Die Autoren möchten Genome Kanada und Genome British Columbia Plattform für Finanzierung und Unterstützung danken. Wir danken auch Dr. Carol E. Parker für kritische Durchsicht des Manuskripts und Bearbeitung Unterstützung. CHL auch dank der British Columbia Proteomics Netzwerk für die Unterstützung.

1. Tissue Schnitte <ol><li> Blitz Einfrieren der Proben Frage nach der Ernte, mit flüssigem Stickstoff, versenden sie auf Trockeneis (wenn Versandkosten anfallen), und speichern Sie sie bei -80 ° C, bis die Gewebe Schnitte. (Wenn kommerzielle Proben verwendet werden, sicherzustellen, daß die Proben in dieser Weise hergestellt.) </li><li> Schneiden Organe auf eine überschaubare Größe, die MALDI-Target passen. Schneiden Sie unerwünschte Teile der Orgel. Aus diesem hier beschriebenen Studie wurden Kälberlinsen mit einer zuvor beschriebenen Verfahren 35 vor Gewebeschneide decapsulated. </li><li> Entfernen ganze Organe aus dem -80 ° C Gefrierschrank und fixieren sie auf einer kryogenen Gewebeschneiden Bühne. Um einen Kälberlinse beheben, legen Sie einen oder zwei Tropfen Wasser auf das Gewebe Senkungsstufe eines Kryostaten. Schnell stellen die Linse im Wasser, bevor es erstarrt. Alternativ kann eine optimale Schnitttemperatur (OCT)-Verbindungen auch verwendet, um ein Gewebe auf den Schneid Bühne fixieren. Wenn Oktober Verbindungen verwendet werden, ein Mini-Fehlmenge von OCT angewandt werden und darauf zu achten, dass die geschnittenen Gewebeabschnitte nicht OCT-Verbindungen, die mit Ionisation und Detektion der Analyten stören können 5,36,37 kontaminiert werden. </li><li> Damit die Temperatur im Inneren des Kryostaten auf -18 ° C äquilibriert Wärmer oder kälter Temperaturen können für weichere oder härtere Gewebe verwendet werden, beziehungsweise. Dann schneiden Sie das Gewebe äquatorial in 20 um dicke Scheiben schneiden. Verwenden Sie 10-15 um dicke Scheiben für die meisten Gewebe, aber wegen der fragilen Natur der Rinderlinsengewebe wurden 20 um dicke Scheiben eingesetzt. Für Rinderlinsengewebe, entsorgen Sie die erste Gewebeschnitten und nur Scheiben, die in der Nähe oder an der Äquatorialebene sind. </li><li> Wenn eine Augenlinse Gewebe abgebildet wird, verwenden 1,5 ul Ameisensäure (98% Reinheit, LC-MS-Klasse), um die Oberfläche einer Indium-Zinn-Oxid (ITO) beschichteten Glasträger vorbefeuchtet. </li><li> Die Gewebeschnitte auf der Oberfläche der ITO-co vorsichtig übertragenATED Glasobjektträger im Inneren des Kryostaten. Der Gewebeschnitt wird schnell auftauen und wird fest befestigt, um die Gleitfläche zu werden. Normalerweise können mehrere Gewebeabschnitte auf derselben ITO-beschichtete Objektträger auf diese Weise befestigt werden. </li><li> Lyophilisieren die Folie für 15 Minuten vor der MALDI-Matrix-Anwendung. </li><li> Für Matrix-Tests, lösen die einzelnen Matrizen in geeigneten Lösungsmitteln. Manuell vor Ort 1 ul jeder Matrix-Lösung auf den Gewebeschnitt. Darüber hinaus, vor Ort eine kleine Moleküle Kalibrierungsstandard auf das Gewebe für die Überprüfung der MALDI-Empfindlichkeit. </li><li> Three Lehre Markierungen auf der ITO-beschichteten Glasobjektträger, indem er auf der nicht leitenden Oberfläche der ITO-beschichteten Glasobjektträger mit einem Korrekturfluid-Stift. Nehmen Sie ein optisches Bild des Gewebes Folie mit einem Flachbettscanner und speichern Sie sie in einem geeigneten Format wie TIFF oder JPG. </li></ol> 2. Matrixbeschichtungs 2.1. Automated Coating Matrix <ol><li> ApLagenmatrixlösungen, die Acetonitril oder gemischten Acetonitril / Wasser als Lösungsmittel enthalten, automatisch an den Oberflächen der Gewebeabschnitte mit einem Bruker ImagePrep oder eine ähnliche elektronische Matrix Spritzen. </li><li> Abdeckung der Kanten der vorderen Oberfläche des ITO-beschichteten Glasobjektträger mit Band so, dass die Matrix nicht bedeckt die Ränder der Folie. Dies stellt sicher, dass die Lehre Markierungen auf der gegenüberliegenden Oberfläche für Gewebe Schieber Ausrichtung verwendet werden. Decken Sie die Ränder der Folie mit der Matrix, wie sie als Kontaktstellen verwendet werden, um die elektrische Leitfähigkeit der ITO-beschichtete Folie erhalten. </li><li> Coat Glasrutsche, indem zwanzig Zyklen der Matrixbeschichtung (2-sec-Spray, 30-sec Inkubation und 60-sec Trockenzeit pro Zyklus). </li></ol> 2.2. Manuelle Matrix-Beschichtung <ol><li> Werden organische Lösungsmittel (z. B. Chloroform und Ethylacetat), die mit den Herstellungsmaterialien der elektronischen Matrixspritzen unvereinbar sind Erforrot, mit einem pneumatisch unterstützten Airbrush-Spritzgerät, um die Matrix anzuwenden. In die vorbereitete