Die Autoren bedanken sich bei Michael Goldberg zur Herstellung von stabilisierten siRNA-Lösung und Heather Tobin für ihre Unterstützung bei den Tieren bedanken. Diese Studie wurde von DOD Innovator Award W81XWH-08-1 bis 0659 um DEI finanziert. Die Postdoc-Ausbildung von SK wurde von der Susan G Komen Stiftung (KG101329) unterstützt. Die Autoren bedanken sich bei Kristin Johnson für die Vorbereitung der schematische danken.

1. Vorbereitung der Injektionslösung <ol><li> Planen 0,2% Evans-Blau-Farbstoff in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) oder eine andere wässrige Lösung von Interesse. Diese Vitalfarbstoff ist nützlich für die Beurteilung des Erfolgs der intraduktalen Injektionen und wird als Visualisierungshilfe empfohlen, bei der Entwicklung von Know-how in der Technik. </li></ol> Das erforderliche Volumen hängt von der Anzahl und Lage der Drüsen zu injizierenden abhängen. Alle 10 Brustdrüsen weiblicher Mäuse injiziert werden kann, aber aufgrund der geringeren Größe der Kabelverschraubung sind Drüsenpaare 1 und 5 in der Regel mit 10 ul Lösung injiziert. Alle anderen Milchpaare werden mit 20 &amp;mgr; l injiziert. Diese Mengen reichen aus, um den gesamten duktalen Baum zu füllen. 2. Die präoperative Vorbereitung <ol><li> Nehmen Sie das Körpergewicht von jeder Maus. Wie bei allen präklinischen Studien sollten Tiergewichte regelmäßig überwacht werden (zweimal pro Woche oder länger), um mögliche Toxizität zu beurteilen. </li><li> Anesthetize die mouse mit einem Isofluran Kammer und gelten Auge Schmiermittel. Während des Verfahrens Mäusen wird weiterhin mit eingeatmeten Konzentration von 2-4% Isofluran in Sauerstoff über eine Nasenkegel betäubt werden. Die Maus für Änderungen der Atemfrequenz sorgfältig zu überwachen, die Anpassung der Höhe der Isofluran entsprechend. </li><li> Injizieren Meloxicam (5-10 mg / kg) subkutan vor dem Verfahren, wie Analgesie. </li><li> Tragen Sie eine Over-the-counter-Haarentfernung Creme auf die Brustwarze. Warten Sie 5 min und entfernen sanft lose Haare mit einem Baumwoll-Spitze-Applikator mit kreisenden Bewegungen. Entfernen Sie die Creme mit feuchten Papiertüchern mit warmem Wasser benetzt. Rasur aufgrund der Gefahr einer Beschädigung der Brustwarzen empfohlen. </li><li> Sichern Sie die Maus unter dem Stereoskop durch leichtes Abklebewerkzeugs die Extremitäten. </li><li> Saubere Injektionsstelle bei Alkoholtupfer. </li></ol> 3. Intraduktale Injektion <ol><li> Suchen Sie geeignete Brustwarzen unter dem Stereoskop eingespritzt werden. Verwenden feinen Mikro Sezieren tweezers, jede tote Haut, die die Brustwarze Öffnung abdeckt entfernen. </li><li> Last 10-20 ul Injektionslösung in einen 50 ul-Spritze mit einer 33 G Nadel Metall Nabe befestigt. Manchmal ist nach der Injektion kleiner Mengen (1 ul oder weniger) kann der Nippel beim Herausziehen der Nadel auslaufen. Daher ist es empfehlenswert, 11 oder 21 &amp;mgr; l Injektion jeweils für den möglichen Verlust zu berücksichtigen. </li><li> Halten Sie die Brustwarze sanft mit den feinen Pinzette und leicht anheben, um sie für die Injektion zu positionieren. Es ist nicht notwendig, den Nippel zu schneiden. </li><li> Injizieren Sie die Lösung langsam, um mögliche Schäden durch sich schnell bewegende Flüssigkeit in den duktalen Lumen zu minimieren. Die Einspritzgeschwindigkeit sollte bei etwa 40 ul / min gehalten werden. </li></ol> 4. Postoperative Behandlung <ol><li> Beachten Sie die Injektionsstelle. Es sollte keine Anzeichen von Trauma an der Brustwarze umgebenden Bereich oder Gewebe sein. Schwellung im Bereich um die Brustwarze zeigt wahrscheinlich eine Brustfettpolster Injektion Rather als eine erfolgreiche intraduktale Injektion. </li><li> Nehmen Sie das Tier von der Nase Kegel-und an einem separaten Käfig für die Verwertung. Setzen Sie den Käfig unter einer Wärmelampe zu Unterkühlung zu verhindern, und helfen bei der Wiederherstellung. Mäuse werden einzeln untergebracht und wird eng überwacht werden, bis sie das Bewusstsein und die Mobilität wieder zu erlangen. </li></ol> 5. Analyse von Brustdrüsengewebe <ol><li> Nach Abschluss der Untersuchung werden die Mäuse durch zervikale Dislokation nach CO 2-Druckgas in einer Isolationskammer getötet. Milchdrüsen sind ausgeschnitten und können für ganze Berg Vorbereitung 11, Histologie, oder RNA-und Proteinisolierung verwendet werden. </li></ol>

