A investigação conducente a estes resultados foi financiada pelo Sétimo Programa-Quadro da União Europeia (FP7/2007-2013) sob acordos de subvenção n. 228334 e 241526. Este projeto de pesquisa tem sido também apoiada pela Human Frontier Science Program bolsa de investigação (RGP0027/2009) e pelo Ministério Italiano de Educação, Universidade e Pesquisa, no âmbito do Projeto Flagship Nanomax e pelo italiano Ministério da Saúde no âmbito do &quot;Células-Tronco Chamada para apresentação de propostas&quot;. Esta pesquisa foi realizada no âmbito das actividades de investigação do ICON fundação apoiados por &quot;Ente Cassa di Risparmio di Firenze&quot;.

1. Tissue Preparação e armazenamento <ol><li> Fix cérebro do rato através de perfusão transcardial padrão 13 com 20 ml de solução 0,01 M (PBS), tampão fosfato salino, seguida por 100 ml de paraformaldeído 4% em 0,01 M de PBS. Ajustar cuidadosamente o pH de ambas as soluções para 7.6: ligeiramente mais baixos valores do pH pode saciar a fluorescência de EGFP. </li><li> Pós-corrigir os cérebros excisadas durante a noite em paraformaldeído a 4% a 4 ° C. </li><li> Lavar duas vezes (30 min cada) em PBS 0,01 M e armazenar em 0,01 M de PBS a 4 ° C. </li></ol> 2. Desidratação e Clearing Nota: o protocolo para a desidratação e limpando segue de perto o descrito por Becker et al 10. <ol><li> Para remover os peróxidos de desidratação do solvente (tetra-hidrofurano, THF), o que fortemente extinguir a fluorescência XFP, THF filtro com base de óxido de alumínio activado (grau de actividade Brockman I, cerca de 250 g / L de THF), utilizando um cromaTOGRAPHY coluna. Evitar a quebra da coluna, o que iria reduzir a remoção de peróxido. </li><li> Adicionar estabilizador (hidroxitolueno butilado, 250 mg / L), para a solução final, mesmo se o THF já foi estabilizado antes da filtração. Estabilizador é na verdade mantida por óxido de alumínio: THF sem estabilizador podem desenvolver grandes quantidades de peróxidos e pode ser explosiva e perigosa. </li><li> Desidratar todo o cérebro de rato em uma série graduada de THF em água pura: 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%, 1 h cada, e depois 100% durante a noite. Colocar o frasco com a amostra sobre uma roda rotativa. Para evitar a exposição à luz, enrole os frascos com uma folha de alumínio. </li><li> Filtrar o solvente de limpeza (éter dibenzílico, DBE) com óxido de alumínio (activado de base, grau actividade Brockman I, cerca de 250 g / L de DBE), utilizando um funil de filtração. </li><li> Desmarque a amostra em 100% DBE. Alterar a solução depois de 3 e 6 horas. </li></ol> 3. Espécime de montagem <ol><li> Quando o cérebro parece transparente por olho (typicamente 1 hora após a segunda mudança DBE), montá-lo na placa de imagem de ponta por um dos seguintes métodos: </li><li><ol><li> Montagem direta - Suavemente mergulhar a amostra em uma das pontas (Figura 3A). </li><li> Disco de agarose - Mergulhar um disco feito de 6% de gel de agarose nas pontas. Delicadamente, corrigir a amostra no disco agarose com cola de acrílico (Figura 3b). Aguarde cerca de 1 min para a cura. </li><li> Proveta de agarose - mergulho num copo feito de 3% de gel de agarose nas pontas. Suavemente colocar a amostra sobre o fundo do copo (Figura 3c). </li></ol></li></ol> Nota 1: A montagem de taça de agarose deve ser preferido quando é importante imagem da amostra no seu conjunto, no entanto, o gel de agarose em torno da amostra dá origem à dispersão da luz adicional que poderia ser prejudicial para a qualidade da imagem. Se uma pequena parte da amostra poderiam ser excluídos da imagem, é melhor montar a especificaçãoimen no disco agarose ou diretamente na ponta. O primeiro método é o mais adequado para manter o cérebro horizontal (excluem-se imaginando uma porção ventral ou dorsal do cérebro), este último para manter o cérebro vertical (excluindo a imagem de um parte dos bulbos olfatórios ou da medula espinhal). Nota 2: o gel de agarose devem ser preparadas em água, em seguida, desidratou-se com THF (50% e 100% de 4 horas cada) e afastada em DBE 100% durante 4 horas ou até que parece claramente transparente. <ol start="3"><li> Após a montagem do espécime, seguindo um dos métodos anteriores, a