Matrix-Lösung auf den Lösungsmittelbehälter der Airbrush-Pistole und eine milde Strömung von Druckstickstoffgas auf der Haupt Spray. </li><li> Abdeckung der Kanten der vorderen Oberfläche der ITO-beschichteten Glasobjektträger mit Band so, dass die Matrix nicht bedeckt die Ränder der Folie. Dies stellt sicher, dass die Lehre Markierungen auf der gegenüberliegenden Oberfläche für Gewebe Schieber Ausrichtung verwendet werden. Decken Sie die Ränder der Folie mit der Matrix, wie sie als Kontaktstellen verwendet werden, um die elektrische Leitfähigkeit der ITO-beschichtete Folie erhalten. </li><li> Nach stabil und feinen Sprays eingehalten worden, manuell sprühen die Matrix, so dass es völlig Mäntel die Gewebeschnitt. Den minimalen Menge erforderlich, um gerade die Oberfläche zu benetzen, um während jedes Zyklus möglich Analyten Delokalisierung verhindern Matrixlösung. Im Allgemeinen verwenden ungefähr 10 Zyklen der Matrix zu beschichten, Spray ein Gewebeschnitt, die Anzahl der Zyklen istabhängig vom Gewebetyp und Matrixzusammensetzung. </li></ol> 3. MALDI-MS <ol><li> Bereiten Sie eine Massenkalibrierungslösung durch Verdünnen der &quot;ES-Tuning Mix&quot; Standardlösung mit einem Faktor von 1:200 in 60:40 Isopropanol: Wasser (mit 0,1% Ameisensäure in der fertigen Mischung). </li><li> Einführen 2 ul / min des verdünnten &quot;ES Tuning Mix&quot;-Lösung in die Dual-Mode-Elektrospray-Ionisation (ESI) / MALDI-Ionenquelle auf der FTICR-Massenspektrometer vom ESI Seite. </li><li> Bedienung des FTICR Instrument im Positiv-Ionen-ESI-Modus, mit Breitband-Erkennung und eine Datenerfassungsgröße von 1,024 kb / sec. Typische Parameter sind ESI Elektrospray-Kapillare Spannung 3.900 V; sprühen Schild Spannung 3.600 V; Vernebler Gas (N 2) Fluss, 2 L / min; Trockengas (N 2) Durchfluss und Temperatur, 4 L / min und 200 ° C; Skimmer-1-Spannung, 15 V; Flugzeit (TOF), 0,009 sec; Kollisionsgas (Ar) fließen, 0,4 l / s, Quelle Ionenakkumulation Zeit 0,1 sec;und Kollisionszelle Ionenakkumulationszeit 0,2 sek. Stimmen Sie die FTICR Betriebsparameter, um die analytische Sensitivität über den Massenbereich von m / z 200 auf 1.400 steigern und gleichzeitig gute Zeit-Domain kostenlos-Induktionszerfall (FID)-Signale. Typischerweise sind die ICR Betriebsparameter Kumpel Spannung, 8 V; Sidekick-Offset-Spannung, 8 V; Anregung Verstärkung von 10; Anregungspulszeit, 0,01 bis 0,015 sec; Frontplatte Falle Spannung, 1,5 V; zurück Falle Plattenspannung, 1,6 V und Analysator Eingangsspannung, -4 V. Nach einer Reihe von FTICR Betriebsparameter bestimmt worden ist, erwerben die ESI-Massenspektren und kalibrieren Sie das Gerät unter Verwendung der Bezugsmassen der Standardverbindungen in der &quot;ES-Tuning Mix&quot;-Lösung. </li><li> Stimmen des Instruments für die MALDI-Betrieb löst mehrere 1 ul Aliquots eines gemischten Terfenadin und Reserpin-Standardlösung in der Matrix-Lösung bei einer Konzentration von 1 &amp;mgr; M von jedem, und erkennen diese Lösungen direkt auf eine der tissue Abschnitte (dh ein Test Gewebeschnitt), die auf einer ITO-beschichteten Objektträger montiert worden ist. Legen Sie die ITO-beschichtete Folie in ein Gewebe Schiebeadapter (dh eine spezielle MALDI-Target) und laden Sie den Adapter aus der MALDI-Seite in die Dual-ESI / MALDI-Ionenquelle. Optimierung der geeigneten MALDI Betriebsparameter der Laserleistung und der Anzahl der Laserschüsse für MALDI-Signal Akkumulation für jeden Massenscan usw. MALDI Typische Betriebsparameter sind: Laserschüsse, 50 und eine MALDI-Platte Spannung von 300 V. </li><li> Nach dem Tuning, Kalibrierung und Optimierung der Instrument für die MALDI-MSI-Experimente, richten Sie den physischen Standort von einem Gewebeschnitt mit seinen aufgezeichneten optischen Bild innerhalb der Imaging-Software abgebildet werden. Mit den drei &quot;Korrektur-Fluid&quot; Marken, die vorher auf der gegenüberliegenden Seite der ITO-beschichteten Gleitfläche (Schritt 1.9) gesetzt worden war, für diese Ausrichtung unter Verwendung eines Dreipunkt-Triangulationsverfahren. </li><li> Führen Sie eine gleichzeitige ESI und MALDI Betrieb, so dass jede Massenspektrum enthält die Referenzmasse Gipfel der &quot;ES Tuning Mix&quot;-Lösung für Post-Akquisition-interne Massenkalibrierung. Dies wird in der genauesten Massenmessung während der MALDI-MS führen. Um dies zu tun, zuerst der ESI-Signal abzuschwächen durch die Verringerung der Kapillare Spannung, bis die MALDI-Signale dominieren die Spektren während die ESI Eichsignale sind immer noch hoch genug für interne Massenkalibrierung. </li><li> Danach können Sie einen automatisierten Rasterverfahren für