Die Forschung, die zu diesen Ergebnissen geführt Mittel von der Europäischen Union Siebten Rahmenprogramms (FP7/2007-2013) unter Finanzhilfevereinbarungen n erhalten. 228334 und 241526. Dieses Forschungsprojekt wurde auch von Human Frontier Science Program Forschungsstipendium (RGP0027/2009) unterstützt und vom italienischen Ministerium für Bildung, Universität und Forschung im Rahmen der Flagship-Projekt Nanomax und von italienischen Gesundheitsministerium im Rahmen der &quot;Stem Cells Aufruf zur Einreichung von Vorschlägen&quot;. Diese Forschung wurde im Rahmen der Forschungsaktivitäten der Stiftung, die von ICON &quot;Ente Cassa di Risparmio di Firenze&quot; unterstützt durchgeführt.

1. Gewebevorbereitung und Lagerung <ol><li> Fix Mausgehirn durch Standard transkardialer Perfusion mit 20 ml 13 0,01 M Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS)-Lösung, gefolgt von 100 ml 4% Paraformaldehyd in 0,01 M PBS. Den pH-Wert der beiden Lösungen sorgfältig anpassen, um 7.6: etwas niedrigere Werte der pH-Wert kann die Fluoreszenz von EGFP zu stillen. </li><li> Post-fix die Köpfe ausgeschnitten über Nacht in 4% Paraformaldehyd bei 4 ° C </li><li> Zweimal (jeweils 30 Minuten) in 0,01 M PBS spülen und Speicher in 0,01 M PBS bei 4 ° C. </li></ol> 2. Dehydration und Clearing Hinweis:. Das Protokoll für die Entwässerung und Abbau der ein von Becker et al 10 beschrieben, eng an <ol><li> Peroxide aus der Dehydratisierung Lösungsmittel (Tetrahydrofuran, THF), was stark zu löschen XFP Fluoreszenz Filter THF mit basisch aktivierten Aluminiumoxid (Aktivitätsstufe Brockmann I, etwa 250 g / l THF) unter Verwendung eines Chroma entfernengraphie Spalte. Vermeidung von Rissen der Spalte, die Peroxidentfernung reduzieren würde. </li><li> Der Stabilisator (butyliertes Hydroxytoluol, 250 mg / L) nach der endgültigen Lösung, auch wenn das THF wurde bereits vor der Filtration stabilisiert. Stabilizer ist in der Tat von Aluminiumoxid beibehalten: THF ohne Stabilisator kann große Mengen an Peroxiden entwickeln und können explosive und gefährlich. </li><li> Entwässern des gesamten Gehirn der Maus in einer abgestuften Reihe von THF in reinem Wasser: 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%, je 1 h, dann 100% über Nacht. Die Küvette mit der Probe auf einem rotierenden Rad. Um die Lichteinstrahlung zu vermeiden, wickeln Sie die Fläschchen mit einer Aluminiumfolie. </li><li> Filtern Sie die Clearing-Lösungsmittel (Dibenzylether, DBE) mit Aluminiumoxid (Grund aktiviert, Aktivitätsstufe I Brockman, ca. 250 g / L DBE) unter Verwendung eines Filter Trichter. </li><li> Deaktivieren Sie die Probe in 100% DBE. Ändern Sie die Lösung nach 3 und 6 Stunden. </li></ol> 3. Specimen Montage <ol><li> Wenn das Gehirn durch das Auge sieht (typisch transparenttisch 1 Stunde nach der zweiten DBE Wechsel), bringen Sie es am gekippten Bildplatte durch eine der folgenden Methoden: </li><li><ol><li> Direktmontage - tauchen Sie vorsichtig die Probe auf eine der Spitzen (Abb. 3a). </li><li> Agarose-Disc - Tauchen Sie eine CD mit 6% Agarose-Gel auf die Tipps. Beheben Sie vorsichtig die Probe auf dem Agarose-Disc mit Acrylkleber (Bild 3b). Warten Sie etwa 1 min für die Heilung. </li><li> Agarose-Becher - Tauchen Sie ein Becherglas von 3% Agarose-Gel auf die Tipps. Platzieren der Probe sanft auf dem Boden des Becherglases (Fig. 3c). </li></ol></li></ol> Hinweis 1: Montage in Agarose Becher sollte bevorzugt werden, wenn es wichtig ist, die Abbildung der Probe in ihrer Gesamtheit werden, aber die Agarose-Gel um die Probe verursacht zusätzliche Lichtstreuung, die sich nachteilig auf die Bildqualität sein könnte. Wenn ein kleiner Teil der Probe konnte aus Abbildungs ​​ausgeschlossen werden, ist es besser, um die Spezifikation zu montierenimen auf Agarose Platte oder direkt auf die Spitze. Die erste Methode ist am besten geeignet, um das Gehirn horizontal (ohne Abbildung eines von ventralen oder dorsalen Teil des Gehirns), die letztere zu halten, um das Gehirn vertikal zu halten (ohne Abbildung eines Teils von der Riechkolben oder Rückenmark). Anmerkung 2: die Agarose-Gel sollte in Wasser für 4 Stunden hergestellt werden kann, dann dehydriert mit THF (50% und 100% jeweils 4 Stunden) und in DBE 100% gelöscht oder bis es klar durchsichtig aussieht. <ol start="3"><li> Nach der Montage der Probe nach einem der vorherigen Methoden, positionieren Sie die Bildplatte in der Probenkammer mit einer Pinzette. Füllen Sie die Kammer mit Clearing-Lösung. </li></ol> 4. Tomographie Vorbereitung <ol><li> Entfernen des Schlitzes, um so viel wie möglich zu sammeln Fluoreszenz. </li><li> Beleuchten Sie die Probe mit niedrigem Laserleistung Ausbleichen zu verhindern. </li><li> Bewegen Sie die Probe in den drei Richtungen mit Hilfe des Software-gesteuerten Mikrostell systeMeter Identifizierung für jede Richtung der minimalen und maximalen Koordinaten, für die die Probe beleuchtet und innerhalb des Sichtfeldes der Kamera (4a). </li><li> Legen Sie die oben Koordinaten als Parameter für die &quot;Pre-Tomographie&quot; Unterprogramm. Außerdem geben den Abstand zwischen benachbarten Stapeln in der Tomographie verwendet werden, und die Vor-Tomographie Abtastschritt in z-Richtung. </li><li> Starten Sie den Pre-Tomographie, die die Bilder in jedem Stapel mit der unter (4.4) angegebenen z Probenahme sammelt. </li></ol> Hinweis: Die gesammelten Bilder werden von einer Software verwendet, um eine grobe Karte der Probenform und Position (4b), die Beschränkung Tomographie Erwerb nur auf das Volumen tatsächlich von der Probe besetzt, wodurch Abbildungszeit und damit Photobleaching ermöglicht vorzubereiten. 5. Tomographie Acquisition <ol><li> Bewegen Sie die Probe außerhalb des Lichtblattes mit der Mikropositioniersystem. </li><li> Increase Laserleistung und stoppen Sie die Bewegung aller Scansysteme, um nur einen Festnetzanschluss in der Mitte des Gesichtsfeldes zu beleuchten. </li><li> Montieren Sie den Schlitz und richten Sie sie mit Autofluoreszenz-Signal von der Clearing-Lösung. Sie sollte deutlich die Schlitzlinie in der Mitte des Blickfeldes. </li><li> Re-Aktivierung des Scansystem, Laserleistung zu reduzieren und bewegen Sie die Probe innerhalb der Lichtbogen mit der Mikropositioniersystem. Beachten Sie, dass die Laserleistung mit dem Schlitz eingesetzt wird höher als ohne sie verwendet werden, da das Raumfilter blockiert einen nicht vernachlässigbaren Anteil von Licht. </li><li> Stellen Sie die Amplitude und Offset der Scan-und de-Scan-Systeme mit der Steuersoftware, bis die Bilder aussehen hell und klar. </li><li> Führen Sie die Tomographie Erfassungssoftware, nach der Einstellung der entsprechenden z Schritt für das Experiment. Das Volumen wird in vielen parallelen, teilweise überlappenden Stapel (5a) abgebildet werden, und die Bilder werden gespeicherteine hierarchische Ordnerstruktur. </li></ol> 6. Nähte und Visualisierung <ol><li> Füllen Sie das erworbene Volumen mit synthetischen schwarzen Bildern (also Bilder von der gleichen Art und Abmessungen der gesammelten Einsen-, aber mit Null-Intensität) mit einem automatisierten Software (Abbildung 4c). Dieser Schritt ist notwendig, um für die Stitching-Software, um mit einer kompletten Rauminhalt beschäftigen obligatorisch. </li><li> Start Vaa3D Software (von frei heruntergeladen <a href="http://www.vaa3d.org/" target="_blank">http://www.vaa3d.org/</a> ) mit den Plugins TeraStitcher und TeraManager installiert. </li><li> Laden Sie die TeraStitcher Plugin. Wählen Sie das Verzeichnis, das die abgebildeten Volumen, die relativen Ausrichtungen der Achsen (mit Bezug auf eine Referenz rechtshändiges Koordinatensystem) und die Voxel-Größe. </li><li> Starten Sie den ersten Teil der Naht. Die Software wird die relative Verschiebung zwischen Paaren von Stacks zu berechnen, und finden Sie eine Gesamt optimale Stellung hinent für alle Stapel zusammen (Abbildung 5b). </li><li> Wählen Sie die genäht Volumen in Einzel Auflösung oder in Multi-Resolution-Format zu speichern. Letzteres ermöglicht für Multi-Resolution-Visualisierung mit dem TeraManager Plugin. In beiden Fällen, wenn die höhere Bildauflösung ist größer als ein paar Gigabyte, die Multi-Stack speichern Modalität auch wählen, und geben Sie die Größe der einzelnen Teilstapel. Dies ermöglicht einen effizienten Zugriff auf die gespeicherten Daten. </li><li> Starten Sie den zweiten Teil der Naht. Die Software wird die ausgerichteten Stapeln zusammenzuführen, und speichern Sie sie entweder in Einzel-oder Multi-Stack-Modus (5c und 5d). Am Ende schließen Sie die TeraStitcher Plugin. </li><li> Laden Sie die TeraManager Plugin. Wählen Sie den Ordner mit der mehrfach gestapelten Multi-Resolution-Volumen und zeigen Voxelgröße und Achsen Orientierungen. Die Lautstärke wird bei der minimalen Auflösung geladen werden. </li><li> Um auf eine höhere Auflösung zu vergrößern, wählen Sie ein Wahrzeichen mit der rechten Maustaste modality von Vaa3D, dann vergrößern sich mit der Maus scrollen. Alternativ können Sie auch direkt den ROI, mit einem Rechts-Klick vergrößern, oder geben Sie die Koordinaten des Volumens von Interesse. </li><li> Um niedrigere Auflösung heran, verwenden Sie einfach das Mausrad. </li></ol>

