A investigação conducente a estes resultados foi financiada pelo Sétimo Programa-Quadro da União Europeia (FP7/2007-2013) sob acordos de subvenção n. 228334 e 241526. Este projeto de pesquisa tem sido também apoiada pela Human Frontier Science Program bolsa de investigação (RGP0027/2009) e pelo Ministério Italiano de Educação, Universidade e Pesquisa, no âmbito do Projeto Flagship Nanomax e pelo italiano Ministério da Saúde no âmbito do &quot;Células-Tronco Chamada para apresentação de propostas&quot;. Esta pesquisa foi realizada no âmbito das actividades de investigação do ICON fundação apoiados por &quot;Ente Cassa di Risparmio di Firenze&quot;.

1. Tissue Preparação e armazenamento <ol><li> Fix cérebro do rato através de perfusão transcardial padrão 13 com 20 ml de solução 0,01 M (PBS), tampão fosfato salino, seguida por 100 ml de paraformaldeído 4% em 0,01 M de PBS. Ajustar cuidadosamente o pH de ambas as soluções para 7.6: ligeiramente mais baixos valores do pH pode saciar a fluorescência de EGFP. </li><li> Pós-corrigir os cérebros excisadas durante a noite em paraformaldeído a 4% a 4 ° C. </li><li> Lavar duas vezes (30 min cada) em PBS 0,01 M e armazenar em 0,01 M de PBS a 4 ° C. </li></ol> 2. Desidratação e Clearing Nota: o protocolo para a desidratação e limpando segue de perto o descrito por Becker et al 10. <ol><li> Para remover os peróxidos de desidratação do solvente (tetra-hidrofurano, THF), o que fortemente extinguir a fluorescência XFP, THF filtro com base de óxido de alumínio activado (grau de actividade Brockman I, cerca de 250 g / L de THF), utilizando um cromaTOGRAPHY coluna. Evitar a quebra da coluna, o que iria reduzir a remoção de peróxido. </li><li> Adicionar estabilizador (hidroxitolueno butilado, 250 mg / L), para a solução final, mesmo se o THF já foi estabilizado antes da filtração. Estabilizador é na verdade mantida por óxido de alumínio: THF sem estabilizador podem desenvolver grandes quantidades de peróxidos e pode ser explosiva e perigosa. </li><li> Desidratar todo o cérebro de rato em uma série graduada de THF em água pura: 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%, 1 h cada, e depois 100% durante a noite. Colocar o frasco com a amostra sobre uma roda rotativa. Para evitar a exposição à luz, enrole os frascos com uma folha de alumínio. </li><li> Filtrar o solvente de limpeza (éter dibenzílico, DBE) com óxido de alumínio (activado de base, grau actividade Brockman I, cerca de 250 g / L de DBE), utilizando um funil de filtração. </li><li> Desmarque a amostra em 100% DBE. Alterar a solução depois de 3 e 6 horas. </li></ol> 3. Espécime de montagem <ol><li> Quando o cérebro parece transparente por olho (typicamente 1 hora após a segunda mudança DBE), montá-lo na placa de imagem de ponta por um dos seguintes métodos: </li><li><ol><li> Montagem direta - Suavemente mergulhar a amostra em uma das pontas (Figura 3A). </li><li> Disco de agarose - Mergulhar um disco feito de 6% de gel de agarose nas pontas. Delicadamente, corrigir a amostra no disco agarose com cola de acrílico (Figura 3b). Aguarde cerca de 1 min para a cura. </li><li> Proveta de agarose - mergulho num copo feito de 3% de gel de agarose nas pontas. Suavemente colocar a amostra sobre o fundo do copo (Figura 3c). </li></ol></li></ol> Nota 1: A montagem de taça de agarose deve ser preferido quando é importante imagem da amostra no seu conjunto, no entanto, o gel de agarose em torno da amostra dá origem à dispersão da luz adicional que poderia ser prejudicial para a qualidade da imagem. Se uma pequena parte da amostra poderiam ser excluídos da imagem, é melhor montar a especificaçãoimen no disco agarose ou diretamente na ponta. O primeiro método é o mais adequado para manter o cérebro horizontal (excluem-se imaginando uma porção ventral ou dorsal do cérebro), este último para manter o cérebro vertical (excluindo a imagem de um parte dos bulbos olfatórios ou da medula espinhal). Nota 2: o gel de agarose devem ser preparadas em água, em seguida, desidratou-se com THF (50% e 100% de 4 horas cada) e afastada em DBE 100% durante 4 horas ou até que parece claramente transparente. <ol start="3"><li> Após a montagem do espécime, seguindo um dos métodos anteriores, a posição da placa de imagem no interior da câmara de amostra, usando uma pinça. Encha a câmara com solução de limpar. </li></ol> 4. Tomografia Preparação <ol><li> Retire a fenda para recolher o máximo de fluorescência possível. </li><li> Iluminar a amostra com baixo consumo de energia do laser para evitar a fotodegradação. </li><li> Mova a amostra em três direções usando o microposicionamento syste-driven softwarem. Identificar, para cada direcção a coordenadas mínima e máxima para a qual a amostra é iluminada e está dentro do campo de visão da câmara (Figura 4a). </li><li> Insira as coordenadas acima como parâmetros para a sub-rotina &#39;Pré-tomografia. Especificar também a distância entre as pilhas adjacentes para ser utilizado na tomografia, e o passo de amostragem pré-tomografia na direcção z. </li><li> Iniciar o pré-tomografia, que coleta as imagens em cada pilha com a amostragem z especificada em (4.4). </li></ol> Nota: As imagens recolhidas são usados ​​por um software para preparar um mapa grosseiro de forma exemplar e de posição (Figura 4b), o que permite restringir a aquisição de tomografia apenas para o volume realmente ocupado pela amostra, reduzindo o tempo de imagiologia e, assim, a fotodegradação. 5. Tomografia Aquisição <ol><li> Mover a amostra fora da folha de luz utilizando o sistema de microposicionamento. </li><li> Incpotência do laser rease e parar o movimento de todos os sistemas de controlo, de modo a iluminar apenas uma linha fixa no centro do campo de visão. </li><li> Monte a fenda e alinhá-lo com sinal de autofluorescência da solução de limpeza. Deverá ver claramente a linha de fenda no centro do campo de visão. </li><li> Re-ativar o sistema de varredura, reduzir a potência do laser e passar a amostra no interior da folha de luz usando o sistema microposicionamento. Note-se que a potência do laser utilizado, com a fenda será maior do que a utilizada, sem que, uma vez que os blocos de filtros espaciais uma fracção não desprezável de luz. </li><li> Ajuste a amplitude eo deslocamento dos sistemas de digitalização e digitalizar com o software de controle, até que as imagens parecem claras e brilhantes. </li><li> Execute o programa de aquisição de tomografia, depois de definir o passo z apropriada para o experimento. O volume será fotografada em muitos paralelo, parcialmente sobrepostas pilhas (Figura 5A), e as imagens serão salvas emuma estrutura hierárquica de pastas. </li></ol> 6. Costura e Visualização <ol><li> Completar o volume adquirido com imagens em preto sintéticos (ou seja, imagens do mesmo tipo e as dimensões das recolhidos os-, mas com intensidade zero) usando um software automatizado (Figura 4c). Esta etapa é obrigatória para que o software de costura para lidar com um volume cúbico completa. </li><li> Software lançamento Vaa3D (baixado gratuitamente a partir <a href="http://www.vaa3d.org/" target="_blank">http://www.vaa3d.org/</a> ) com os plugins TeraStitcher e TeraManager instalados. </li><li> Coloque o plugin TeraStitcher. Selecione o diretório que contém o volume fotografada, indicam as orientações relativas dos eixos (em relação a uma referência destro sistema de coordenadas) e do tamanho do voxel. </li><li> Lançar a primeira parte da costura. O software irá calcular o deslocamento relativo entre casais de pilhas, e encontrar um ótimo global placement para todas as pilhas em conjunto (Figura 5b). </li><li> Selecione para salvar o volume costurado em uma única resolução ou em formato multi-resolução. Este último permite a visualização multi-resolução com o plugin TeraManager. Em ambos os casos, se a imagem de maior resolução é maior do que alguns gigabytes, selecione também a multi-pilha save modalidade e especificar o tamanho da subpilhas individuais. Isto irá permitir um acesso eficiente aos dados armazenados. </li><li> Inicie a segunda parte da costura. O software irá mesclar as pilhas alinhadas, e salvá-los no modo de multi-stack simples ou (Figuras 5c e 5d). No final fechar o plugin TeraStitcher. </li><li> Coloque o plugin TeraManager. Selecione a pasta com o volume de multi-resolução multi-empilhados, e indicam o tamanho do voxel e machados orientações. O volume será carregado na resolução mínima. </li><li> Para aumentar o zoom para uma resolução maior, selecione um marco usando o botão direito do mouse modality de Vaa3D, em seguida, ampliar o uso de rolagem do mouse. Alternativamente, você pode selecionar diretamente o ROI para fazer zoom com um clique com o botão direito, ou especificar as coordenadas do volume de interesse. </li><li> Para o zoom para uma resolução mais baixa, basta usar a rolagem do mouse. </li></ol>