posição da placa de imagem no interior da câmara de amostra, usando uma pinça. Encha a câmara com solução de limpar. </li></ol> 4. Tomografia Preparação <ol><li> Retire a fenda para recolher o máximo de fluorescência possível. </li><li> Iluminar a amostra com baixo consumo de energia do laser para evitar a fotodegradação. </li><li> Mova a amostra em três direções usando o microposicionamento syste-driven softwarem. Identificar, para cada direcção a coordenadas mínima e máxima para a qual a amostra é iluminada e está dentro do campo de visão da câmara (Figura 4a). </li><li> Insira as coordenadas acima como parâmetros para a sub-rotina &#39;Pré-tomografia. Especificar também a distância entre as pilhas adjacentes para ser utilizado na tomografia, e o passo de amostragem pré-tomografia na direcção z. </li><li> Iniciar o pré-tomografia, que coleta as imagens em cada pilha com a amostragem z especificada em (4.4). </li></ol> Nota: As imagens recolhidas são usados ​​por um software para preparar um mapa grosseiro de forma exemplar e de posição (Figura 4b), o que permite restringir a aquisição de tomografia apenas para o volume realmente ocupado pela amostra, reduzindo o tempo de imagiologia e, assim, a fotodegradação. 5. Tomografia Aquisição <ol><li> Mover a amostra fora da folha de luz utilizando o sistema de microposicionamento. </li><li> Incpotência do laser rease e parar o movimento de todos os sistemas de controlo, de modo a iluminar apenas uma linha fixa no centro do campo de visão. </li><li> Monte a fenda e alinhá-lo com sinal de autofluorescência da solução de limpeza. Deverá ver claramente a linha de fenda no centro do campo de visão. </li><li> Re-ativar o sistema de varredura, reduzir a potência do laser e passar a amostra no interior da folha de luz usando o sistema microposicionamento. Note-se que a potência do laser utilizado, com a fenda será maior do que a utilizada, sem que, uma vez que os blocos de filtros espaciais uma fracção não desprezável de luz. </li><li> Ajuste a amplitude eo deslocamento dos sistemas de digitalização e digitalizar com o software de controle, até que as imagens parecem claras e brilhantes. </li><li> Execute o programa de aquisição de tomografia, depois de definir o passo z apropriada para o experimento. O volume será fotografada em muitos paralelo, parcialmente sobrepostas pilhas (Figura 5A), e as imagens serão salvas emuma estrutura hierárquica de pastas. </li></ol> 6. Costura e Visualização <ol><li> Completar o volume adquirido com imagens em preto sintéticos (ou seja, imagens do mesmo tipo e as dimensões das recolhidos os-, mas com intensidade zero) usando um software automatizado (Figura 4c). Esta etapa é obrigatória para que o software de costura para lidar com um volume cúbico completa. </li><li> Software lançamento Vaa3D (baixado gratuitamente a partir <a href="http://www.vaa3d.org/" target="_blank">http://www.vaa3d.org/</a> ) com os plugins TeraStitcher e TeraManager instalados. </li><li> Coloque o plugin TeraStitcher. Selecione o diretório que contém o volume fotografada, indicam as orientações relativas dos eixos (em relação a uma referência destro sistema de coordenadas) e do tamanho do voxel. </li><li> Lançar a primeira parte da costura. O software irá calcular o deslocamento relativo entre casais de pilhas, e encontrar um ótimo global placement para todas as pilhas em conjunto (Figura 5b). </li><li> Selecione para salvar o volume costurado em uma única resolução ou em formato multi-resolução. Este último permite a visualização multi-resolução com o plugin TeraManager. Em ambos os casos, se a imagem de maior resolução é maior do que alguns gigabytes, selecione também a multi-pilha save modalidade e especificar o tamanho da subpilhas individuais. Isto irá permitir um acesso eficiente aos dados armazenados. </li><li> Inicie a segunda parte da costura. O software irá mesclar as pilhas alinhadas, e salvá-los no modo de multi-stack simples ou (Figuras 5c e 5d). No final fechar o plugin TeraStitcher. </li><li> Coloque o plugin TeraManager. Selecione a pasta com o volume de multi-resolução multi-empilhados, e indicam o tamanho do voxel e machados orientações. O volume será carregado na resolução mínima. </li><li> Para aumentar o zoom para uma resolução maior, selecione um marco usando o botão direito do mouse modality de Vaa3D, em seguida, ampliar o uso de rolagem do mouse. Alternativamente, você pode selecionar diretamente o ROI para fazer zoom com um clique com o botão direito, ou especificar as coordenadas do volume de interesse. </li><li> Para o zoom para uma resolução mais baixa, basta usar a rolagem do mouse. </li></ol>