Laserbestrahlung. Die Gewebebereiche definieren, die abgebildet werden, und legen Sie die entsprechende Laserrasterschrittweite. Beachten Sie, dass kleinere Rasterschrittweiten bieten eine höhere Auflösung Gewebebilder, erfordern aber eine deutlich längere Massenspektrenerfassung Zeit und mehr Datenspeicherplatz. Die Anzahl der Bildpunkte ist abhängig von der Laserrasterschrittgröße einzurichten und das Gewebe Größe. Für ein typisches Rinderlinse, die eine 1 cm 2-Gewebegröße hat, wird ein Gewebebild typischerweise von ca. zusammensetzt. </em&gt; 5.000 Pixel, wenn ein Laserrasterschrittweite von 200 um auf einer FT-ICR Instrument eingesetzt. Verwenden Sie ein &quot;random-Spot&quot;-Analyse, wie dies verhindert, dass Standort-basierte Verzerrung durch allmähliche Signaldämpfung während des Experiments. </li></ol> 4. Datenanalyse <ol><li> Kalibrieren Sie den MALDI-Massenspektren mit interner Kalibrierung für den ersten Vergleich und Spitzen für MS / MS zu wählen. De-Isotop und wählen Sie die monoisotopischen Spitzen, wie zuvor beschrieben, mit Hilfe einer angepassten VBA-Skript 38. </li><li> Exportieren Sie die resultierende monoisotopischen Peaklisten und Eingabe die gemessenen m / z-Werte in die METLIN 39 und / oder 40 HMDB Metabolom-Datenbanken für Massenabgleich mit den Bibliothekseinträgen. Betrachten Sie die (M + H) +, (M + Na) + und (M + K) +-Ionen während der Datenbank-Suche, mit einem zulässigen Massenfehler von ± 1 ppm. </li><li> Generieren MALDI Bilder für alle der über die gesamte Gewebeschnitt mit imag erkannt Lipid UnternehmenE-Analyse-Software, mit einem Massenfilter Breite von 1 ppm an der Peakspitze. </li><li> Sobald Bilder wurden für alle m / z-Werte, die Datenbank-Einträge entsprechen generiert wurde, erzeugen Bilder für alle anderen Spitzen als auch für einzigartige Verteilungsmuster, die später untersucht werden können suchen. </li></ol> 5. Bestätigung der Identitäten der abgebildeten Lipide <ol><li> Bestätigen Sie die Identität der Hoch Fülle Lipide, die charakteristische Fragment-Ionen, die mit Hilfe der FT-ICR Gerät (zB 184,073 für Phospholipide) festgestellt werden können, durch MALDI-MS/MS haben. Führen MALDI-MS/MS mit stoßinduzierte Dissoziation (CID) direkt auf das Gewebe. </li><li> Für die Lipidarten, die nicht direkt von MALDI-MS/MS bestätigt werden können, verwenden Sie eine UPLC System zu einem q-TOF-Massenspektrometer 34 gekoppelt. <ol><li> Manuell sezieren Aliquots enthaltend ~ 10 mg Gewebe aus dem Bereich, in dem die Spezies von Interesse lokalisiert wurde. Legen Sie diese Gewebe Aliquots in 2ml-Zentrifugenröhrchen. </li><li> Homogenisieren jedes Gewebe Aliquot in 250 ul Wasser, mit einer Schwingmühle mit zwei 5-mm-Edelstahlmetallkugeln. </li><li> 1 ml Chloroform-Methanol-Lösung (1:3, v / v), und die Wirbelrohre. Als nächstes zentrifugieren Verwendung einer Mikrozentrifuge bei 12.000 × g für 10 min. </li><li> Sammeln Sie die Überstände und trocknen Sie sie in einer Drehzahl-Vakuum-Konzentrator. </li><li> Lösen Sie die Rückstände in 100 ul 30:70 Isopropanol: Wasser. Speisen Sie einen 10-ul-Aliquot auf die UPLC-Säule für die Trennung mittels Gradientenelution. </li><li> Verwenden Sie die chromatographischen Bedingungen für Online-Lipid LC-MS/MS, die bisher 34 erschienen sind. </li><li> Generieren Sie extrahierten Ionenstrom (XIC) Chromatogramme mit den theoretischen m / z-Werte, mit einem Fenster von ± 50 ppm um den theoretischen Massen. </li><li> Wenn authentischen Verbindungen für die Lipide sind, entsprechen den Retentionszeiten der authentischen Verbindungen mit denen der entsprechendenchenden XIC Spitzen aus den Gewebeproben. Wenn die Verbindungen die gleichen sind, sollten die Retentionszeiten und die MS / MS-Spektren überein. </li></ol></li><li> Wenn eine authentische Verbindung nicht verfügbar ist, verwenden Sie den Fragmentierungsmuster der detektierten Lipid einen Standard MS / MS-Spektrum aus einer Metabolom Datenbank wie METLIN oder HMDB entsprechen. Verwenden de novo spektrale Massen Interpretation, um eine mögliche Struktur für die Lipid bestimmen. </li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Die wichtigsten Überlegungen für eine erfolgreiche MALDI MSI sind: 1) Gewebepräparation, 2)-Matrix Wahl, 3)-Matrix-Anwendung, und 4) die Interpretation der Daten und Analysen. Wenn die Probe und die Matrix in geeigneter Weise hergestellt wurde, wird die MS-Datenerfassung automatisiert. Die Analyse der Daten aus dieser Art von Test ist sehr arbeitsintensiv. Entsprechende Gewebeaufbereitung ist entscheidend für eine erfolgreiche MALDI MSI Experimenten. Die Quelle des Gewebes und die Handha...