<ol>
	<li>Lichtman, J. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+big+and+the+small:+challenges+of+imaging+the+brain's+circuits.">The big and the small: challenges of imaging the brain's circuits.</a> Science. 334, 618-623 (2011).</li><li>Mayerich, D., Abbott, L., McCormick, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knife-edge+scanning+microscopy+for+imaging+and+reconstruction+of+three-dimensional+anatomical+structures+of+the+mouse+brain.">Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain.</a> J. Microsc. 231, 134-143 (2008).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-optical+sectioning+tomography+to+obtain+a+high-resolution+atlas+of+the+mouse+brain.">Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain.</a> Science. 330, 1404-1408 (2010).</li><li>Gong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuously+tracing+brain-wide+long-distance+axonal+projections+in+mice+at+a+one-micron+voxel+resolution.">Continuously tracing brain-wide long-distance axonal projections in mice at a one-micron voxel resolution.</a> Neuroimage. 74, 87-98 (2013).</li><li>Ragan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+two-photon+tomography+for+automated+ex+vivo+mouse+brain+imaging.">Serial two-photon tomography for automated ex vivo mouse brain imaging.</a> Nat. Methods. 9, 255-258 (2012).</li><li>Keller, P. J., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+microscopy+of+living+or+cleared+specimens.">Light sheet microscopy of living or cleared specimens.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 22, 138-143 (2012).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).</li><li>Silvestri, L., Bria, A., Sacconi, L., Iannello, G., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+light+sheet+microscopy:+micron-scale+neuroanatomy+of+the+entire+mouse+brain.">Confocal light sheet microscopy: micron-scale neuroanatomy of the entire mouse brain.</a> Opt. Express. 20, 20582-20598 (2012).</li><li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains.">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PLoS One. 7, e33916 (2012).</li><li>Bria, A., Iannello, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TeraStitcher+-+A+Tool+for+Fast+Automatic+3D-Stitching+of+Teravoxel-Sized+Microscopy+Images.">TeraStitcher - A Tool for Fast Automatic 3D-Stitching of Teravoxel-Sized Microscopy Images.</a> BMC Bioinformatics. 13, 316 (2012).</li><li>Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V3D+enables+real-time+3D+visualization+and+quantitative+analysis+of+large-scale+biological+image+data+sets.">V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets.</a> Nat. Biotechnol. 28, 348-353 (2010).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Booth, M. J., Neil, M. A. A., Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberration+correction+for+confocal+imaging+in+refractive-index-mismatched+media.">Aberration correction for confocal imaging in refractive-index-mismatched media.</a> J. Microsc. 192, 90-98 (1998).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li><li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy.">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322, 1065-1069 (2008).</li><li>Jahrling, N., Becker, K., Schonbauer, C., Schnorrer, F., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+and+segmentation+of+intact+Drosophila+by+ultramicroscopy.">Three-dimensional reconstruction and segmentation of intact Drosophila by ultramicroscopy.</a> Front Syst. Neurosci. 4, 1 (2010).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