<ol>
	<li>Lichtman, J. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+big+and+the+small:+challenges+of+imaging+the+brain's+circuits.">The big and the small: challenges of imaging the brain's circuits.</a> Science. 334, 618-623 (2011).</li><li>Mayerich, D., Abbott, L., McCormick, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knife-edge+scanning+microscopy+for+imaging+and+reconstruction+of+three-dimensional+anatomical+structures+of+the+mouse+brain.">Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain.</a> J. Microsc. 231, 134-143 (2008).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-optical+sectioning+tomography+to+obtain+a+high-resolution+atlas+of+the+mouse+brain.">Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain.</a> Science. 330, 1404-1408 (2010).</li><li>Gong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuously+tracing+brain-wide+long-distance+axonal+projections+in+mice+at+a+one-micron+voxel+resolution.">Continuously tracing brain-wide long-distance axonal projections in mice at a one-micron voxel resolution.</a> Neuroimage. 74, 87-98 (2013).</li><li>Ragan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+two-photon+tomography+for+automated+ex+vivo+mouse+brain+imaging.">Serial two-photon tomography for automated ex vivo mouse brain imaging.</a> Nat. Methods. 9, 255-258 (2012).</li><li>Keller, P. J., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+microscopy+of+living+or+cleared+specimens.">Light sheet microscopy of living or cleared specimens.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 22, 138-143 (2012).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).</li><li>Silvestri, L., Bria, A., Sacconi, L., Iannello, G., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+light+sheet+microscopy:+micron-scale+neuroanatomy+of+the+entire+mouse+brain.">Confocal light sheet microscopy: micron-scale neuroanatomy of the entire mouse brain.</a> Opt. Express. 20, 20582-20598 (2012).</li><li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains.">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PLoS One. 7, e33916 (2012).</li><li>Bria, A., Iannello, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TeraStitcher+-+A+Tool+for+Fast+Automatic+3D-Stitching+of+Teravoxel-Sized+Microscopy+Images.">TeraStitcher - A Tool for Fast Automatic 3D-Stitching of Teravoxel-Sized Microscopy Images.</a> BMC Bioinformatics. 13, 316 (2012).</li><li>Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V3D+enables+real-time+3D+visualization+and+quantitative+analysis+of+large-scale+biological+image+data+sets.">V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets.</a> Nat. Biotechnol. 28, 348-353 (2010).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Booth, M. J., Neil, M. A. A., Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberration+correction+for+confocal+imaging+in+refractive-index-mismatched+media.">Aberration correction for confocal imaging in refractive-index-mismatched media.</a> J. Microsc. 192, 90-98 (1998).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li><li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy.">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322, 1065-1069 (2008).</li><li>Jahrling, N., Becker, K., Schonbauer, C., Schnorrer, F., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+and+segmentation+of+intact+Drosophila+by+ultramicroscopy.">Three-dimensional reconstruction and segmentation of intact Drosophila by ultramicroscopy.</a> Front Syst. Neurosci. 4, 1 (2010).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