Massenspektrometrie-Bildgebung (MSI) ist ein Analyseverfahren zur Bestimmung der räumlichen Lokalisierung und Verteilung der Verbindungen auf der Oberfläche eines Gewebeschnitts 1,2. Matrix Assisted Laser Desorption / Ionisation (MALDI) MSI für die Analyse von Peptiden und Proteinen ist seit über zehn Jahren verwendet worden und es wurden große Fortschritte bei Verfahren zur Probenvorbereitung, Nachweisempfindlichkeit, räumliche Auflösung, Reproduzierbarkeit und Datenverarbeitung 3,4. Durch die Kombination von Informationen aus histologisch gefärbten Schnitten und MSI Experimente sind Pathologen in der Lage, die Verteilungen von spezifischen Verbindungen mit pathophysiologisch interessanten Features 5 korrelieren. Die Verteilungsmuster von kleinen Molekülen, einschließlich 6,7 exogene Drogen und deren Metaboliten 8-10 wurden auch durch MALDI-MS Tissue Imaging 11 verhört worden. Lipide sind vielleicht die am weitesten untersuchten class von Verbindungen mit MALDI-Bildgebung sowohl in den 12-17 MS und MS / MS-18-Modus. Die Verwendung von MALDI MSI für kleine Molekül Bildgebung durch mehrere Faktoren begrenzt: 1) MALDI-Matrizes sind selbst kleine Moleküle (typischerweise m / z &lt;500), die reichlich Ionensignale zu erzeugen. Diese reichlich Signale der Ionisation von niedermolekularen Analyten zu unterdrücken und stören ihre Detektion 19,20. Lösemittelfreie Matrix-Beschichtung 21, Matrix Sublimation 22 und Matrix schwemmt MALDI-MS-23, unter anderem, wurden entwickelt, um MSI kleiner Moleküle zu verbessern. New Matrizen, die die Analyse von Low-MW-Verbindungen verbessern können, sind von großem Interesse in kleinen Molekülen MSI. Diese Matrizen erhöht Analyten Signale mit verminderter Matrix Signale zu liefern. Im positiven Ionenmodus, 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB) und α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure (CHCA) sind die beiden häufigsten verwendeten MALDI MS Matrizen für MSI 24 </sup&gt;. Die ideale Matrix würde kleine Kristalle bilden, um so die räumliche Lokalisierung der Analyten zu erhalten. DHB eher größere Kristalle zu bilden, damit die Anwendung der Matrix mittels Sublimation wurde entwickelt, um dieses Problem teilweise zu lösen, und hat die Verwendung dieser Matrix für empfindliche Abbildungs ​​von Phospholipiden 22,25 erlaubt. 9-Aminoacridin für MSI protischer Analyten in der Positiv-Ionen-Modus 26 und für Nucleotide und Phospholipiden im Negativionen-Modus 26-29 verwendet. 2-Mercaptobenzothiazol ist gefunden worden, um eine effiziente Detektion von Lipiden MALDI 30 zu geben, und ist für die Abbildung des Gehirns der Maus 31 Ganglioside verwendet. Die Ultrahochauflösung von Fourier-Transformations-Ionen-Zyklotron-Resonanz (FT-ICR)-Massenspektrometer kann etwas Linderung dieses Problems durch die Lösung Signale von Analyt-Matrix-Signale 32 auf. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von FT-ICR-MS, dass die Intensitäten der metastabilen Matrix Cluster ReduktionED-33, das ebenfalls eine Verringerung dieser Störungen 27. Die Verwendung von Dithranol (DT, 1,8-Dihydroxy-9 ,10-dihydroanthracen-9-on) als ein MALDI-Matrix für die Gewebeabbildung zuvor berichtet worden 34. In dieser aktuellen Arbeit wird ein detailliertes Protokoll für die Verwendung von DT für das MSI von endogenen Lipiden auf den Oberflächen der Rinderlinse Gewebeabschnitte versehen ist, in dem Positiv-Ionen-Modus.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Liver</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>56023-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Calf Lens</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>57114-2</td>
			<td>Sample should be decapsulated29 before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithranol (DT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10608</td>
			<td>MALDI Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Cyano-4-hydroxy-cinnamic Acid (CHCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70990</td>
			<td>MALDI Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,5-Dihydroxybenzoic Acid (DHB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85707</td>
			<td>MALDI Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reserpine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terfenadine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid (TFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>302031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>39253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>366927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td></td>
			<td>95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES Tuning Mix</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2431A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITO Coated Glass Slides</td>
			<td>Hudson Surface Technology</td>
			<td>PSI1207000</td>
			<td>Ensure that samples are placed on the electrically conductive side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wite-Out Shake-N-Squeeze Correction Pen</td>
			<td>Bic</td>
			<td>WOSQP11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airbrush Sprayer</td>
			<td>Iwata</td>
			<td>Eclipse HP-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImagePrep</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>249500-LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI adapter</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>235380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dithranol as a matrix for matrix assisted laser desorption/ionization imaging on a fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometer

Massenspektrometrie-Bildgebung (MSI) bestimmt die räumliche Lokalisierung und Verteilung der Verbindungen auf der Oberfläche eines Gewebeschnittes, vor allem unter Verwendung von MALDI (Matrix-unterstützte Laserdesorption / Ionisation)-basierten analytischen Techniken. Neue Matrizen für niedermolekulare MSI, was die Analyse von niedrigem Molekulargewicht (MW)-Verbindungen verbessern können, sind erforderlich. Diese Matrizen erhöht Analyten Signale liefern, während abnehm MALDI Hintergrundsignale. Darüber hinaus ist die Verwendung von ultrahochauflösenden Instrumente, wie Fourier-Transformations-Ionenzyklotronresonanz (FT-ICR)-Massenspektrometer, hat die Fähigkeit, Signale von Analyten Matrixsignale beheben, und dies kann teilweise viele Probleme mit dem Hintergrund der MALDI Ursprung überwinden Matrix. Die Verringerung der Intensitäten der metastabilen Matrix-Clustern durch FT-ICR MS kann auch helfen, einige der Interferenzen mit Matrixspitzen auf andere Instrumente zu überwinden. Hochauflösendesind Instrumente wie die FT-ICR-Massenspektrometer vorteilhaft, da sie Verteilungsmuster von vielen Verbindungen gleichzeitig herstellen kann, während immer noch Vertrauen in chemische Identifikationen. Dithranol (DT, 1,8-Dihydroxy-9 ,10-dihydroanthracen-9-on) wurde zuvor als ein MALDI-Matrix für die Gewebeabbildung gemeldet. In dieser Arbeit wurde ein Protokoll für die Verwendung von DT für MALDI-Imaging von endogenen Lipiden aus den Oberflächen von Säugergewebeschnitte, von Positiv-Ionen-MALDI-MS auf einem ultrahochauflösenden Hybrid-Quadrupol-FTICR Instrument bereitgestellt wurde.