CLSM juntamente com a limpeza química representam uma ferramenta poderosa para estudar a neuroanatomia dos cérebros inteiros rato marcados com sondas fluorescentes, quer as proteínas ou corantes sintéticos. Uma vez que a luz emitida fora do plano focal é bloqueado por um filtro espacial física, imagens de alto contraste é possível também em amostras de espessura, mantendo as altas taxas de quadros típicos da arquitetura folha de luz. A questão principal para lidar com quando se utiliza os métodos descritos é a maximização do contraste. Na verdade, o sinal disponível é reduzida tanto por factores químicos e ópticos. Do ponto de vista químico, os procedimentos de limpeza com base em solvente orgânico pode extinguir a emissão de proteínas fluorescentes e outros corantes fluorescentes 7. Filtrou-se o solvente para remover os peróxidos, tal como descrito por Becker et al. 10, permite a manutenção de um bom nível de fluorescência também em tecidos limpou-solventes. Publicared à base de água métodos de compensação 14 não reduzem a eficiência de fluorescência, mas resultam em mais pobre transparência quando se lida com os cérebros inteiros de murino, pelo menos, com técnicas ópticas lineares. Por outro lado, no momento em que não há objetivos comerciais com distância de trabalho longa corrigidos para o alto índice de refração (n ≈ 1,56) limpando soluções utilizadas. Assim, a incompatibilidade entre o índice de refracção do meio em que a amostra é imersa e a criação de um objectivo dá origem a fortes aberração esférica. Além de reduzir a resolução do microscópio, tais aberrações resultar numa queda de intensidade e contraste da imagem, uma vez que a luz é espalhada sobre uma zona mais ampla. Possíveis soluções para esse problema incluem o uso de óptica adaptativa 15 e / ou corretores asféricas estáticas. Qualquer melhora no contraste e intensidade da imagem prontamente afeta também a velocidade de imagem, uma vez que uma menor emtempo gração por imagem pode ser escolhido. No momento CLSM pode proporcionar uma velocidade de imagem de cerca de 10 6 um 3 / seg, com um tempo de exposição da câmara de 100 mseg 9. Nessa velocidade que leva 1-3 dias para imagem inteira um cérebro do rato, dependendo do tamanho da amostra. Embora nenhuma degradação significativa na qualidade da imagem é observada em toda a sessão de imagens, tais muito tempo, principalmente por causa da baixa fotodegradação intrínseca da iluminação folha de luz 6, o longo tempo necessário para uma única imagem do cérebro do rato poderia na prática reduzir a aplicabilidade da CLSM. Um aumento de 10 vezes na eficiência de sistema, juntamente com o uso de uma câmara de alta velocidade para a detecção, iria reduzir o tempo de imagiologia de várias horas, o que permite uma utilização de rotina do protocolo descrito. Apesar de todas as limitações acima referidas, a imagem latente CLSM acoplado a compensação química dos tecidos permite reconstruir cérebros inteiros rato com resolução de micro-escala em menos de umsemana. Outros métodos ópticos para a imagem latente do cérebro inteiro pagar maior resolução do que CLSM, mas ao preço de mais preparação e / ou tempo de imagem 2-4, ou de um z amostras dispersas 5. Os métodos descritos neste artigo podem ser utilizados em combinação com diferentes estratégias de marcação fluorescente: animais transgénicos que expressam proteínas fluorescentes em subconjuntos neuronais, transfecção viral, injecção intraparenquimatosa corante, etc, na prática, todas as estratégias de coloração anteriores sacrifício dos animais são compatíveis com CLSM . Na verdade, o post-mortem fluorescente rotulagem de cérebros inteiros do rato não foi demonstrado até agora, de qualquer forma, se esse tipo de coloração seria possível em um futuro próximo, o número de amostras que podem ser reconstruídos com CLSM vai se tornar muito maior, incluindo potencialmente o tecido cerebral humano. Em conclusão, a microscopia confocal folha de luz utilizados em combinação com tisclearing sue e multi-resolução de gerenciamento de dados pode permitir aos pesquisadores reconstruir e analisar amostras macroscópicas com resolução em escala mícron, com esforços tecnológicos que estão bem na mão da maioria dos laboratórios. As aplicações potenciais de CLSM são, evidentemente, não se limitando a neurociência, mas abrange todos os campos de investigação em que a microscopia folha de luz já foi usado, como a embriogênese 16,17 e anatomia de pequenos animais 18.