<ol>
	<li>Lichtman, J. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+big+and+the+small:+challenges+of+imaging+the+brain's+circuits.">The big and the small: challenges of imaging the brain's circuits.</a> Science. 334, 618-623 (2011).</li><li>Mayerich, D., Abbott, L., McCormick, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knife-edge+scanning+microscopy+for+imaging+and+reconstruction+of+three-dimensional+anatomical+structures+of+the+mouse+brain.">Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain.</a> J. Microsc. 231, 134-143 (2008).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-optical+sectioning+tomography+to+obtain+a+high-resolution+atlas+of+the+mouse+brain.">Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain.</a> Science. 330, 1404-1408 (2010).</li><li>Gong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuously+tracing+brain-wide+long-distance+axonal+projections+in+mice+at+a+one-micron+voxel+resolution.">Continuously tracing brain-wide long-distance axonal projections in mice at a one-micron voxel resolution.</a> Neuroimage. 74, 87-98 (2013).</li><li>Ragan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+two-photon+tomography+for+automated+ex+vivo+mouse+brain+imaging.">Serial two-photon tomography for automated ex vivo mouse brain imaging.</a> Nat. 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U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains.">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PLoS One. 7, e33916 (2012).</li><li>Bria, A., Iannello, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TeraStitcher+-+A+Tool+for+Fast+Automatic+3D-Stitching+of+Teravoxel-Sized+Microscopy+Images.">TeraStitcher - A Tool for Fast Automatic 3D-Stitching of Teravoxel-Sized Microscopy Images.</a> BMC Bioinformatics. 13, 316 (2012).</li><li>Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V3D+enables+real-time+3D+visualization+and+quantitative+analysis+of+large-scale+biological+image+data+sets.">V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets.</a> Nat. Biotechnol. 28, 348-353 (2010).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Booth, M. J., Neil, M. A. A., Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberration+correction+for+confocal+imaging+in+refractive-index-mismatched+media.">Aberration correction for confocal imaging in refractive-index-mismatched media.</a> J. Microsc. 192, 90-98 (1998).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li><li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy.">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322, 1065-1069 (2008).</li><li>Jahrling, N., Becker, K., Schonbauer, C., Schnorrer, F., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+and+segmentation+of+intact+Drosophila+by+ultramicroscopy.">Three-dimensional reconstruction and segmentation of intact Drosophila by ultramicroscopy.</a> Front Syst. Neurosci. 4, 1 (2010).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