<html> Gewebeproben, die geschnitten werden und Tauwetter montiert auf die ITO-beschichtete Glasobjektträger sollte intakt sein, ohne sichtbare Reißen. Für viele Gewebe, ist die direkte Montage auf Tauwetter Gewebe einer ITO-beschichteten Objektträger akzeptabel. Für einige spezifische Gewebe, wie Rinder Linse, umfangreiche Reißen des Gewebes oft gesehen, wenn eine direkte Tauwetter Montage verwendet wird (Abbildung 1a). Vorbeschichtung der ITO-Glasobjektträger mit Ethanol oder Ameisensäure <stro...

Watch this Scientific Journal Video about Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer at JoVE.com

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Dithranol (DT, 1,8-Dihydroxy-9 ,10-dihydroanthracen-9-on) wurde zuvor als ein MALDI-Matrix für die Gewebeabbildung für kleine Moleküle berichtet wurde, Protokolle für die Verwendung von DT für die MALDI-Imaging von endogenen Lipiden auf die Hier werden Oberflächen von Gewebeschnitten von Positiv-Ionen-MALDI-MS auf einem ultrahochauflösenden Quadrupol-FTICR Instrument zur Verfügung gestellt.

Dithranol als Matrix für Matrix Assisted Laser Desorption / Ionisation Imaging auf einem Fourier-Transformations-Ionen-Zyklotron-Resonanz-Massenspektrometer

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

dithranol-as-matrix-for-matrix-assisted-laser-desorptionionization

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K Aufrufe.  University of Victoria.  Dithranol (DT, 1,8-Dihydroxy-9 ,10-dihydroanthracen-9-on) wurde zuvor als ein MALDI-Matrix für die Gewebeabbildung für kleine Moleküle berichtet wurde, Protokolle für die Verwendung von DT für die MALDI-Imaging von endogenen Lipiden auf die Hier werden Oberflächen von Gewebeschnitten von Positiv-Ionen-MALDI-MS auf einem ultrahochauflösenden Quadrupol-FTICR Instrument zur Verfügung gestellt. 