CLSM juntamente com a limpeza química representam uma ferramenta poderosa para estudar a neuroanatomia dos cérebros inteiros rato marcados com sondas fluorescentes, quer as proteínas ou corantes sintéticos. Uma vez que a luz emitida fora do plano focal é bloqueado por um filtro espacial física, imagens de alto contraste é possível também em amostras de espessura, mantendo as altas taxas de quadros típicos da arquitetura folha de luz. A questão principal para lidar com quando se utiliza os métodos descritos é a maximização do contraste. Na verdade, o sinal disponível é reduzida tanto por factores químicos e ópticos. Do ponto de vista químico, os procedimentos de limpeza com base em solvente orgânico pode extinguir a emissão de proteínas fluorescentes e outros corantes fluorescentes 7. Filtrou-se o solvente para remover os peróxidos, tal como descrito por Becker et al. 10, permite a manutenção de um bom nível de fluorescência também em tecidos limpou-solventes. Publicared à base de água métodos de compensação 14 não reduzem a eficiência de fluorescência, mas resultam em mais pobre transparência quando se lida com os cérebros inteiros de murino, pelo menos, com técnicas ópticas lineares. Por outro lado, no momento em que não há objetivos comerciais com distância de trabalho longa corrigidos para o alto índice de refração (n ≈ 1,56) limpando soluções utilizadas. Assim, a incompatibilidade entre o índice de refracção do meio em que a amostra é imersa e a criação de um objectivo dá origem a fortes aberração esférica. Além de reduzir a resolução do microscópio, tais aberrações resultar numa queda de intensidade e contraste da imagem, uma vez que a luz é espalhada sobre uma zona mais ampla. Possíveis soluções para esse problema incluem o uso de óptica adaptativa 15 e / ou corretores asféricas estáticas. Qualquer melhora no contraste e intensidade da imagem prontamente afeta também a velocidade de imagem, uma vez que uma menor emtempo gração por imagem pode ser escolhido. No momento CLSM pode proporcionar uma velocidade de imagem de cerca de 10 6 um 3 / seg, com um tempo de exposição da câmara de 100 mseg 9. Nessa velocidade que leva 1-3 dias para imagem inteira um cérebro do rato, dependendo do tamanho da amostra. Embora nenhuma degradação significativa na qualidade da imagem é observada em toda a sessão de imagens, tais muito tempo, principalmente por causa da baixa fotodegradação intrínseca da iluminação folha de luz 6, o longo tempo necessário para uma única imagem do cérebro do rato poderia na prática reduzir a aplicabilidade da CLSM. Um aumento de 10 vezes na eficiência de sistema, juntamente com o uso de uma câmara de alta velocidade para a detecção, iria reduzir o tempo de imagiologia de várias horas, o que permite uma utilização de rotina do protocolo descrito. Apesar de todas as limitações acima referidas, a imagem latente CLSM acoplado a compensação química dos tecidos permite reconstruir cérebros inteiros rato com resolução de micro-escala em menos de umsemana. Outros métodos ópticos para a imagem latente do cérebro inteiro pagar maior resolução do que CLSM, mas ao preço de mais preparação e / ou tempo de imagem 2-4, ou de um z amostras dispersas 5. Os métodos descritos neste artigo podem ser utilizados em combinação com diferentes estratégias de marcação fluorescente: animais transgénicos que expressam proteínas fluorescentes em subconjuntos neuronais, transfecção viral, injecção intraparenquimatosa corante, etc, na prática, todas as estratégias de coloração anteriores sacrifício dos animais são compatíveis com CLSM . Na verdade, o post-mortem fluorescente rotulagem de cérebros inteiros do rato não foi demonstrado até agora, de qualquer forma, se esse tipo de coloração seria possível em um futuro próximo, o número de amostras que podem ser reconstruídos com CLSM vai se tornar muito maior, incluindo potencialmente o tecido cerebral humano. Em conclusão, a microscopia confocal folha de luz utilizados em combinação com tisclearing sue e multi-resolução de gerenciamento de dados pode permitir aos pesquisadores reconstruir e analisar amostras macroscópicas com resolução em escala mícron, com esforços tecnológicos que estão bem na mão da maioria dos laboratórios. As aplicações potenciais de CLSM são, evidentemente, não se limitando a neurociência, mas abrange todos os campos de investigação em que a microscopia folha de luz já foi usado, como a embriogênese 16,17 e anatomia de pequenos animais 18.