<ol>
	<li>Dooley, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+lavage+for+detection+of+cellular+atypia+in+women+at+high+risk+for+breast+cancer.">Ductal lavage for detection of cellular atypia in women at high risk for breast cancer.</a> J Natl Cancer Inst. 93, 1624-1632 (2001).</li><li>Jacobs, L., Sukumar, S., Stearns, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraductal+therapy+for+the+prevention+of+breast+cancer.">Intraductal therapy for the prevention of breast cancer.</a> Curr Opin Investig Drugs. 11, 646-652 (2011).</li><li>King, B. L., Love, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intraductal+approach+to+the+breast:+raison+d'etre.">The intraductal approach to the breast: raison d'etre.</a> Breast Cancer Res. 8, 206 (2006).</li><li>Murata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+access+for+prevention+and+therapy+of+mammary+tumors.">Ductal access for prevention and therapy of mammary tumors.</a> Cancer Res. 66, 638-645 (2006).</li><li>Stearns, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+and+clinical+evaluation+of+intraductally+administered+agents+in+early+breast+cancer.">Preclinical and clinical evaluation of intraductally administered agents in early breast cancer.</a> Sci Transl Med. 3, 106ra108 (2011).</li><li>Flanagan, M., Love, S., Hwang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Status+of+Intraductal+Therapy+for+Ductal+Carcinoma+in+Situ.">Status of Intraductal Therapy for Ductal Carcinoma in Situ.</a> Curr Breast Cancer Rep. 2, 75-82 (2010).</li><li>Nguyen, D. -. A., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C., Ip, M. M., Asch, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in mammary gland biology and breast cancer research. , 259-270 (2000).</li><li>Behbod, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intraductal+human-in-mouse+transplantation+model+mimics+the+subtypes+of+ductal+carcinoma+in+situ.">An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ.</a> Breast Cancer Res. 11, R66 (2009).</li><li>Bu, W., Xin, L., Toneff, M., Li, L., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+vectors+for+stably+introducing+genes+into+mammary+epithelial+cells+in+vivo.">Lentivirus vectors for stably introducing genes into mammary epithelial cells in vivo.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14, 401-404 (2009).</li><li>Reddy, J. P., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RCAS-TVA+system+for+introduction+of+oncogenes+into+selected+somatic+mammary+epithelial+cells+in+vivo.">The RCAS-TVA system for introduction of oncogenes into selected somatic mammary epithelial cells in vivo.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14, 405-409 (2009).</li><li>Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+mammary+gland+development+and+function+in+mouse+models.">Evaluation of mammary gland development and function in mouse models.</a> J. Vis. Exp. , e2828 (2011).</li></ol>

Die Autoren haben keine finanziellen Angaben.