Serie: Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI-Probenvorbereitung: Die Ultra Thin-Layer-Methode

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Forschung

Biologie

Quantifying Mixing using Magnetic Resonance Imaging

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture. This work involves mixing two viscous liquid streams using an in-line static mixer. The mixer is a split-and-recombine design that employs shear and extensional flow to increase the interfacial contact between the components. A prototype split-and-recombine (SAR) mixer was constructed by aligning a series of thin laser-cut Poly (methyl methacrylate) (PMMA) plates held in place in a PVC pipe. Mixing in this device is illustrated in the photograph in Fig. 1. Red dye was added to a portion of the test fluid and used as the minor component being mixed into the major (undyed) component. At the inlet of the mixer, the injected layer of tracer fluid is split into two layers as it flows through the mixing section. On each subsequent mixing section, the number of horizontal layers is duplicated. Ultimately, the single stream of dye is uniformly dispersed throughout the cross section of the device.
 Using a non-Newtonian test fluid of 0.2% Carbopol and a doped tracer fluid of similar composition, mixing in the unit is visualized using magnetic resonance imaging (MRI). MRI is a very powerful experimental probe of molecular chemical and physical environment as well as sample structure on the length scales from microns to centimeters. This sensitivity has resulted in broad application of these techniques to characterize physical, chemical and/or biological properties of materials ranging from humans to foods to porous media 1, 2. The equipment and conditions used here are suitable for imaging liquids containing substantial amounts of NMR mobile 1H such as ordinary water and organic liquids including oils. Traditionally MRI has utilized super conducting magnets which are not suitable for industrial environments and not portable within a laboratory (Fig. 2). Recent advances in magnet technology have permitted the construction of large volume industrially compatible magnets suitable for imaging process flows. Here, MRI provides spatially resolved component concentrations at different axial locations during the mixing process. This work documents real-time mixing of highly viscous fluids via distributive mixing with an application to personal care products.

Magnetic resonance imaging (MRI) provides a powerful tool to evaluate the effectiveness of process equipment during operation. We discuss the use of MRI to visualize mixing in a static mixer. The application is relevant to personal care products, but can be applied to a broad range of food, chemical, biomass and biological fluids.

Quantifizierung Mixing mit Magnetic Resonance Imaging

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture.  This work involves mixing two viscous liquid streams using an ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

Quantitative Messung der Invadopodia-vermittelte extrazellulären Matrix Proteolyse in Einzel-und Multizelluläre Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added to random screens. By increasing the likelihood that crystals will grow in the metastable zone of a protein's phase diagram, extra crystallization leads are often obtained, the quality of crystals produced may be increased, and a good supply of crystals for data collection and soaking experiments is provided. Here we describe a general method for rMMS that may be applied to either sitting drop or hanging drop vapor diffusion experiments, established either by hand or using liquid handling robotics, in 96-well or 24-well tray format.

Here we describe a general method for random microseed matrix screening. This technique is shown to significantly increase the success rate of protein crystallization screening experiments, reduce the need for optimization, and provide a reliable supply of crystals for data collection and ligand-soaking experiments.

Verbesserung der Erfolgsrate der Proteinkristallisation nach Zufall Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

Anreicherung von extrazellulären Matrixproteinen aus Gewebe und Verdauung in Peptide für Massenspektrometrie-Analyse

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

Lasergestützte Mikrodissektion (LAM) als Werkzeug für die Transkriptionsprofilierung einzelner Zelltypen

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become available for biologists. These systems are primarily designed for multi-channel two-photon fluorescence microscopy. However, without any modification, complementary non-linear optical microscopy such as second-harmonic generation (SHG) or third harmonic generation (THG) can also be performed with this set-up, allowing label-free imaging of structured molecules or aqueous medium-lipid interfaces. These techniques are well suited for in-vivo observation, but are limited in chemical specificity. Chemically selective imaging can be obtained from inherent vibration signals based on Raman scattering. Confocal Raman microscopy provides 3D spatial resolution, but it requires high average power and long acquisition time. To overcome these difficulties, recent advances in laser technology have permitted the development of nonlinear optical vibrational microscopy, in particular coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS). CARS microscopy has therefore emerged as a powerful tool for biological and live cell imaging, by chemically mapping lipids (via C-H stretch vibration), water (via O-H stretch vibrations), proteins or DNA. In this work, we describe the implementation of the CARS technique on a standard OPO-coupled multiphoton laser scanning microscope. It is based on the in-time synchronization of the two laser lines by adjusting the length of one of the laser beam path. We present a step-by-step implementation of this technique on an existing multiphoton system. A basic background in experimental optics is helpful and the presented system does not require expensive supplementary equipment. We also illustrate CARS imaging obtained on myelin sheaths of sciatic nerve of rodent, and we show that this imaging can be performed simultaneously with other nonlinear optical imaging, such as standard two-photon fluorescence technique and second-harmonic generation.