Quando comparado com a nossa compreensão dos mecanismos moleculares e celulares da função cerebral subjacente, o nosso conhecimento da neuroanatomia multa ainda parece em sua infância 1. Na verdade, ainda não temos mapas detalhados da posição do somata neuronal ou de projeções de longo alcance em todo o cérebro. Na verdade, muitos esforços tecnológicos são dedicados a reconstruir o cérebro do rato com resolução microscópica. Métodos ópticos baseados em cortes seriados de amostras incluídas em resina, como faca-Edge Microscopia (KESM) 2, Micro-Optical Seccionamento Tomography (MOST) 3 e fluorescência-MOST (fMOST) 4, pode fornecer sub-mícron resolução tridimensional imagens dos cérebros inteiros do mouse. No entanto, o tempo total necessário para a preparação e tratamento de imagens de uma única amostra é da ordem de várias semanas, o que limita a sua aplicação prática de tais métodos. Outra técnica baseada em cortes seriados (mas sem resina incorporação), Serial doisTomografia Photon (STP) 5, permite resolução tridimensional de alta imagem. No entanto, esta técnica tem sido demonstrado em ratos cérebros inteiros apenas com uma amostragem muito escassa, a coleta de uma seção a cada 50 mm 5, e para o nosso conhecimento STP ainda não produziu uma reconstrução a amostragem completa de um cérebro murino. Um método óptico de ponta para reconstruir peças inteiras em três dimensões em alta velocidade é a microscopia folha de luz 6. Neste esquema óptico a amostra é iluminada com uma folha fina de luz e a emissão de fluorescência é recolhido ao longo de um eixo perpendicular ao plano de iluminação. Desta forma, apenas fluoróforos em foco está animado e é possível alcançar o corte óptico na configuração vasto campo, garantindo altas taxas de quadros. Quando acoplado a limpar protocolos baseados na substituição da água com um índice de refracção de líquido correspondente 7, microscopia folha de luz foi aplicado aespécimes macroscópicos, como rato cérebros inteiros 8. No entanto, a amostra induzida por espalhamento de luz, o que afeta as amostras ainda apuradas, degrada a folha de luz que leva à excitação dos fluoróforos fora de foco, que acrescenta um total indefinição das imagens adquiridas. Para coletar seletivamente apenas fótons em foco, que recentemente juntamente iluminação folha de luz a um esquema de detecção confocal 9. Na microscopia confocal folha de luz (CLSM), out-of-focus e fótons espalhados são rejeitados por um filtro espacial linear (cortar) antes da detecção (Figura 1). Para realizar a operação confocal em arquitectura folha de luz, a iluminação é produzido por meio de uma linha de exploração, e um sistema de varrimento de no caminho detecção cria uma imagem estática da linha de exploração de excitação no local da fenda. Um terceiro sistema de digitalização reconstrói uma imagem bidimensional no sensor da câmara. CLSM proporciona um realce de contraste de 100% no rato apuradascérebros com relação à microscopia convencional folha de luz, mantendo uma taxa de 10 Hz quadro. Com CLSM é possível reconstruir cérebros inteiros rato com resolução de 2 m em XY e 9 mM de Z, e com contraste suficiente para discernir neurônios único fluorescente etiquetado. Neste artigo descrevemos o gasoduto experimental para reconstruir um cérebro de camundongo com CLSM. Cérebro do rato fixa-aldeído são desidratados numa série graduada de tetrahidrofurano isento de peróxido, e subsequentemente libertadas em éter isento de peróxido de dibenzilo (Figura 2), seguindo o protocolo desenvolvido por Becker et al. 10 A amostra limpa é então cuidadosamente montada sobre um derrubado placa e posicionado na câmara de imagem de uma folha confocal microscópio de luz feito por encomenda. A amostra pode ser directamente montado mergulhando-o sobre uma ponta da placa (Figura 3a), em alternativa, pode ser colada sobre um disco de gel de agarose afastada (figura3b) ou colocado na cavidade de um copo feito de gel de agarose eliminado (Figura 3c). Uma tomografia óptica de todo o cérebro é então realizada, como várias pilhas paralelas adjacentes são adquiridos para cobrir todo o volume do cérebro (Figura 4). Uma amostragem pré-tomografia, que produz um mapa grosseiro da posição e da forma da amostra, garante que a imagem é realizada apenas no volume ocupado pela amostra. As pilhas de tomografia são posteriormente costuradas com software feito por encomenda e salvas em um multi-resolução esquema hierárquico 11. Rato cérebros podem, eventualmente, ser explorada com software multi-resolução de visualização do Google Maps-como protótipo. Ambos os instrumentos de software são integrados como plugins na plataforma open-source Vaa3D 12. Mostramos finalmente imagens representativas do cérebro do rato para demonstrar as capacidades do gasoduto experimental descrito no estudo neuroanatom murino finay.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P4417_100TAB</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraformaldehyde</td>
 <td>Agar Scientific</td>
 <td>R1018</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peroxide-free Tetrahydrofuran</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>186562</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aluminum oxide activated, basic, Brockmann I</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>199443</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dibenzyl ether</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>108014</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Butylated hydroxytoluene</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>W218405 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose Type III-A, High EEO</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9793</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acrylic glue</td>
 <td>Bostik</td>
 <td>D2498</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vaa3D software</td>
 <td>open source</td>
 <td></td>
 <td>freely downloadable from <a href="http://www.vaa3d.org/" target="_blank">http://www.vaa3d.org/</a> </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

micron-scale resolution optical tomography of entire mouse brains with confocal light sheet microscopy