CLSM gekoppelt mit chemischen Lichtung stellen ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Neuroanatomie der gesamte Gehirn der Maus mit fluoreszierenden Sonden, entweder Proteine ​​oder synthetische Farbstoffen markiert studieren. Da das Licht außerhalb der Fokusebene wird durch einen physikalischen Raumfilter blockiert, ist Hochkontrast-Abbildung möglich auch in dicken Proben, unter Beibehaltung der hohen Bild typisch für Lichtbogen-Architektur Raten. Das Hauptproblem, mit, wenn mit den beschriebenen Methoden umzugehen, ist die Maximierung der Kontrast. In der Tat, die verfügbaren Signal sowohl durch chemische und optische Faktoren reduziert. Vom chemischen Standpunkt aus können die Clearingverfahren auf Basis organischer Lösemittelemission von fluoreszierenden Proteinen und anderen fluoreszierenden Farbstoffen 7 stillen. Filtration des Lösungsmittels zu entfernen Peroxide, wie von Becker et al. 10 beschrieben, ermöglicht die Aufrechterhaltung einer guten Niveau der Fluoreszenz auch in lösemittel gelöscht Gewebe. Veröffentlichened auf Wasserbasis Clearingverfahren 14 nicht reduzieren Fluoreszenzeffizienz, aber zu schlechteren Transparenz im Umgang mit der gesamten Maus-Gehirn, zumindest bei linearen optischen Techniken. Auf der anderen Seite, im Moment gibt es keine kommerziellen Ziele mit großem Arbeitsabstand für den hohen Brechungsindex (n ≈ 1.56) Clearing-Lösungen eingesetzt korrigiert. Somit wird der Brechungsindex-Fehlanpassung zwischen dem Medium, in dem die Probe eingetaucht und die Gestaltung einer der Ziel führt zu starken sphärischen Aberrationen. Neben der Verringerung der Auflösung des Mikroskops führen solche Aberrationen in einem Tropfen Bildintensität und der Kontrast, da das Licht auf eine größere Fläche verteilt. Mögliche Workarounds für dieses Problem sind die Verwendung der adaptiven Optik 15 und / oder statische asphärische Korrektoren. Jede Verbesserung des Bildkontrastes und Intensität leicht wirkt sich auch der Abbildungsgeschwindigkeit, da eine kürzereIntegrationszeit pro Bild kann ausgewählt werden. Im Moment CLSM kann ein Abbildungsgeschwindigkeit von etwa 10 6 um 3 / s leisten, mit einer Kamera, Belichtungszeit von 100 ms 9. Bei dieser Geschwindigkeit dauert es 1-3 Tage, um ein ganzes Bild Gehirn der Maus, je nach Probengröße. Obwohl keine signifikante Verschlechterung der Bildqualität ist ganz so langen Bildgebungssitzung, vor allem wegen der niedrigen intrinsischen Photobleaching Lichtbogen Beleuchtung 6 beobachtet, die lange Zeit, um ein einziges Bild benötigt Gehirn der Maus konnte in der Praxis reduzieren die Anwendbarkeit der CLSM. Eine 10-fache Steigerung der Effizienz des Systems, verbunden mit der Verwendung einer Hochgeschwindigkeitskamera zum Nachweis würde Abbildungszeit bis zu mehreren Stunden zu reduzieren, so dass eine routinemäßige Anwendung des beschriebenen Protokoll. Trotz all der oben genannten Einschränkungen, CLSM Bildgebung zur chemischen Reinigung der Gewebe ermöglicht gekoppelt gesamte Gehirn der Maus mit Mikrometer-Skala zu rekonstruieren Auflösung in weniger als einWoche. Andere optische Methoden für die gesamte Bildgebung des Gehirns leisten höhere Auflösung als CLSM, aber um den Preis einer längeren Vorbereitung und / oder Belichtungszeit 4.2 oder einer spärlich z 5 Probenahme. Die in diesem Artikel beschriebenen Verfahren können in Kombination mit verschiedenen Strategien zur Fluoreszenzmarkierung eingesetzt werden: transgenen Tiere exprimieren fluoreszierende Proteine ​​in ausgewählten neuronalen Untergruppen, virale Transfektion intraparenchymal Farbstoff Injektion usw. In der Praxis mit CLSM kompatibel sind alle Färbung Strategien vorangehenden Tieropfer . In der Tat hat Post-mortem-Fluoreszenzmarkierung des gesamten Gehirn der Maus nicht nachgewiesen, dass sie jetzt jedenfalls, wenn diese Art der Färbung würde in naher Zukunft möglich sein, die Anzahl der Proben, die mit CLSM rekonstruiert werden konnten, werden viel größer werden, möglicherweise einschließlich der menschlichen Hirngewebe. Abschließend konfokalen Mikroskopie Lichtbogen in Kombination mit tis verwendetsue Clearing-und Multi-Resolution-Datenmanagement kann den Forschern ermöglichen, mit einer Auflösung im Mikrometer-Skala zu rekonstruieren und zu analysieren, makroskopische Proben mit technologischen Bemühungen, die gut von der Hand der meisten Labors sind. Mögliche Anwendungen der CLSM sind natürlich nicht die Neurowissenschaften beschränkt, sondern erstreckt sich über alle Forschungsfelder, in denen Lichtblatt-Mikroskopie wurde bereits verwendet worden, wie Embryogenese 16,17 und Anatomie von Kleintieren 18.