Quando comparado com a nossa compreensão dos mecanismos moleculares e celulares da função cerebral subjacente, o nosso conhecimento da neuroanatomia multa ainda parece em sua infância 1. Na verdade, ainda não temos mapas detalhados da posição do somata neuronal ou de projeções de longo alcance em todo o cérebro. Na verdade, muitos esforços tecnológicos são dedicados a reconstruir o cérebro do rato com resolução microscópica. Métodos ópticos baseados em cortes seriados de amostras incluídas em resina, como faca-Edge Microscopia (KESM) 2, Micro-Optical Seccionamento Tomography (MOST) 3 e fluorescência-MOST (fMOST) 4, pode fornecer sub-mícron resolução tridimensional imagens dos cérebros inteiros do mouse. No entanto, o tempo total necessário para a preparação e tratamento de imagens de uma única amostra é da ordem de várias semanas, o que limita a sua aplicação prática de tais métodos. Outra técnica baseada em cortes seriados (mas sem resina incorporação), Serial doisTomografia Photon (STP) 5, permite resolução tridimensional de alta imagem. No entanto, esta técnica tem sido demonstrado em ratos cérebros inteiros apenas com uma amostragem muito escassa, a coleta de uma seção a cada 50 mm 5, e para o nosso conhecimento STP ainda não produziu uma reconstrução a amostragem completa de um cérebro murino. Um método óptico de ponta para reconstruir peças inteiras em três dimensões em alta velocidade é a microscopia folha de luz 6. Neste esquema óptico a amostra é iluminada com uma folha fina de luz e a emissão de fluorescência é recolhido ao longo de um eixo perpendicular ao plano de iluminação. Desta forma, apenas fluoróforos em foco está animado e é possível alcançar o corte óptico na configuração vasto campo, garantindo altas taxas de quadros. Quando acoplado a limpar protocolos baseados na substituição da água com um índice de refracção de líquido correspondente 7, microscopia folha de luz foi aplicado aespécimes macroscópicos, como rato cérebros inteiros 8. No entanto, a amostra induzida por espalhamento de luz, o que afeta as amostras ainda apuradas, degrada a folha de luz que leva à excitação dos fluoróforos fora de foco, que acrescenta um total indefinição das imagens adquiridas. Para coletar seletivamente apenas fótons em foco, que recentemente juntamente iluminação folha de luz a um esquema de detecção confocal 9. Na microscopia confocal folha de luz (CLSM), out-of-focus e fótons espalhados são rejeitados por um filtro espacial linear (cortar) antes da detecção (Figura 1). Para realizar a operação confocal em arquitectura folha de luz, a iluminação é produzido por meio de uma linha de exploração, e um sistema de varrimento de no caminho detecção cria uma imagem estática da linha de exploração de excitação no local da fenda. Um terceiro sistema de digitalização reconstrói uma imagem bidimensional no sensor da câmara. CLSM proporciona um realce de contraste de 100% no rato apuradascérebros com relação à microscopia convencional folha de luz, mantendo uma taxa de 10 Hz quadro. Com CLSM é possível reconstruir cérebros inteiros rato com resolução de 2 m em XY e 9 mM de Z, e com contraste suficiente para discernir neurônios único fluorescente etiquetado. Neste artigo descrevemos o gasoduto experimental para reconstruir um cérebro de camundongo com CLSM. Cérebro do rato fixa-aldeído são desidratados numa série graduada de tetrahidrofurano isento de peróxido, e subsequentemente libertadas em éter isento de peróxido de dibenzilo (Figura 2), seguindo o protocolo desenvolvido por Becker et al. 10 A amostra limpa é então cuidadosamente montada sobre um derrubado placa e posicionado na câmara de imagem de uma folha confocal microscópio de luz feito por encomenda. A amostra pode ser directamente montado mergulhando-o sobre uma ponta da placa (Figura 3a), em alternativa, pode ser colada sobre um disco de gel de agarose afastada (figura3b) ou colocado na cavidade de um copo feito de gel de agarose eliminado (Figura 3c). Uma tomografia óptica de todo o cérebro é então realizada, como várias pilhas paralelas adjacentes são adquiridos para cobrir todo o volume do cérebro (Figura 4). Uma amostragem pré-tomografia, que produz um mapa grosseiro da posição e da forma da amostra, garante que a imagem é realizada apenas no volume ocupado pela amostra. As pilhas de tomografia são posteriormente costuradas com software feito por encomenda e salvas em um multi-resolução esquema hierárquico 11. Rato cérebros podem, eventualmente, ser explorada com software multi-resolução de visualização do Google Maps-como protótipo. Ambos os instrumentos de software são integrados como plugins na plataforma open-source Vaa3D 12. Mostramos finalmente imagens representativas do cérebro do rato para demonstrar as capacidades do gasoduto experimental descrito no estudo neuroanatom murino finay.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P4417_100TAB</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraformaldehyde</td>