Transgene und Knockout-Mäuse sind wertvolle Werkzeuge für die Untersuchung der in vivo-Rolle der einzelnen Gene bei Brustkrebs. Es ist jedoch kostspielig und zeitaufwendig, diese Tiere zu erzeugen, und das Gen Zuschlags gewöhnlich überall die manchmal schließt uns Erkennen der spezifischen Wirkung des Gens auf die Brustdrüse. Daher wäre eine gezielte Zuschlags Probleme der unspezifischen Nebenwirkungen und Toxizitäten in anderen Organen zu verringern. Die intraduktale Injektion von siRNA hier vorge ermöglicht die lokalisierte Gen-Knockdown in der Maus Brustdrüse. Es ist eine schnelle Methode für eine gezielte und lokale Arzneimittelabgabe an der Brustdrüse nicht siRNA begrenzt. Solch eine Brustdrüse spezifische Arzneimittelabgabe vermeidet unspezifische Nebenwirkungen und Toxizität für andere Organe und ermöglicht die Untersuchung von Gen-Veränderungen zu bestimmten Zeitpunkten während der Entwicklung der Brustdrüse und Brusttumorbildung. Es gibt keine Beweise für siRNA-Partikel in nicht-injizierten Drüsen, der Leber oder anderen Organen ein weiterer Beweis, dass dieses Verfahren stellt eine bevorzugte Weise zur lokalisierten Gens Zuschlag in der Brustdrüse. Darüber hinaus können die intraduktalen Injektionen pro Woche oder alle zwei Wochen über mehrere Monate wiederholt werden, um langfristige Überwachung von therapeutischen Wirkstoffen ermöglichen. Diese Technik eröffnet die Möglichkeit zur Untersuchung der intraductal Lieferung verschiedener Reagenzien auf die Maus-Brustkanälen. Fortschritte in der lokalisierte Abgabe in gut charakterisierten Mausmodellen sollte die Anwendung der nicht-invasiven beschleunigen, gezielte Therapiestrategien beim Menschen.

Die Maus-Brustdrüse eines komplexen duktalen-alveoläre Struktur, die in einen zentralen Kanal an der Brustwarze konvergiert besteht. Bei Mäusen als auch Menschen, die Mehrheit von Brusttumoren entstehen in den Epithelzellen der Milchgänge. Aktuell verfügbare Behandlungen gehören intravenöse Chemotherapie, Bestrahlung und Operation. Lokalisierte intraduktalen Behandlungen erforscht worden 1-3 und bieten erhebliche Vorteile in Bezug auf reduzierte Toxizität und Nebenwirkungen. Allerdings bleiben einige Herausforderungen bevor diese weiter verbreitet angewandt werden. Die Fähigkeit, vergleichbare Verfahren in der Brustdrüse der Maus ausführen erleichtert die Charakterisierung von intraduktalen Interventionen. Hier präsentieren wir eine nicht-invasive Methode für die Lieferung von Reagenzien direkt in die Maus-Brustkanal. Intraduktales Lieferung von Chemotherapeutika in beiden Brustkrebspatienten und Mausmodellen wurde zuvor gezeigt, als hoch wirksam ohne Anzeichen vonsystemische Toxizität oder langfristige histopathologischen Veränderungen 6.3. Außerdem Tumorzellinjektion und Lentivirusvektor Lieferung von Onkogenen sind gezeigt worden, zuvor möglich sein über intraduktale Injektion 10.07. Neben der Medikamentenabgabe, ist diese Vorgehensweise sinnvoll für lokale Schweigen der Brustdrüse Gene durch intraduktale Injektion von siRNA. Injektion kleiner Mengen von siRNA-Lösung wirksam ist, ohne die Anatomie und Physiologie der Milchdrüse. In unserem Labor haben wir vor kurzem erfolgreich Silencing Schlüsselvermittler Genen in transgenen Mäusen, die spontan resultierenden Brusttumoren in der Prävention von Tumorprogression (Brock et al., Unveröffentlicht) gezeigt. Wir waren in der Lage, alle zwei Wochen Injektionen in die gleiche Nippel bis zu 7 mal in 2-wöchigen Intervallen ohne sichtbare Gewebeschädigung oder toxische Wirkungen zu wiederholen. Intraduktale Injektionen können in einer erwachsenen Maus, um Ent-Adresse zeitgesteuert werdenrelevant Entwicklung der Brustdrüse opmentally spezifische Ereignisse während der Schwangerschaft, Stillzeit und Rückbildung oder späteren Stadien während der Tumorentstehung und Progression Ziel. Virgin Frauen so jung wie Alter von 8 Wochen haben nicht-invasiv in unserem Labor injiziert.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>2-4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meloxicam</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>5-10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans blue dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E2129-10G</td>
			<td>0.2% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hair removing cream</td>
			<td>Veet</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Choose sensitive option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi DV4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro-dissecting tweezers</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>rs-4976</td>
			<td>With a 0.10 x 0.06 mm tip made of dumostar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7637-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33-gauge needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td>point style 4, 12 degree bevel (standard)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siGLO cyclophilin B control siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>D-001610-01-05</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland

Hier beschreiben wir ein Protokoll, um verschiedene Reagenzien zu der Brustdrüse der Maus über intraduktalen Injektionen zu liefern. Lokalisierten Arzneimittelabgabe und Knock-down von Genen innerhalb der Brust Epithel war schwierig, aufgrund des Fehlens geeigneter Targeting-Moleküle, die unabhängig von Entwicklungsstufen wie Schwangerschaft und Stillzeit zu erzielen. Hier beschreiben wir eine Technik für die lokale Verabreichung von Reagenzien an der Brustdrüse bei über intraduktale Injektion in die Brustwarzen von Mäusen jeder Phase im Erwachsenenalter. Die Injektionen können auf lebende Mäuse unter Anästhesie durchgeführt werden, und damit für eine nicht-invasive und lokalisierte Arzneimittelabgabe auf die Brustdrüse. Ferner können die Injektionen über mehrere Monate ohne Beschädigung der Brustwarze wiederholt. Vital-Farbstoffe, wie Evans Blue sind sehr hilfreich, um die Technik zu lernen. Nach intraductal Injektion des blauen Farbstoffs wird das gesamte Milchgangbaum für das Auge sichtbar. Weiterhin fluoreszierend markierten Reagenzien ermöglichen auchVisualisierung und Verteilung in der Brustdrüse. Diese Technik ist für eine Vielzahl von Verbindungen, einschließlich siRNA, chemotherapeutische Mittel und kleine Moleküle anpassbar.

Die Brustwarzen kann leicht mit einem Stereomikroskop einmal Haare in der Umgebung ist (Abbildung 1A) entfernt lokalisiert werden. Um die Injektionstechnik zu beherrschen, ist es empfehlenswert, Evans blauen Farbstoff zu injizieren und zu überwachen, die Integrität der Drüse (1B und C). Dieser Ansatz ermöglicht auch die Bestimmung der angemessenen Mengen in jeder Drüse injiziert als eine visuell beurteilt, ob der Farbstoff die gesamte Milchgangsystem (1C und 2A) erreicht werden. Ein Bild des injizierten Evans-Blau Bild kann dann auf die gesamte montierte Brustdrüse, bei dem die gesamte Milchgang Baum wird mit Alaun Karmin-Farbstoff (2B) gefärbt verglichen werden. Bitte beachten Sie, dass die Robustheit dieses Injektionsverfahren ist stark abhängig von der Bedienungsperson. Zum Beispiel wird das Perforieren des Kanals in einer Brustfettpolster Injektion führen und Injizieren der Lösung zu schnell kann das duktale Epithel cel beschädigenls und provozieren eine entzündliche Reaktion. Erfolgreiche intraductal Injektion ermöglicht die lokalisierte Arzneimittelabgabe an die Brustdrüse und vermindert unspezifische Nebenwirkungen oft nicht anders festgestellt. Ein Beispiel einer Bildführung mit fluoreszierend markierten injiziert siRNA Targeting Cyclophilin (ein nicht-essentielles Gen) ist in Abbildung 3 dargestellt. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50692/50692fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Ein Leistenbrustdrüse injiziert durch den Nippel mit Evans-Blau-Farbstoff. A) Aussehen der Brustwarze vor Injektion und B) nach der Injektion von 20 &amp;mgr; l Evans-Blau-Farbstoff. Kein Quellen oder Gewebeschäden. C) Beim Öffnen der Haut beobachtet, erlaubt der Farbstoff Visualisierung des gesamten Brust duktalen Baum. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/50692/50692fig2.jpg" /> 2. Whole-mount Analyse von Evans-Blau-inzogen Drüse. A) Repräsentative Bild einer seziert Drüse aus dem Tier herausgeschnitten und auf einen Objektträger unmittelbar nach der Injektion. B) insgesamt Mount-Färbung der gleichen Verschraubung mit Farbstoff Karmin nach Fett ausgebreitet hatte geräumt. Der Vergleich mit A) bestätigt, dass die injizierten Lösung füllt den Brust duktalen Baum und die Drüse ist anatomisch intakt. <img alt="Fig. 3" src="/files/ftp_upload/50692/50692fig3.jpg" /> 3. Intraduktale Lieferung von fluoreszierenden siRNA. Vertreter Bild der frischen Gewebeprobe herausgeschnitten 48 Stunden nach der Injektion.