Im Vergleich zu unserem Verständnis der molekularen und zellulären Mechanismen der Hirnfunktion, sieht unser Wissen von feinen Neuroanatomie immer noch in den Kinderschuhen ein. In der Tat, noch fehlen uns umfassende Karten der Position des neuronalen Zellkörper oder der langfristigen Projektionen im gesamten Gehirn. Eigentlich sind viele technologische Anstrengungen gewidmet, um die Maus Gehirn mit mikroskopischer Auflösung zu rekonstruieren. Optische Methoden, die auf Serienschnitt Harz eingebetteten Proben, als Knife-Edge-Scanning-Mikroskopie (KESM) 2, Micro-Optische Schnitte Tomographie (MOST) 3 und Fluoreszenz-MOST (fMOST) 4, können Sub-Mikrometer dreidimensionale Auflösung liefern Abbildung der gesamten Gehirn der Maus. Allerdings ist die Gesamtzeit für die Herstellung und Bebilderung einer einzigen Probe benötigt in der Grßenordnung von mehreren Wochen, wodurch die praktische Anwendung solcher Methoden. Eine weitere Technik, die auf Serienschnitt (aber ohne Harz Einbettung), Seriell Zwei-Photon Tomographie (STP) 5, ermöglicht eine hohe räumliche Auflösung Imaging. Jedoch hat diese Technik ganz Mäusegehirnen nur mit sehr wenigen Stichproben nachgewiesen, Sammelabschnitt 1 jeder 50 um 5, und unseres Wissens STP noch nicht eine vollständige Entnahme und Rekonstruktion eines murinen Gehirn produziert. Eine innovative optische Methode, ganze Exemplare in drei Dimensionen mit hoher Geschwindigkeit rekonstruieren Lichtblatt-Mikroskopie 6. In diesem optischen System wird die Probe mit einer dünnen Licht beleuchtet und die Fluoreszenzemission entlang einer Achse senkrecht zu der Beleuchtungsebene gesammelt. Auf diese Weise nur im Fokus Fluorophore sind begeistert und es ist möglich, optische Schnitte in Weitfeld-Konfiguration zu erreichen, garantiert hohe Bildraten. Wenn zu Clearing-Protokolle auf der Basis der Substitution von Wasser mit einem Brechungsindexanpassung Flüssigkeit 7 verbunden ist, hat Lichtblatt Mikroskopie angewandtmakroskopischen Proben, als ganze Gehirn der Maus 8. Allerdings Probe-induzierten Lichtstreuung, die auch gelöscht Exemplare betrifft, verschlechtert die Lichtbogen, die zur Anregung der out-of-focus Fluorophore, die eine Gesamt Unschärfe zu den aufgenommenen Bildern erstellt. Um selektiv sammeln nur In-Fokus-Photonen, die wir vor kurzem gekoppelt Lichtblatt Beleuchtung auf einem konfokalen Detektionsschema 9. Bei der konfokalen Mikroskopie Lichtblatt (CLSM), out-of-focus-und gestreuten Photonen werden durch eine lineare räumliche Filter (Schlitz) vor der Detektion (Figur 1) abgelehnt. Konfokale Betrieb Licht Plattenarchitektur zu erreichen, wird die Beleuchtung durch eine Abtastlinie erzeugt wird, und ein de-Scanning-System in dem Detektionspfad erzeugt ein statisches Bild des Anregungs Abtastzeile an der Stelle des Schlitzes. Eine dritte Scansystem rekonstruiert ein zweidimensionales Bild auf dem Kamerasensor. CLSM bietet eine 100% Kontrastverstärkung in frei MausGehirn gegenüber herkömmlichen Lichtblatt-Mikroskopie, während eine 10 Hz Bildrate. Mit CLSM ist es möglich, ganze Gehirn der Maus mit einer Auflösung von 2 um in XY und Z in 9 um zu rekonstruieren, und mit genügend Kontrast auf einzelne fluoreszenzmarkierten Neuronen zu erkennen. In diesem Artikel beschreiben wir die experimentellen Pipeline, eine Maus Gehirn mit CLSM rekonstruieren. Aldehyd-fixierte Gehirn der Maus sind in einer abgestuften Reihe peroxidfreiem Tetrahydrofuran entwässert und anschließend in peroxidfreiem Dibenzylether (Abbildung 2) gelöscht, nach der von 10 gelöscht Probe Becker et al. Entwickeltes Protokoll wird dann vorsichtig auf einem gekippt montiert Platte und in der Bildraum einer maßgeschneiderten konfokalen Mikroskop Lichtblatt positioniert. Die Probe kann direkt durch Eintauchen auf einer Spitze der Platte (3a) befestigt werden, alternativ können sie auf einer Scheibe gelöscht Agarosegel (Fig. geklebt3b) oder in den Hohlraum eines Becher geräumte Agarosegel (3c) hergestellt gelegt. Eine optische Tomographie des gesamten Gehirns wird dann durchgeführt, wie viele parallele benachbarten Stapeln erworben werden, um die ganze Hirnvolumen (Abbildung 4) zu decken. Ein Pre-Tomographie Probenahme, die eine grobe Karte von der Probenposition und der Form erzeugt, gewährleistet, dass die Bildgebung wird nur das Volumen der Probe besetzt geführt. Die Tomographie-Stapel werden anschließend zusammen mit maßgeschneiderten Software genäht und in einer Multi-Resolution-hierarchischen Schema 11 gespeichert. Gehirn der Maus kann schließlich mit prototypischen Multi-Resolution-Google Maps-ähnliche Visualisierungssoftware untersucht werden. Beide Software-Instrumente sind als Plugins in der Open-Source-Plattform Vaa3D 12 integriert. Wir zeigen schließlich repräsentative Bilder von Gehirn der Maus, um die Fähigkeiten der beschriebenen Versuchsleitung in das Studium Fein murinen neuroanatom zeigeny.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P4417_100TAB</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraformaldehyde</td>
 <td>Agar Scientific</td>
 <td>R1018</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peroxide-free Tetrahydrofuran</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>186562</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aluminum oxide activated, basic, Brockmann I</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>199443</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dibenzyl ether</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>108014</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Butylated hydroxytoluene</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>W218405 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose Type III-A, High EEO</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9793</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acrylic glue</td>
 <td>Bostik</td>
 <td>D2498</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vaa3D software</td>
 <td>open source</td>
 <td></td>
 <td>freely downloadable from <a href="http://www.vaa3d.org/" target="_blank">http://www.vaa3d.org/</a> </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