Compreender a arquitetura do cérebro dos mamíferos na resolução de uma única célula é uma das questões-chave da neurociência. No entanto, o mapeamento soma neuronal e projeções ao longo de todo o cérebro ainda é um desafio para as tecnologias de imagem e gerenciamento de dados. Na verdade, os volumes macroscópicas precisa ser reconstruído com alta resolução e contraste em um tempo razoável, produzindo conjuntos de dados na faixa TeraByte. Recentemente demonstramos um método óptico (microscopia confocal luz folha, CLSM) capaz de obter reconstrução micro-escala dos cérebros inteiros rato marcados com reforçada proteína verde fluorescente (EGFP). Combinando iluminação folha de luz e detecção confocal, CLSM permite imagens profundamente dentro de espécimes desmatadas macroscópicas com alto contraste e velocidade. Aqui nós descrevemos o gasoduto experimental completa para obter imagens completas e legíveis de cérebros inteiros rato marcados com proteínas fluorescentes. A compensação ea montagem pROCEDIMENTOS são descritos, em conjunto com os passos para realizar uma tomografia óptica em todo o seu volume através da aquisição de várias pilhas adjacentes paralelas. Nós mostramos o uso de ferramentas de software sob medida de código aberto que permite a costura das várias pilhas e navegação de dados multi-resolução. Finalmente, ilustramos alguns exemplos de mapas cerebrais: o cerebelo de um ratinho transgénico L7-GFP, em que todas as células de Purkinje são rotulados selectivamente, e todo o cérebro de um rato Thy1-GFP-M, caracterizado por uma marcação neuronal esparso aleatória.

O protocolo descrito pode ser usado para reconstituir com resolução tanto cérebros inteiros de rato escala mícron ou partes excisadas, sem a necessidade de corte físico. Como resultado representativo, na Figura 6 todo o cerebelo de um rato L7-GFP (dia pós-natal 10) é mostrado. Neste animais todos os neurônios de Purkinje são rotulados com EGFP. Se se aumentar o zoom, a estrutura lamelar típica do córtex cerebelar pode ser visto (Figura 7). Além disso zoom in permite distinguir claramente cada soma de células de Purkinje (Figura 8). O protocolo descrito pode, assim, ser utilizado para rastrear organização espacial neuronal em vários estudos de neurodesenvolvimento. Como um segundo resultado representativo, apresentamos imagens do cérebro de um adulto unsectioned Thy1-GFP-M mouse. Neste animal transgénico EGFP é expressa num subconjunto neuronal esparso aleatória. A metade direita do cérebro é mostrada na Figura 9 em. Como nósaumentar-se ainda mais e ainda (Figuras 10 e 11), os processos neuronais tornar distinguíveis. Este resultado demonstra que o protocolo descrito permite resolução de imagem micro-escala em cérebros inteiros adulto do rato, abrindo a possibilidade de estudar a anatomia do cérebro inteiro em resolução de celular em modelos de ratos com doença neurodegenerativa. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig1.jpg" /> Figura 1. Sistema óptico de microscopia confocal folha de luz (CLSM). (A) Vista superior do aparelho, mostrando o caminho de excitação. Emissão do laser de um sólido de laser 488 nm diodo-bombeado estado (DPSS), após a expansão e colimação por um primeiro telescópio, entra um filtro sintonizável acústico-ótico (AOTF) que regula a intensidade do feixe. Em seguida, um segundo telescópio amplia ainda mais o raio. Um espelho galvo verticalmente (ao longo y) varre a ser<html> am, o qual é focado por uma lente dentro da câmara de amostras. (b) Vista lateral do aparelho, que mostra o percurso de detecção. Luz coletadas pelo objectivo de detecção é verticalmente descanned por um espelho galvo e focalizado por uma lente, produzindo uma imagem fixa da linha de excitação em movimento. Na posição da imagem fixa um filtro espacial linear (ranhura) é colocado. Depois da fenda, um espelho galvo colocado dentro de um sistema de lentes 4f reconstrói uma imagem 2-dimensional sobre o chip de um dispositivo de carga acoplada multiplicação de electrões (EM-CCD). Um filtro passa-banda de fluorescência remover toda a luz de excitação de rua antes da detecção. Raios representativas de excitação, detecção e detecção de luz filtrada-passa-banda são representadas por raios, luz azul e verde azul, respectivamente. São indicadas as distâncias focais de todas as lentes realmente utilizados no microscópio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50696/50696fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . jove_content &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig2.jpg" /> Compensação Figura 2. Espécime. Rato cérebros fixados em formaldeído, que são armazenadas em PBS a 0,1 M a 4 ° C (a), são desidratados numa série graduada de tetrahidrofurano (THF, b) e subsequentemente libertadas em 100% de éter de dibenzilo (DBE , c). A etapa de desidratação provoca também algum encolhimento do tecido. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig3.jpg" /> Figura 3. Espécime de montagem para imagiologia MCVL. Apuradas O cérebro pode ser mergulhados directamente sobre a placa de montagem com ponta (um), colado num disco de agarose apagadas (b), ou inserido num copo de agarose apagadas (c). Figura 4. Aquisição Tomography. Os pré-tomografia amostras de rotina um paralelepípedo que contém o cérebro (a) para definir o número ea duração das pilhas adjacentes paralelas necessárias para a imagem toda a amostra (b). Depois de tomografia, imagens a preto são gerados para completar o volume adquirido virtual para um paralelepípedo (c). <img alt="Figura 5" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig5.jpg" /> Figura 5. Volume de costura. Imagem coletadas pilhas se sobrepõem parcialmente entre si (a), permitindo que o seu alinhamento preciso com o plugin TeraStitcher (b). O plugin mescla as pilhas alinhadas em um único stack (c) ou multi-stacked (d) representação multi-resolução. <img alt="Figura 6" fo:conteint-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig6.jpg" /> Figura 6. Cerebelo inteiro de um rato P10 L7-GFP, em que todos os neurónios de Purkinje são rotulados com EGFP. Barra de escala, de 1 mm. <img alt="Figura 7" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig7.jpg" /> Figura 7. Zoom-in de uma porção do cerebelo mostrado na Figura 6, que mostra a estrutura típica lamelar do córtex cerebelar. Barra de escala, de 500 um. <img alt="Figura 8" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig8.jpg" /> Figura 8. Além disso zoom do de uma porção do cerebelo mostrado na Figura 6. Das células de Purkinje soma pode ser claramente distinguired. Barra de escala, 200 mM. <img alt="Figura 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig9.jpg" /> Figura 9. A metade direita do cérebro de um rato adulto Thy1-GFP-M, caracterizada por uma escassa inespecífica neuronal EGFP rotulagem. Barra de escala, de 1 mm. <img alt="Figura 10" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig10.jpg" /> Figura 10. Aumentar-se de uma porção da metade do cérebro mostra a Figura 9, que mostra a parte do hipocampo e do córtex. Barra de escala, de 200 um. <img alt="Figura 11" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig11.jpg" /> Figura 11. Além disso zoom-em de uma porção da metade do cérebro mostra a Figura 9. Vários neurites no córtex podem ser claramente distinguidos. Barra de escala, 50 um.

