity of this class of peptides, several sample preparation methods, MS acquisition parameters, and data analysis strategies have been adapted from proteomics techniques to allow optimal neuropeptide characterization. Here, methods are described for isolating neuropeptides from complex biological tissues for sequence characterization, quantitation, and localization using liquid chromatography (LC)-MS and matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)-MS. A protocol for preparing a neuropeptide database from the blue crab, Callinectes sapidus, an organism without comprehensive genomic information, is included. These workflows can be adapted to study other classes of endogenous peptides in different species using a variety of instruments.

Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus

Mass spectrometric characterization of neuropeptides provides sequence, quantitation, and localization information. This optimized workflow is not only useful for neuropeptide studies, but also other endogenous peptides. The protocols provided here describe sample preparation, MS acquisition, MS analysis, and database generation of neuropeptides using LC-ESI-MS, MALDI-MS spotting, and MALDI-MS imaging.

Facettenreiche massenspektrometrische Untersuchung von Neuropeptiden in Callinectes sapidus

Neuropeptides are signaling molecules that regulate almost all physiological and behavioral processes, such as development, reproduction, food intake, and ...