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Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Ein Protokoll für die nicht-invasive intraductal Lieferung von wässrigen Reagenzien zu der Brustdrüse der Maus beschrieben. Die Methode nutzt lokalisierte Injektion in den Brustwarzen der Brustdrüsen Targeting Milchgänge speziell. Diese Technik ist für eine Vielzahl von Verbindungen, einschließlich siRNA, chemotherapeutischen Mitteln und kleinen Molekülen anpaßbar.

Intraduktale Injection für Lokalisierte Drug Delivery auf die Maus Milchdrüse

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

34.6K Aufrufe.  Boston Children's Hospital and Harvard Medical School.  Ein Protokoll für die nicht-invasive intraductal Lieferung von wässrigen Reagenzien zu der Brustdrüse der Maus beschrieben. Die Methode nutzt lokalisierte Injektion in den Brustwarzen der Brustdrüsen Targeting Milchgänge speziell. Diese Technik ist für eine Vielzahl von Verbindungen, einschließlich siRNA, chemotherapeutischen Mitteln und kleinen Molekülen anpaßbar. 

Serie: Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

Maus Brustepithelzellen Form Mammospheres Während lactogenic Differenzierung

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Forschung

Biologie

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland undergoes extensive modeling and re-modeling, alter susceptibility to carcinogen-induced mammary tumors. Similar findings have been described in humans: for example, high birthweight increases later risk of developing breast cancer, and dietary intake of soy during childhood decreases breast cancer risk. It is thought that these prenatal and postnatal dietary modifications induce persistent morphological changes in the mammary gland that in turn modify breast cancer risk later in life. These morphological changes likely reflect epigenetic modifications, such as changes in DNA methylation, histones and miRNA expression that then affect gene transcription . In this article we describe how changes in mammary gland morphology can predict mammary cancer risk in rats. Our protocol specifically describes how to dissect and remove the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology according to three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use the data to predict risk of developing mammary cancer.

Our protocol describes how to dissect the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology using three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use these results to predict mammary cancer risk in rats which were exposed to dietary modifications in utero or during prepuberty.

Änderungen der Brustdrüsen Morphologie und Breast Cancer Risk in Ratten

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

Evaluation der Brustdrüse Entwicklung und Funktion in Mausmodellen

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once the pre-cursor round cell begins to elongate and differentiate into what is morphologically recognized as a spermatozoon. However, the spermatozoon is very immature, having no ability for motility or egg recognition. Both of these events occur once the spermatozoa transit a secondary organ known as the epididymis. During the ~12 day passage that it takes for a sperm cell to pass through the epididymis, post-translational modifications of existing proteins play a pivotal role in the maturation of the cell. One major facet of such is protein phosphorylation. In order to characterize phosphorylation events taking place during sperm maturation, both pure sperm cell populations and pre-fractionation of phosphopeptides must be established. Using back flushing techniques, a method for the isolation of pure spermatozoa of high quality and yield from the distal or caudal epididymides is outlined. The steps for solubilization, digestion, and pre-fractionation of sperm phosphopeptides through TiO2 affinity chromatography are explained. Once isolated, phosphopeptides can be injected into MS to identify both protein phosphorylation events on specific amino acid residues and quantify the levels of phosphorylation taking place during the sperm maturation processes.

Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.

Phosphopeptid Analyse der Nebenhoden Nagetier Spermien

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

Die indirekte Immunfluoreszenz auf Gefrierschnitte von Mäusemilchdrüse

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

We present two minimally invasive microsurgical techniques in rodents for specific drug delivery into the middle ear so that it may reach the inner ear. The first procedure consists of perforation of the tympanic bulla, termed bullostomy; the second one is a transtympanic injection. Both emulate human clinical intratympanic procedures.
Chitosan-glycerophosphate (CGP) and Ringer&#180;s Lactate buffer (RL) were used as biocompatible vehicles for local drug delivery. CGP is a nontoxic biodegradable polymer widely used in pharmaceutical applications. It is a viscous liquid at RT&#160;but it congeals to a semi solid phase at body temperature. RL is an isotonic solution used for intravenous administrations in humans. A small volume of this vehicle is precisely placed on the Round Window (RW) niche by means of a bullostomy. A transtympanic injection fills the middle ear and allows less control but broader access to the inner ear.
The safety profiles of both techniques were studied and compared by using functional and morphological tests. Hearing was evaluated by registering the Auditory Brainstem Response (ABR) before and several times after microsurgery. The cytoarchitecture and preservation level of cochlear structures were studied by conventional histological techniques in paraformaldehyde-fixed and decalcified cochlear samples. In parallel, unfixed cochlear samples were taken and immediately frozen to analyze gene expression profiles of inflammatory markers by quantitative Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR).
Both procedures are suitable as drug delivery methods into the mouse middle ear, although transtympanic injection proved to be less invasive compared to bullostomy.