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Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Neste artigo vamos descrever o procedimento experimental completo para reconstruir, com alta resolução, a anatomia do cérebro multa de cérebros fluorescente etiquetado do mouse. O protocolo descrito inclui preparação de amostras e limpeza, espécime de montagem para a imagem latente, os dados de pós-processamento e visualização multi-escala.

Micron escala Resolução óptica Tomografia de todo cérebro do rato com confocal Luz Folha de Microscopia

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

micron-scale-resolution-optical-tomography-entire-mouse-brains-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.6K visualizações.  European Laboratory for Non-linear Spectroscopy (LENS).  Neste artigo vamos descrever o procedimento experimental completo para reconstruir, com alta resolução, a anatomia do cérebro multa de cérebros fluorescente etiquetado do mouse. O protocolo descrito inclui preparação de amostras e limpeza, espécime de montagem para a imagem latente, os dados de pós-processamento e visualização multi-escala. 

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Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also propagation of suprathreshold spiking activity involves populations of neurons. Empirical studies addressing cortical function directly thus require recordings from populations of neurons with high resolution. Here we describe an optical method and a deconvolution algorithm to record neural activity from up to 100 neurons with single-cell and single-spike resolution. This method relies on detection of the transient increases in intracellular somatic calcium concentration associated with suprathreshold electrical spikes (action potentials) in cortical neurons. High temporal resolution of the optical recordings is achieved by a fast random-access scanning technique using acousto-optical deflectors (AODs)1. Two-photon excitation of the calcium-sensitive dye results in high spatial resolution in opaque brain tissue2. Reconstruction of spikes from the fluorescence calcium recordings is achieved by a maximum-likelihood method. Simultaneous electrophysiological and optical recordings indicate that our method reliably detects spikes (&gt;97% spike detection efficiency), has a low rate of false positive spike detection (&lt; 0.003 spikes/sec), and a high temporal precision (about 3 msec) 3. This optical method of spike detection can be used to record neural activity in vitro and in anesthetized animals in vivo3,4.

Understanding the function of the vertebrate central nervous system requires recordings from many neurons because cortical function arises on the level of populations of neurons. Here we describe an optical method to record suprathreshold neural activity with single-cell and single-spike resolution, dithered random-access scanning. This method records somatic fluorescence calcium signals from up to 100 neurons with high temporal resolution. A maximum-likelihood algorithm deconvolves the underlying suprathreshold neural activity from the somatic fluorescence calcium signals. This method reliably detects spikes with high detection efficiency and a low rate of false positives and can be used to study neural populations in vitro and in vivo.

A gravação ótica da atividade neural supraliminares com resolução de uma única célula e um único pico

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Neurociência

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

Tomografia de coerência óptica: Imagens Mouse ganglionares da retina células In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in vertebrates. Thus, it is critical to uncover the molecular mechanisms of how motor axons navigate to, arborize, and innervate their peripheral muscle targets during development and degeneration. Although transgenic Hb9::GFP mouse lines have long served to visualize motor axon trajectories during embryonic development, detailed descriptions of the full spectrum of axon terminal arborization remain incomplete due to the pattern complexity and limitations of current optical microscopy. Here, we describe an improved protocol that combines light sheet fluorescence microscopy (LSFM) and robust image analysis to qualitatively and quantitatively visualize developing motor axons. This system can be easily adopted to cross genetic mutants or MN disease models with Hb9::GFP lines, revealing novel molecular mechanisms that lead to defects in motor axon navigation and arborization.