micron-scale resolution optical tomography of entire mouse brains with confocal light sheet microscopy

Das Verständnis der Architektur des Gehirns von Säugetieren auf Einzelzellauflösung ist eine der Schlüsselfragen der Neurowissenschaften. Abbilden neuronalen Soma und Projektionen im gesamten Gehirn ist jedoch immer noch eine Herausforderung für die Bildgebung und Datenmanagement-Technologien. Tatsächlich müssen makroskopischen Volumina mit hoher Auflösung und Kontrast in einer angemessenen Zeit rekonstruiert werden, wodurch Datenmengen im Terabyte-Bereich. Wir haben vor kurzem gezeigt, ein optisches Verfahren (konfokale Mikroskopie Lichtblatt, CLSM) der Lage ist, im Mikrometermaßstab Rekonstruktion der gesamten Gehirn der Maus mit enhanced green fluorescent protein (EGFP) markiert. Die Kombination von Lichtbogen-Beleuchtung und konfokale Detektion ermöglicht CLSM tief im Inneren makroskopischen Abbildungs ​​gelöscht Proben mit hohem Kontrast und Geschwindigkeit. Hier beschreiben wir die komplette Versuchs Pipeline, umfassende und für Menschen lesbaren Bilder der gesamten Gehirn der Maus mit fluoreszierenden Proteinen markiert erhalten. Das Clearing und die Montage pERFAHREN beschrieben, zusammen mit den Schritten, eine optische Tomographie auf seiner gesamten Volumen durch Erfassen vielen parallelen benachbarten Stapeln führen. Wir zeigten den Einsatz von Open-Source maßgeschneiderte Software-Tools ermöglichen Nähen der mehrere Stapel und Multi-Resolution-Datennavigation. Schließlich illustriert wir einige Beispiele von Gehirnkarten: das Kleinhirn von einer L7-GFP-transgenen Maus, in der alle Purkinje-Zellen selektiv markiert, und das gesamte Gehirn aus einer Thy1-GFP-M Maus, gekennzeichnet durch eine Zufalls spärlich neuronalen Kennzeichnung.