 <td>Agar Scientific</td>
 <td>R1018</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peroxide-free Tetrahydrofuran</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>186562</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aluminum oxide activated, basic, Brockmann I</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>199443</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dibenzyl ether</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>108014</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Butylated hydroxytoluene</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>W218405 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose Type III-A, High EEO</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9793</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acrylic glue</td>
 <td>Bostik</td>
 <td>D2498</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vaa3D software</td>
 <td>open source</td>
 <td></td>
 <td>freely downloadable from <a href="http://www.vaa3d.org/" target="_blank">http://www.vaa3d.org/</a> </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

micron-scale resolution optical tomography of entire mouse brains with confocal light sheet microscopy

Compreender a arquitetura do cérebro dos mamíferos na resolução de uma única célula é uma das questões-chave da neurociência. No entanto, o mapeamento soma neuronal e projeções ao longo de todo o cérebro ainda é um desafio para as tecnologias de imagem e gerenciamento de dados. Na verdade, os volumes macroscópicas precisa ser reconstruído com alta resolução e contraste em um tempo razoável, produzindo conjuntos de dados na faixa TeraByte. Recentemente demonstramos um método óptico (microscopia confocal luz folha, CLSM) capaz de obter reconstrução micro-escala dos cérebros inteiros rato marcados com reforçada proteína verde fluorescente (EGFP). Combinando iluminação folha de luz e detecção confocal, CLSM permite imagens profundamente dentro de espécimes desmatadas macroscópicas com alto contraste e velocidade. Aqui nós descrevemos o gasoduto experimental completa para obter imagens completas e legíveis de cérebros inteiros rato marcados com proteínas fluorescentes. A compensação ea montagem pROCEDIMENTOS são descritos, em conjunto com os passos para realizar uma tomografia óptica em todo o seu volume através da aquisição de várias pilhas adjacentes paralelas. Nós mostramos o uso de ferramentas de software sob medida de código aberto que permite a costura das várias pilhas e navegação de dados multi-resolução. Finalmente, ilustramos alguns exemplos de mapas cerebrais: o cerebelo de um ratinho transgénico L7-GFP, em que todas as células de Purkinje são rotulados selectivamente, e todo o cérebro de um rato Thy1-GFP-M, caracterizado por uma marcação neuronal esparso aleatória.

O protocolo descrito pode ser usado para reconstituir com resolução tanto cérebros inteiros de rato escala mícron ou partes excisadas, sem a necessidade de corte físico. Como resultado representativo, na Figura 6 todo o cerebelo de um rato L7-GFP (dia pós-natal 10) é mostrado. Neste animais todos os neurônios de Purkinje são rotulados com EGFP. Se se aumentar o zoom, a estrutura lamelar típica do córtex cerebelar pode ser visto (Figura 7). Além disso zoom in permite distinguir claramente cada soma de células de Purkinje (Figura 8). O protocolo descrito pode, assim, ser utilizado para rastrear organização espacial neuronal em vários estudos de neurodesenvolvimento. Como um segundo resultado representativo, apresentamos imagens do cérebro de um adulto unsectioned Thy1-GFP-M mouse. Neste animal transgénico EGFP é expressa num subconjunto neuronal esparso aleatória. A metade direita do cérebro é mostrada na Figura 9 em. Como nósaumentar-se ainda mais e ainda (Figuras 10 e 11), os processos neuronais tornar distinguíveis. Este resultado demonstra que o protocolo descrito permite resolução de imagem micro-escala em cérebros inteiros adulto do rato, abrindo a possibilidade de estudar a anatomia do cérebro inteiro em resolução de celular em modelos de ratos com doença neurodegenerativa. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig1.jpg" /> Figura 1. Sistema óptico de microscopia confocal folha de luz (CLSM). (A) Vista superior do aparelho, mostrando o caminho de excitação. Emissão do laser de um sólido de laser 488 nm diodo-bombeado estado (DPSS), após a expansão e colimação por um primeiro telescópio, entra um filtro sintonizável acústico-ótico (AOTF) que regula a intensidade do feixe. Em seguida, um segundo telescópio amplia ainda mais o raio. Um espelho galvo verticalmente (ao longo y) varre a ser<html> am, o qual é focado por uma lente dentro da câmara de amostras. (b) Vista lateral do aparelho, que mostra o percurso de detecção. Luz coletadas pelo objectivo de detecção é verticalmente descanned por um espelho galvo e focalizado por uma lente, produzindo uma imagem fixa da linha de excitação em movimento. Na posição da imagem fixa um filtro espacial linear (ranhura) é colocado. Depois da fenda, um espelho galvo colocado dentro de um sistema de lentes 4f reconstrói uma imagem 2-dimensional sobre o chip de um dispositivo de carga acoplada multiplicação de electrões (EM-CCD). Um filtro passa-banda de fluorescência remover toda a luz de excitação de rua antes da detecção. Raios representativas de excitação, detecção e detecção de luz filtrada-passa-banda são representadas por raios, luz azul e verde azul, respectivamente. São indicadas as distâncias focais de todas as lentes realmente utilizados no microscópio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50696/50696fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . jove_content &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig2.jpg" /> Compensação Figura 2. Espécime. Rato cérebros fixados em formaldeído, que são armazenadas em PBS a 0,1 M a 4 ° C (a), são desidratados numa série graduada de tetrahidrofurano (THF, b) e subsequentemente libertadas em 100% de éter de dibenzilo (DBE , c). A etapa de desidratação provoca também algum encolhimento do tecido. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig3.jpg" /> Figura 3. Espécime de montagem para imagiologia MCVL. Apuradas O cérebro pode ser mergulhados directamente sobre a placa de montagem com ponta (um), colado num disco de agarose apagadas (b), ou inserido num copo de agarose apagadas (c). Figura 4. Aquisição Tomography. Os pré-tomografia amostras de rotina um paralelepípedo que contém o cérebro (a) para definir o número ea duração das pilhas adjacentes paralelas necessárias para a imagem toda a amostra (b). Depois de tomografia, imagens a preto são gerados para completar o volume adquirido virtual para um paralelepípedo (c). <img alt="Figura 5" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig5.jpg" /> Figura 5. Volume de costura. Imagem coletadas pilhas se sobrepõem parcialmente entre si (a), permitindo que o seu alinhamento preciso com o plugin TeraStitcher (b). O plugin mescla as pilhas alinhadas em um único stack (c) ou multi-stacked (d) representação multi-resolução. <img alt="Figura 6" fo:conteint-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig6.jpg" /> Figura 6. Cerebelo inteiro de um rato P10 L7-GFP, em que todos os neurónios de Purkinje são rotulados com EGFP. Barra de escala, de 1 mm. <img alt="Figura 7" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig7.jpg" /> Figura 7. Zoom-in de uma porção do cerebelo mostrado na Figura 6, que mostra a estrutura típica lamelar do córtex cerebelar. Barra de escala, de 500 um. <img alt="Figura 8" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig8.jpg" /> Figura 8. Além disso zoom do de uma porção do cerebelo mostrado na Figura 6. Das células de Purkinje soma pode ser claramente distinguired. Barra de escala, 200 mM. <img alt="Figura 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig9.jpg" /> Figura 9. A metade direita do cérebro de um rato adulto Thy1-GFP-M, caracterizada por uma escassa inespecífica neuronal EGFP rotulagem. Barra de escala, de 1 mm. <img alt="Figura 10" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig10.jpg" /> Figura 10. Aumentar-se de uma porção da metade do cérebro mostra a Figura 9, que mostra a parte do hipocampo e do córtex. Barra de escala, de 200 um. <img alt="Figura 11" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig11.jpg" /> Figura 11. Além disso zoom-em de uma porção da metade do cérebro mostra a Figura 9. Vários neurites no córtex podem ser claramente distinguidos. Barra de escala, 50 um.

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Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Neste artigo vamos descrever o procedimento experimental completo para reconstruir, com alta resolução, a anatomia do cérebro multa de cérebros fluorescente etiquetado do mouse. O protocolo descrito inclui preparação de amostras e limpeza, espécime de montagem para a imagem latente, os dados de pós-processamento e visualização multi-escala.

Micron escala Resolução óptica Tomografia de todo cérebro do rato com confocal Luz Folha de Microscopia

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

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Neuroscience

16.5K visualizações.  European Laboratory for Non-linear Spectroscopy (LENS).  Neste artigo vamos descrever o procedimento experimental completo para reconstruir, com alta resolução, a anatomia do cérebro multa de cérebros fluorescente etiquetado do mouse. O protocolo descrito inclui preparação de amostras e limpeza, espécime de montagem para a imagem latente, os dados de pós-processamento e visualização multi-escala. 