Here, we describe a protocol for visualizing motor neuron projection and axon arborization in transgenic Hb9::GFP mouse embryos. After immunostaining for motor neurons, we used light sheet fluorescence microscopy to image embryos for subsequent quantitative analysis. This protocol is applicable to other neuron navigation processes in the central nervous system.

Visualização do axônio Motor navegação e quantificação do axônio arborização em embriões de rato usando microscopia de fluorescência folha de luz

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Free-floating Immunostaining of Mouse Brains

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the regulation of energy metabolism and other neurobiological processes. However, the quality, reliability, and reproducibility of brain histology results may vary among laboratories. For each staining experiment, it is necessary to optimize the key procedures based on differences in species, tissues, targeted proteins, and the working conditions of the reagents. This paper demonstrates a reliable workflow in detail, including intra-aortic perfusion, brain sectioning, free-floating immunostaining, tissue mounting, and imaging, which can be followed easily by researchers in this field.
Also discussed are how to modify these procedures to satisfy the individual needs of researchers. To illustrate the reliability and efficiency of this protocol, perineuronal nets were stained with biotin-labeled Wisteria florbunda agglutinin (WFA) and arginine vasopressin (AVP) with an anti-AVP antibody in the mouse brain. Finally, the critical details for the entire procedure have been addressed, and the advantages of this protocol compared to those of other protocols. Taken together, this paper presents an optimized protocol for free-floating immunostaining of mouse brain tissue. Following this protocol makes this process easier for both junior and senior scientists to improve the quality, reliability, and reproducibility of immunostaining studies.

This protocol describes an efficient and reproducible approach for mouse brain histological studies, including perfusion, brain sectioning, free-floating immunostaining, tissue mounting, and imaging.

Imunostaining flutuante livre de cérebros de rato

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the ...

Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the transmission of molecules from the nervous system to voluntary muscles, leading to contraction. They are affected in many human diseases, including inherited neuromuscular disorders such as Duchenne muscular dystrophy (DMD), congenital myasthenic syndromes (CMS), spinal muscular atrophy (SMA), and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Therefore, monitoring the morphology of neuromuscular junctions and their alterations in disease mouse models represents a valuable tool for pathological studies and preclinical assessment of therapeutic approaches. Here, methods for labeling and analyzing the three-dimensional (3D) morphology of the pre- and postsynaptic parts of motor endplates from murine teased muscle fibers are described. The procedures to prepare samples and measure NMJ volume, area, tortuosity and axon terminal morphology/occupancy by confocal imaging, and the distance between postsynaptic junctional folds and acetylcholine receptor (AChR) stripe width by super-resolution stimulated emission depletion (STED) microscopy are detailed. Alterations in these NMJ parameters are illustrated in mutant mice affected by SMA and CMS.

This protocol describes a method for morphometric analysis of neuromuscular junctions by combined confocal and STED microscopy that is used to quantify pathological changes in mouse models of SMA and ColQ-related CMS.

Caracterização de Junções Neuromusculares em Camundongos por Microscopia Confocal Combinada e Super-Resolução

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the ...

Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a cascade of events leading to neurotransmitter release. Moreover, changes in presynaptic calcium levels mediate the activity of many intracellular proteins and play an important role in synaptic plasticity. Studying calcium signaling is also important for finding ways to treat neurodegenerative diseases. The neuromuscular junction is a suitable model for studying synaptic plasticity, as it has only one type of neurotransmitter. This article describes the method for loading a calcium-sensitive dye through the cut nerve bundle into the mice's motor nerve endings. This method allows the estimation of all parameters related to intracellular calcium changes, such as basal calcium level and calcium transient. Since the influx of calcium from the cell exterior into the nerve terminals and its binding/unbinding to the calcium-sensitive dye occur within the range of a few milliseconds, a speedy imaging system is required to record these events. Indeed, high-speed cameras are commonly used for the registration of fast calcium changes, but they have low image resolution parameters. The protocol presented here for recording calcium transient allows extremely good spatial-temporal resolution provided by confocal microscopy.

The protocol describes the method of loading a fluorescent calcium dye through the cut nerve into mouse motor nerve terminals. In addition, a unique method for recording fast calcium transients in the peripheral nerve endings using confocal microscopy is presented.

Registro de Transintes de Cálcio na Junção Neuromuscular do Rato com Alta Resolução Temporal utilizando Microscopia Confocal

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a ...

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature vibrations of molecules. However, these vibrational signatures are also characteristic of molecules within anatomical tissue such as the brain, making it increasingly useful and applicable for Neuroscience applications. For example, CARS can measure lipids by specifically exciting chemical bonds within these molecules, allowing for quantification of different aspects of tissue, such as myelin involved in neurotransmission. In addition, compared to other techniques typically used to quantify myelin, CARS can also be set up to be compatible with immunofluorescent techniques, allowing for co-labeling with other markers such as sodium channels or other components of synaptic transmission. Myelination changes are an inherently important mechanism in demyelinating diseases such as multiple sclerosis or other neurological conditions such as Fragile X Syndrome or autism spectrum disorders is an emerging area of research. In conclusion, CARS can be utilized in innovative ways to answer pressing questions in Neuroscience and provide evidence for underlying mechanisms related to many different neurological conditions.