Das beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um mit Mikrometer-Skala Auflösung entweder gesamte Gehirn der Maus oder ausgeschnitten Teile zu rekonstruieren, ohne die Notwendigkeit für physische Schnitte werden. Als ein repräsentatives Ergebnis, wie in Abbildung 6 das ganze Kleinhirn eines L7-GFP-Maus (postnatalen Tag 10) gezeigt. In diesem Tier alle Purkinje-Nervenzellen sind mit EGFP markiert. Wenn wir vergrößern, kann die typische Lamellenstruktur der Kleinhirnrinde (Abbildung 7) zu sehen. Weitere Zoomen ermöglicht eine klare Unterscheidung jedes Purkinje Zelle soma (Abbildung 8). Das beschriebene Protokoll kann somit zur neuronalen räumliche Organisation in verschiedenen neurophysiologischen Studien zu screenen. Als zweites repräsentatives Ergebnis präsentieren wir Bilder von der ungeschnittenen Gehirn eines Erwachsenen thy1-GFP-M-Maus. In dieser transgenen Tier EGFP in zufälliger spärlich neuronalen Teilmenge ausgedrückt. Die rechte Hälfte des Gehirns an in Fig. 9 gezeigt. Wie wirzoom-in weiter (Abbildungen 10 und 11), neuronale Prozesse unterscheidbar werden. Dieses Ergebnis zeigt, dass die beschriebene Protokoll ermöglicht Mikrometermaßstab auflösende Bildgebung in gesamten erwachsenen Gehirn der Maus, das Öffnen der Möglichkeit des Studiums ganzen Gehirn Anatomie an zellulärer Auflösung in Mausmodellen von neurodegenerativen Erkrankungen. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Optische Schema der konfokalen Lichtblatt-Mikroskopie (CLSM). (A) Draufsicht der Vorrichtung, die die Anregung Weg. Laseremission von einer 488 nm Diode-pumped solid state (DPSS-Laser) nach der Expansion und Kollimation durch einen ersten Teleskop, tritt in einen akustooptischen abstimmbaren Filter (AOTF), die Strahlintensität regelt. Dann wird eine zweite Teleskop weitet den Strahl. Ein Galvanometer Spiegel vertikal (entlang der y) scannt das sein<html> Uhr, die von einer Linse in der Probenkammer ausgerichtet ist. (b) Seitenansicht der Vorrichtung, die den Erfassungspfad. Licht von der Erfassungs Objektiv gesammelt wird vertikal durch einen Galvanometerspiegel descanned und fokussiert durch eine Linse, wodurch ein Standbild des sich bewegenden Erregungsleitung. An der Position des fixierten Bildes eine lineare Raumfilter (Schlitz) angeordnet ist. Nach dem Schlitz, ein Galvo-Spiegel innerhalb eines 4f-Linsensystem angeordnet rekonstruiert ein 2-dimensionales Bild auf dem Chip einer Elektronenvervielfachungsladungsgekoppelte Vorrichtung (CCD-EM). Ein Fluoreszenzbandpassfilter entfernen Sie alle Anregungsstreulicht vor der Detektion. Repräsentative Strahlen der Anregung, Detektion und bandpaßgefilterte Detektionslicht werden durch blaue, hellblau und grünen Strahlen dargestellt sind. Die Brennweiten der Objektive aller tatsächlich in der Mikroskop verwendet werden angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50696/50696fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . jove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig2.jpg" /> 2. Proben Clearing. Formaldehyd fixierten Mäusehirnen, die in 0,1 M PBS bei 4 ° C gelagert werden (a) sind in einer abgestuften Reihe von Tetrahydrofuran dehydratisiert (THF, b) und anschließend in 100% Dibenzylether gelöscht (DBE , c). Die Entwässerungsschritt verursacht auch einige Gewebeschrumpfung. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig3.jpg" /> Abbildung 3. Probenhalterung für CLSM-Bildgebung. Das Gehirn kann direkt gelöscht gestürzt werden auf der Montageplatte gekippt (a), aufgeklebt auf einem Agarose gelöscht Scheibe (b), oder auf eine freie Agarose-Becher (c) eingefügt. 4. Tomographieerfassung. Die vorge Tomographie Routineproben ein Quader, die das Gehirn (a) die Anzahl und die Länge der parallelen benachbarten Stapeln erforderlich, um alle Bild der Probe definieren (b). Nach Tomographie werden schwarze Bilder erzeugt werden, um die virtuelle erfassten Volumens zu einem quader vervollständigen (c). <img alt="Figur 5" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig5.jpg" /> 5. Volume Nähten. Die gesammelten Bildstapeln überlappen teilweise untereinander (a), so dass ihre präzise Ausrichtung mit der TeraStitcher Plugin (b). Das Plugin fügt dann die ausgerichteten Stapel entweder in einem Einzel gestapelt (c) oder Multi-stacked (d) Multi-Resolution-Darstellung. <img alt="Fig. 6" fo:conteint-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig6.jpg" /> 6. Ganze Kleinhirn der L7 P10-GFP-Maus, in dem alle Purkinje-Nervenzellen sind mit EGFP. Maßstabsbalken, 1 mm beschriftet. <img alt="Fig. 7" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig7.jpg" /> Abbildung 7. Zoom-in einen Teil des Kleinhirns in Fig. 6 dargestellt, die die typische Lamellenstruktur der Kleinhirnrinde. Maßstabsbalken 500 &amp;mgr; m. <img alt="Fig. 8" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig8.jpg" /> Abbildung 8. Weitere Zoom-in eines Teils des in Fig. 6 gezeigten Kleinhirn. Purkinje-Zellen Soma klar sein unterscheidenhrsg. Maßstabsbalken, 200 um. <img alt="Fig. 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig9.jpg" /> Abbildung 9. Rechten Hälfte des Gehirns von einem erwachsenen thy1-GFP-M Maus, gekennzeichnet durch eine spärliche neuronale EGFP unspezifische Kennzeichnung. Maßstabsbalken, 1 mm. <img alt="10" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig10.jpg" /> Abbildung 10. Zoom-In von einem Teil des Halb Gehirn in Fig. 9 gezeigt, die einen Teil des Hippocampus und Kortex. Maßstabsbalken 200 &amp;mgr; m. <img alt="11" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig11.jpg" /> Abbildung 11. Weitere Zoom-In von einem Teil des Halb Gehirn in Fig. 9 gezeigt. Mehrere Neuriten im Cortex klar unterschieden werden. Maßstabsbalken, 50 &amp;mgr; m.

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Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

In diesem Artikel beschreiben wir die volle experimentelle Verfahren zu rekonstruieren, mit hoher Auflösung, feinen Hirnanatomie von fluoreszenzmarkierten Gehirn der Maus. Die beschriebenen Protokoll umfasst die Probenvorbereitung und Clearing-, Proben-Montage für Imaging, Daten Post-Processing und Multi-Skalen-Visualisierung.

Micron-Skala Resolution Optical Tomography von Entire Gehirn der Maus mit der konfokalen Mikroskopie Licht Blatt

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.5K Aufrufe.  European Laboratory for Non-linear Spectroscopy (LENS).  In diesem Artikel beschreiben wir die volle experimentelle Verfahren zu rekonstruieren, mit hoher Auflösung, feinen Hirnanatomie von fluoreszenzmarkierten Gehirn der Maus. Die beschriebenen Protokoll umfasst die Probenvorbereitung und Clearing-, Proben-Montage für Imaging, Daten Post-Processing und Multi-Skalen-Visualisierung. 

Serie: Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also propagation of suprathreshold spiking activity involves populations of neurons. Empirical studies addressing cortical function directly thus require recordings from populations of neurons with high resolution. Here we describe an optical method and a deconvolution algorithm to record neural activity from up to 100 neurons with single-cell and single-spike resolution. This method relies on detection of the transient increases in intracellular somatic calcium concentration associated with suprathreshold electrical spikes (action potentials) in cortical neurons. High temporal resolution of the optical recordings is achieved by a fast random-access scanning technique using acousto-optical deflectors (AODs)1. Two-photon excitation of the calcium-sensitive dye results in high spatial resolution in opaque brain tissue2. Reconstruction of spikes from the fluorescence calcium recordings is achieved by a maximum-likelihood method. Simultaneous electrophysiological and optical recordings indicate that our method reliably detects spikes (&gt;97% spike detection efficiency), has a low rate of false positive spike detection (&lt; 0.003 spikes/sec), and a high temporal precision (about 3 msec) 3. This optical method of spike detection can be used to record neural activity in vitro and in anesthetized animals in vivo3,4.