A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

Two microsurgery approaches for local drug delivery to the inner ear are described here and compared in terms of impact on hearing parameters, cochlear cytoarchitecture and expression of inflammatory markers.

Eine vergleichende Studie von Drug-Delivery-Methoden Gezielte an die Maus Inner Ear: Bullostomy<em&gt; Versus</em&gt; Transtympanale Injection

We present two minimally invasive microsurgical techniques in rodents for specific drug delivery into the middle ear so that it may reach the inner ear. ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

Isolierung von intakt, ganze Maus Milchdrüsen zur Analyse der extrazellulären Matrix Ausdruck und Drüse Morphologie

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Partial Bile Duct Ligation in the Mouse: A Controlled Model of Localized Obstructive Cholestasis

In rodents, complete bile duct ligation (cBDL) of the common bile duct is an established surgical technique for studying obstructive cholestasis and bile duct proliferation. However, long-term experiments can lead to increased morbidity and mortality. In select mouse strains with underlying liver disease, meaningful comparisons can be made even with ligation of a single lobe of the liver, which can reduce animal losses and expenses. Here, we describe partial bile duct ligation (pBDL) in the mouse, in which only the left hepatic bile duct is ligated, causing biliary obstruction in the left lobe but not the remaining lobes. With careful microsurgical technique, pBDL experiments can be cost-effective, since the unligated lobe serves as an internal control to the ligated lobes, when subjected to the same conditions in the same animal. Unlike cBDL, a separate sham-operated control group is not necessary. pBDL is highly useful to directly compare localized versus systemic effects of cholestasis and other retained bile components. pBDL can also be repurposed as a novel method to investigate mechanisms related to medications and cell migration.

Here, we present partial bile duct ligation as a surgical model of liver injury and regeneration in rodents.

Partielle Gallengang Ligation in der Maus: eine kontrollierte Modell der lokalisierten obstruktive Cholestase

In rodents, complete bile duct ligation (cBDL) of the common bile duct is an established surgical technique for studying obstructive cholestasis and bile ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

Trans-innere Zelle Masse Injektion von embryonalen Stammzellen führt zu höheren Chimerism Raten

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques

Bovine mammary gland biopsies allow researchers to collect tissue samples to study cell biology including gene expression, histological analysis, signaling pathways, and protein translation. This article describes two techniques for biopsy of the bovine mammary gland (MG). Three healthy Holstein dairy cows were the subjects. Before biopsies, cows were milked and subsequently restrained in a cattle chute. An analgesic (flunixin meglumine, 1.1 to 2.2 mg/kg of body weight) was administered via jugular intravenous [IV] injection 15-20 min prior to biopsy. For standing sedation, xylazine hydrochloride (0.01-0.05 mg/kg of body weight) was injected via the coccygeal vessels 5-10 min before the procedure. Once adequately sedated, the biopsy site was aseptically prepared and locally anaesthetized with 6 mL of 2% lidocaine hydrochloride via subcutaneous injection. Using aseptic technique, a 2 to 3 cm vertical incision was made using a number 10 scalpel. Core and needle biopsy tools were used. The core biopsy tool was attached to a cordless drill and inserted into the MG tissue through the incision using a clock-wise drill action. The needle biopsy tool was manually inserted into the incision site. Immediately after the procedure, an assistant applied pressure on the incision site for 20 to 25 min using a sterile towel to achieve hemostasis. Stainless steel surgical staples were used to oppose the skin incision. The staples were removed 10 days post-procedure. The main advantages of core and needle biopsies is that both approaches are minimally invasive procedures that can be safely performed in healthy cows. Milk yield following the biopsy was unaffected. These procedures require a short recovery time and result in fewer risks of complications. Specific limitations may include bleeding after the biopsy and infection on the biopsy site. Applications of these techniques include tissue collection for clinical diagnosis and research purposes, such as primary cell culture.

This article presents a bovine mammary gland biopsy using core and needle biopsy tools. Harvested tissue can be used for cell culture or to assess mammary physiology and metabolism including gene expression, protein expression, protein modifications, immunohistochemistry, and metabolite concentrations.