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy CARS Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Visualizing myelination is an important goal for many researchers studying the nervous system. CARS is a technique that is compatible with immunofluorescence that can natively image lipids within tissue such as the brain illuminating specialized structures such as myelin.

Aplicação coerente de espectroscopia Raman anti-Stokes (CARS) para mielinização por imagem em fatias cerebrais

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of structural changes caused by genetic or environmental perturbations. Whole-brain imaging results in more accurate quantification of cells and the study of region-specific differences that may be missed with commonly used microscopy of physically sectioned tissue. Using light-sheet microscopy to image cleared brains greatly increases acquisition speed as compared to confocal microscopy. Although these images produce very large amounts of brain structural data, most computational tools that perform feature quantification in images of cleared tissue are limited to counting sparse cell populations, rather than all nuclei.
Here, we demonstrate NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), a group of analysis tools, to quantify all nuclei and nuclear markers within annotated regions of a postnatal day 4 (P4) mouse brain after clearing and imaging on a light-sheet microscope. We describe magnetic resonance imaging (MRI) to measure brain volume prior to shrinkage caused by tissue clearing dehydration steps, tissue clearing using the iDISCO+ method, including immunolabeling, followed by light-sheet microscopy using a commercially available platform to image mouse brains at cellular resolution. We then demonstrate this image analysis pipeline using NuMorph, which is used to correct intensity differences, stitch image tiles, align multiple channels, count nuclei, and annotate brain regions through registration to publicly available atlases.
We designed this approach using publicly available protocols and software, allowing any researcher with the necessary microscope and computational resources to perform these techniques. These tissue clearing, imaging, and computational tools allow measurement and quantification of the three-dimensional (3D) organization of cell-types in the cortex and should be widely applicable to any wild-type/knockout mouse study design.

This protocol describes methods for conducting magnetic resonance imaging, clearing, and immunolabeling of intact mouse brains using iDISCO+, followed by a detailed description of imaging using light-sheet microscopy, and downstream analyses using NuMorph.

Imagem de célula única de cérebro inteiro e análise de cérebros de camundongos neonatais intactos usando ressonância magnética, limpeza de tecidos e microscopia de folha de luz

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

Imaging the Aging Cochlea with Light-Sheet Fluorescence Microscopy

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or presbycusis is a primary cause of sensorineural hearing loss and is characterized by damage to hair cells, spiral ganglion neurons (SGNs), and the stria vascularis. These structures reside within the cochlea, which has a complex, spiral-shaped anatomy of membranous tissues suspended in fluid and surrounded by bone. These properties make it technically difficult to investigate and quantify histopathological changes. To address this need, we developed a light-sheet microscope (TSLIM) that can image and digitize the whole cochlea to facilitate the study of structure-function relationships in the inner ear. Well-aligned serial sections of the whole cochlea result in a stack of images for three-dimensional (3D) volume rendering and segmentation of individual structures for 3D visualization and quantitative analysis (i.e., length, width, surface, volume, and number). Cochleae require minimal processing steps (fixation, decalcification, dehydration, staining, and optical clearing), all of which are compatible with subsequent high-resolution imaging by scanning and transmission electron microscopy. Since all the tissues are present in the stacks, each structure can be assessed individually or relative to other structures. In addition, since imaging uses fluorescent probes, immunohistochemistry and ligand binding can be used to identify specific structures and their 3D volume or distribution within the cochlea. Here we used TSLIM to examine cochleae from aged mice to quantify the loss of hair cells and spiral ganglion neurons. In addition, advanced analyses (e.g., cluster analysis) were used to visualize local reductions of spiral ganglion neurons in Rosenthal&#39;s canal along its 3D volume. These approaches demonstrate TSLIM microscopy&#39;s ability to quantify structure-function relationships within and between cochleae.

A light-sheet microscope was developed to image and digitize whole cochlea.

Imagem da Cóclea Envelhecida com Microscopia de Fluorescência de Folha de Luz

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or ...

Alinhamento de Fibra de OCT de Retina de Camundongo com Imagens Confocais

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has been increasingly applied to obtain an objective assessment of neural damage in eye diseases. Ex vivo confocal imaging of the same retina is often necessary to validate the in vivo findings especially in animal research. In this study, we demonstrated a method for aligning an ex vivo confocal image of the mouse retina with its in vivo images. A new clinical-ready imaging technology called visible light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) was applied to acquire in vivo images of the mouse retina. We then performed the confocal imaging of the same retina as the &#34;gold standard&#34; to validate the in vivo vis-OCTF images. This study not only enables further investigation of the molecular and cellular mechanisms but also establishes a foundation for a sensitive and objective evaluation of neural damage in vivo.

Autor em destaque: Avanços na imagem da retina in vivo e ex vivo para melhorar o diagnóstico e o tratamento do glaucoma 

The present protocol outlines the steps for aligning in vivo visible-light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) images with ex vivo confocal images of the same mouse retina for the purpose of verifying the observed retinal ganglion cell axon bundle morphology in the in vivo images.

Alinhamento de Fibrogramas de Tomografia de Coerência Óptica com Luz Visível com Imagens Confocais da Mesma Retina de Camundongo

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...