Understanding the function of the vertebrate central nervous system requires recordings from many neurons because cortical function arises on the level of populations of neurons. Here we describe an optical method to record suprathreshold neural activity with single-cell and single-spike resolution, dithered random-access scanning. This method records somatic fluorescence calcium signals from up to 100 neurons with high temporal resolution. A maximum-likelihood algorithm deconvolves the underlying suprathreshold neural activity from the somatic fluorescence calcium signals. This method reliably detects spikes with high detection efficiency and a low rate of false positives and can be used to study neural populations in vitro and in vivo.

Optische Aufnahme überschwellige neuronale Aktivität mit Single-Cell-und Single-Spike Auflösung

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Forschung

Neurowissenschaften

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

Optische Kohärenztomographie: Maus retinalen Ganglienzellen Zellen In Vivo Imaging

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in vertebrates. Thus, it is critical to uncover the molecular mechanisms of how motor axons navigate to, arborize, and innervate their peripheral muscle targets during development and degeneration. Although transgenic Hb9::GFP mouse lines have long served to visualize motor axon trajectories during embryonic development, detailed descriptions of the full spectrum of axon terminal arborization remain incomplete due to the pattern complexity and limitations of current optical microscopy. Here, we describe an improved protocol that combines light sheet fluorescence microscopy (LSFM) and robust image analysis to qualitatively and quantitatively visualize developing motor axons. This system can be easily adopted to cross genetic mutants or MN disease models with Hb9::GFP lines, revealing novel molecular mechanisms that lead to defects in motor axon navigation and arborization.

Here, we describe a protocol for visualizing motor neuron projection and axon arborization in transgenic Hb9::GFP mouse embryos. After immunostaining for motor neurons, we used light sheet fluorescence microscopy to image embryos for subsequent quantitative analysis. This protocol is applicable to other neuron navigation processes in the central nervous system.

Visualisierung von motorischen Axon Navigation und Quantifizierung der Axon Arborization In Mausembryonen mit Fluoreszenz-Lichtblattmikroskopie

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Free-floating Immunostaining of Mouse Brains

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the regulation of energy metabolism and other neurobiological processes. However, the quality, reliability, and reproducibility of brain histology results may vary among laboratories. For each staining experiment, it is necessary to optimize the key procedures based on differences in species, tissues, targeted proteins, and the working conditions of the reagents. This paper demonstrates a reliable workflow in detail, including intra-aortic perfusion, brain sectioning, free-floating immunostaining, tissue mounting, and imaging, which can be followed easily by researchers in this field.
Also discussed are how to modify these procedures to satisfy the individual needs of researchers. To illustrate the reliability and efficiency of this protocol, perineuronal nets were stained with biotin-labeled Wisteria florbunda agglutinin (WFA) and arginine vasopressin (AVP) with an anti-AVP antibody in the mouse brain. Finally, the critical details for the entire procedure have been addressed, and the advantages of this protocol compared to those of other protocols. Taken together, this paper presents an optimized protocol for free-floating immunostaining of mouse brain tissue. Following this protocol makes this process easier for both junior and senior scientists to improve the quality, reliability, and reproducibility of immunostaining studies.

This protocol describes an efficient and reproducible approach for mouse brain histological studies, including perfusion, brain sectioning, free-floating immunostaining, tissue mounting, and imaging.

Frei schwebende Immunfärbung von Mausgehirnen

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the ...

Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the transmission of molecules from the nervous system to voluntary muscles, leading to contraction. They are affected in many human diseases, including inherited neuromuscular disorders such as Duchenne muscular dystrophy (DMD), congenital myasthenic syndromes (CMS), spinal muscular atrophy (SMA), and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Therefore, monitoring the morphology of neuromuscular junctions and their alterations in disease mouse models represents a valuable tool for pathological studies and preclinical assessment of therapeutic approaches. Here, methods for labeling and analyzing the three-dimensional (3D) morphology of the pre- and postsynaptic parts of motor endplates from murine teased muscle fibers are described. The procedures to prepare samples and measure NMJ volume, area, tortuosity and axon terminal morphology/occupancy by confocal imaging, and the distance between postsynaptic junctional folds and acetylcholine receptor (AChR) stripe width by super-resolution stimulated emission depletion (STED) microscopy are detailed. Alterations in these NMJ parameters are illustrated in mutant mice affected by SMA and CMS.

This protocol describes a method for morphometric analysis of neuromuscular junctions by combined confocal and STED microscopy that is used to quantify pathological changes in mouse models of SMA and ColQ-related CMS.

Charakterisierung neuromuskulärer Verbindungen bei Mäusen mittels kombinierter konfokaler und hochauflösender Mikroskopie

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the ...

Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a cascade of events leading to neurotransmitter release. Moreover, changes in presynaptic calcium levels mediate the activity of many intracellular proteins and play an important role in synaptic plasticity. Studying calcium signaling is also important for finding ways to treat neurodegenerative diseases. The neuromuscular junction is a suitable model for studying synaptic plasticity, as it has only one type of neurotransmitter. This article describes the method for loading a calcium-sensitive dye through the cut nerve bundle into the mice's motor nerve endings. This method allows the estimation of all parameters related to intracellular calcium changes, such as basal calcium level and calcium transient. Since the influx of calcium from the cell exterior into the nerve terminals and its binding/unbinding to the calcium-sensitive dye occur within the range of a few milliseconds, a speedy imaging system is required to record these events. Indeed, high-speed cameras are commonly used for the registration of fast calcium changes, but they have low image resolution parameters. The protocol presented here for recording calcium transient allows extremely good spatial-temporal resolution provided by confocal microscopy.

The protocol describes the method of loading a fluorescent calcium dye through the cut nerve into mouse motor nerve terminals. In addition, a unique method for recording fast calcium transients in the peripheral nerve endings using confocal microscopy is presented.

Registrierung von Kalziumtransienten in neuromuskulären Verbindungen von Mäusen mit hoher zeitlicher Auflösung mittels konfokaler Mikroskopie

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a ...