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering CARS System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy based on inherent vibration of molecule bonds permits label-free chemically selective live cell imaging. This work presents the implementation of a complementary microscopy technique on a standard multiphoton laser scanning microscope based on a femtosecond Ti:sapphire laser and an OPO laser.

Umsetzung einer kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS)-System auf einem Ti: Saphir und OPO-Laser-basierte Standard-Laser-Scanning-Mikroskop

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

This protocol describes a signal-to-noise ratio (SNR) calibration and sample preparation method for solenoidal microcoils combined with biological samples, designed for high-resolution magnetic resonance imaging (MRI), also referred to as MR microscopy (MRM). It may be used at pre-clinical MRI spectrometers, demonstrated on Medicago truncatula root samples. Microcoils increase sensitivity by matching the size of the RF resonator to the size of the sample of interest, thereby enabling higher image resolutions in a given data acquisition time. Due to the relatively simple design, solenoidal microcoils are straightforward and cheap to construct and can be easily adapted to the sample requirements. Systematically, we explain how to calibrate new or home-built microcoils, using a reference solution. The calibration steps include: pulse power determination using a nutation curve; estimation of RF-field homogeneity; and calculating a volume-normalized signal-to-noise ratio (SNR) using standard pulse sequences. Important steps in sample preparation for small biological samples are discussed, as well as possible mitigating factors such as magnetic susceptibility differences. The applications of an optimized solenoid coil are demonstrated by high-resolution (13 x 13 x 13 &#956;m3, 2.2 pL) 3D imaging of a root sample.

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

A protocol to study biological tissue at high spatial resolution using ultra-high field magnetic resonance microscopy (MRM) using microcoils is presented. Step-by-step instructions are provided for characterizing the microcoils. Finally, optimization of imaging is demonstrated on plant roots.

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage demonstriert auf Medicago-Truncatula-Wurzeln bei 22 T

This protocol describes a signal-to-noise ratio (SNR) calibration and sample preparation method for solenoidal microcoils combined with biological ...

Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. These sensitivity gains increase as temperatures decrease and are large enough to enable the study of molecules at very low concentrations at the operating temperatures (~100 K) of most commercial DNP-equipped NMR spectrometers. This leads to the possibility of in-cell structural biology on cryopreserved cells for macromolecules at their endogenous levels in their native environments. However, the freezing rates required for cellular cryopreservation are exceeded during typical sample handling for DNP MAS NMR and this results in loss of cellular integrity and viability. This article describes a detailed protocol for the preparation and cryogenic transfer of a frozen sample of mammalian cells into a MAS NMR spectrometer.

Presented here is a protocol for cryogenic transfer of frozen samples into the dynamic nuclear polarization (DNP) magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) probe. The protocol includes directions for rotor storage prior to the experiment and directions for viability measurements before and after the experiment.

Kryogene Probenladung in ein magisches Winkel-Spinning-Kernspinresonanzspektrometer, das die Zelllebensfähigkeit bewahrt

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. ...

Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging

Lipid profiling, or lipidomics, is a well-established technique used to study the entire lipid content of a cell or tissue. Information acquired from&#160;lipidomics is valuable in studying the pathways involved in development, disease, and cellular metabolism. Many tools and instrumentations have aided lipidomics projects, most notably various combinations of mass spectrometry and liquid chromatography techniques. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has recently emerged as a powerful imaging technique that complements conventional approaches. This novel technique provides unique information on the spatial distribution of lipids within tissue compartments, which was previously unattainable without the use of excessive modifications. The sample preparation of the MALDI MSI approach is critical and, therefore, is the focus of this paper. This paper presents a rapid lipid analysis of a large number of Drosophila brains embedded in optimal cutting temperature compound (OCT) to provide a detailed protocol for the preparation of small tissues for lipid analysis or metabolite and small molecule analysis through MALDI MSI.

Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging

The aim of this protocol is to provide detailed guidance on the proper sample preparation for lipid and metabolite analysis in small tissues, such as the Drosophila brain, using matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry imaging.

Probenvorbereitung für die schnelle Lipidanalyse im Drosophila-Gehirn mittels matrixgestützter Laserdesorption/Ionisations-Massenspektrometrie-Bildgebung