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature vibrations of molecules. However, these vibrational signatures are also characteristic of molecules within anatomical tissue such as the brain, making it increasingly useful and applicable for Neuroscience applications. For example, CARS can measure lipids by specifically exciting chemical bonds within these molecules, allowing for quantification of different aspects of tissue, such as myelin involved in neurotransmission. In addition, compared to other techniques typically used to quantify myelin, CARS can also be set up to be compatible with immunofluorescent techniques, allowing for co-labeling with other markers such as sodium channels or other components of synaptic transmission. Myelination changes are an inherently important mechanism in demyelinating diseases such as multiple sclerosis or other neurological conditions such as Fragile X Syndrome or autism spectrum disorders is an emerging area of research. In conclusion, CARS can be utilized in innovative ways to answer pressing questions in Neuroscience and provide evidence for underlying mechanisms related to many different neurological conditions.

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy CARS Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Visualizing myelination is an important goal for many researchers studying the nervous system. CARS is a technique that is compatible with immunofluorescence that can natively image lipids within tissue such as the brain illuminating specialized structures such as myelin.

Kohärente Anti-Stokes-Raman-Spektroskopie (CARS) Anwendung zur Bildgebung der Myelinisierung in Gehirnschnitten

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of structural changes caused by genetic or environmental perturbations. Whole-brain imaging results in more accurate quantification of cells and the study of region-specific differences that may be missed with commonly used microscopy of physically sectioned tissue. Using light-sheet microscopy to image cleared brains greatly increases acquisition speed as compared to confocal microscopy. Although these images produce very large amounts of brain structural data, most computational tools that perform feature quantification in images of cleared tissue are limited to counting sparse cell populations, rather than all nuclei.
Here, we demonstrate NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), a group of analysis tools, to quantify all nuclei and nuclear markers within annotated regions of a postnatal day 4 (P4) mouse brain after clearing and imaging on a light-sheet microscope. We describe magnetic resonance imaging (MRI) to measure brain volume prior to shrinkage caused by tissue clearing dehydration steps, tissue clearing using the iDISCO+ method, including immunolabeling, followed by light-sheet microscopy using a commercially available platform to image mouse brains at cellular resolution. We then demonstrate this image analysis pipeline using NuMorph, which is used to correct intensity differences, stitch image tiles, align multiple channels, count nuclei, and annotate brain regions through registration to publicly available atlases.
We designed this approach using publicly available protocols and software, allowing any researcher with the necessary microscope and computational resources to perform these techniques. These tissue clearing, imaging, and computational tools allow measurement and quantification of the three-dimensional (3D) organization of cell-types in the cortex and should be widely applicable to any wild-type/knockout mouse study design.

This protocol describes methods for conducting magnetic resonance imaging, clearing, and immunolabeling of intact mouse brains using iDISCO+, followed by a detailed description of imaging using light-sheet microscopy, and downstream analyses using NuMorph.

Ganzhirn-Einzelzellbildgebung und Analyse intakter neonataler Mausgehirne mittels MRT, Gewebereinigung und Lichtblattmikroskopie

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

Imaging the Aging Cochlea with Light-Sheet Fluorescence Microscopy

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or presbycusis is a primary cause of sensorineural hearing loss and is characterized by damage to hair cells, spiral ganglion neurons (SGNs), and the stria vascularis. These structures reside within the cochlea, which has a complex, spiral-shaped anatomy of membranous tissues suspended in fluid and surrounded by bone. These properties make it technically difficult to investigate and quantify histopathological changes. To address this need, we developed a light-sheet microscope (TSLIM) that can image and digitize the whole cochlea to facilitate the study of structure-function relationships in the inner ear. Well-aligned serial sections of the whole cochlea result in a stack of images for three-dimensional (3D) volume rendering and segmentation of individual structures for 3D visualization and quantitative analysis (i.e., length, width, surface, volume, and number). Cochleae require minimal processing steps (fixation, decalcification, dehydration, staining, and optical clearing), all of which are compatible with subsequent high-resolution imaging by scanning and transmission electron microscopy. Since all the tissues are present in the stacks, each structure can be assessed individually or relative to other structures. In addition, since imaging uses fluorescent probes, immunohistochemistry and ligand binding can be used to identify specific structures and their 3D volume or distribution within the cochlea. Here we used TSLIM to examine cochleae from aged mice to quantify the loss of hair cells and spiral ganglion neurons. In addition, advanced analyses (e.g., cluster analysis) were used to visualize local reductions of spiral ganglion neurons in Rosenthal&#39;s canal along its 3D volume. These approaches demonstrate TSLIM microscopy&#39;s ability to quantify structure-function relationships within and between cochleae.

A light-sheet microscope was developed to image and digitize whole cochlea.

Bildgebung der alternden Cochlea mit Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or ...

Maus-Retina-OCT-Fibergramm-Ausrichtung mit konfokalen Bildern

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has been increasingly applied to obtain an objective assessment of neural damage in eye diseases. Ex vivo confocal imaging of the same retina is often necessary to validate the in vivo findings especially in animal research. In this study, we demonstrated a method for aligning an ex vivo confocal image of the mouse retina with its in vivo images. A new clinical-ready imaging technology called visible light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) was applied to acquire in vivo images of the mouse retina. We then performed the confocal imaging of the same retina as the &#34;gold standard&#34; to validate the in vivo vis-OCTF images. This study not only enables further investigation of the molecular and cellular mechanisms but also establishes a foundation for a sensitive and objective evaluation of neural damage in vivo.

Autor im Rampenlicht: Fortschritte in der In-vivo- und Ex-vivo-Netzhautbildgebung für eine verbesserte Glaukomdiagnose und -behandlung 

The present protocol outlines the steps for aligning in vivo visible-light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) images with ex vivo confocal images of the same mouse retina for the purpose of verifying the observed retinal ganglion cell axon bundle morphology in the in vivo images.

Abgleich von optischen Kohärenztomographie-Fasergrammen im sichtbaren Licht mit konfokalen Bildern derselben Maus-Netzhaut

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...