Wir möchten Jacob Solis für seine Hilfe bei der Videobearbeitung danken. Diese Arbeit wurde zum Teil durch einen NSF CAREER Award DBI-0953902 bis MJ Levene finanziert.

Ein. Tierische Perfusion 5 und Whole Maushirn Clearing <ol><li> Die gesamte Dauer des Verfahrens kann in Abhängigkeit von der Länge der Zeit pro Dehydratisierungsschritt verwendet, aber insgesamt der gesamte Prozess kann in zwei Tagen durchgeführt werden. </li><li> Wiegen YFP Mäusen und dann intensiv mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin / Xylazin (100 mg / kg: 10 mg / kg) anästhesiert. </li><li> Bestätigen einer chirurgischen Ebene tiefer Narkose, bevor eine Operation. Überprüfen Sie das Tier alle 5 min zu sehen, ob es zu einer festen Fuß oder Schwanz Prise reagiert. Wenn das Tier reagiert, wird eine zusätzliche Dosis (1/3 der ursprünglichen Dosis) von Ketamin / Xylazin erforderlich. </li><li> Einmal tief narkotisiert, zügeln die Maus durch die Einhaltung jedes Glied an einem chirurgischen Bett mit Labor-Band, so dass die Maus in Rückenlage (dorsal recumbancy), Aussetzen der Brust für die Chirurgie. Die chirurgische Bett ist in der Regel aus einem Metall-oder Kunststoff-Mesh und in ein Waschbecken oder auf einem Lippen-Pfanne, so dass Blut und FixiermittelAbfälle können leicht gesammelt werden. </li><li> Um zu beginnen, einen Einschnitt unter dem Xyphoid Prozess. Schneiden Sie entlang der Basis des Brustkorbs mit einer Schere und Pinzette und ziehen zurück Haut als der Schnitt gemacht. Make zwei Schnitte entlang beiden Seiten des Brustbeins Maus (durch die Rippen), um eine Klappe des Gewebes, die sich von der Brusthöhle unter Verwendung einer Gefäßklemme zu verlassen das Herz freigelegt gehalten erstellen. </li><li> Einfügen einer 23 g Nadel in den linken Ventrikel des Herzens und einen kleinen Einschnitt in den Muskel Wand des rechten Atriums, damit Blut zu entkommen. Siehe Artikel 2497 für ein Video von diesem Verfahren Jupiter. 5 </li><li> Unmittelbar nach dem rechten Vorhof geschnitten wird, beginnt eine Perfusion mit 4 ° C phosphatgepufferter Salzlösung, PBS (pH 7,2), bis Blut nicht mehr eingehalten werden Ablassen aus dem rechten Vorhof des Herzens (30 - 40 ml bei einer Geschwindigkeit von etwa 5 ml / min). </li><li> Sobald das Blut abgelassen wurde (austretende Flüssigkeit in den rechten Vorhof ist klar), schalten Sie das Perfusionsmedium zu einer gekühlten 4%PFA-Lösung. Perfundieren bis die Maus Körper wird spürbar starr und kalt anfühlt (ca. 30 - 40 ml mit einer Rate von etwa 5 ml / min). (Concentrated 16% PFA-Lösung ist nach den Anweisungen des Herstellers und NaOH zugegeben, bis pH 7,2 erreicht ist verdünnt. Handschuhe und einen Laborkittel und zu handhaben und mischen Chemikalien im Inneren einer Abzugshaube.) </li><li> Nach der Perfusion, entfernen Sie die Maus aus der chirurgischen Bett und enthaupten, um die Entfernung des Gehirns beginnen. </li><li> Mit einer Pinzette und Iris Schere, entfernen Sie den Schädel in kleine Abschnitte ab der Rückseite des Schädels und vorwärts. Machen Sie kleine Schnitte alle 2 - 4 mm mit der Schere über den Schädel während der Verwendung der Pinzette vorsichtig den Knochen weg vom Gehirn in kleinen Abschnitten. Dies tun, bis die gesamte obere Oberfläche des Gehirns ausgesetzt ist. </li><li> Excise das Gehirn aus dem Schädel mit einem 5 mm breiten, flachen Spachtel und Ort in einem Glasfläschchen. Eintauchen in 4% PFA für 6 Stunden bei 4 ° C für post Fixierung. </li><li> Nach BeitragFixierung, waschen das Gehirn zweimal bei Raumtemperatur PBS durch Eingießen der PFA aus der Glasflasche und ersetzt sie mit PBS. Swirl das Gehirn in PBS Lösung vor Ausgießen und Ersetzen mit PBS für eine zweite Wäsche. </li><li> Dehydratisieren das Gehirn bei Raumtemperatur durch eine abgestufte Reihe von Ethanol Inkubationen (einmal in 50%, 70%, 95%, und zweimal in 100%) bei 2 hr pro Inkubation und dann 12 h bei der zweiten 100% Ethanol Inkubation um Extrahieren des Wassers aus dem festen Gewebe. Für jede Inkubationszeit, gieße die vorherige Ethanol-Lösung aus dem Glasfläschchen und ersetzen Sie es mit der anschließenden Lösung, bis das Gehirn vollständig untergetaucht ist. </li><li> Nach der zweiten Inkubation in 100% Ethanol, gieße die Lösung und ersetzen mit gleichen Teilen Ethanol und Clearing-Lösung mit Benzylalkohol und Benzylbenzoat (1:2 vol: vol-Verhältnis). Nach 2 Stunden Inkubation, dekantieren dieser Lösung und Ersetzen mit einer 100% igen Lösung von Benzylalkohol und Benzylbenzoat (1:2 vol: vol-Verhältnis). Die refractive Index des Clearing-Lösung ist n = 1,54. </li><li> Einmal in BABB, wird das Gehirn spürbar transparent, in 4 - 5 Stunden. Für beste Clearing Ergebnisse, lassen das Gehirn für 6 Tage bei Raumtemperatur klar, während aus dem hellen Licht abgeschirmt. </li></ol> 2. Mikroskop-Setup <ol><li> Sobald das Gehirn wird gelöscht und wartet auf Bildgebung mit Hilfe bringt es auf den Boden der Petrischale mit einem Cyanoacrylat. Lassen Sie den Kleber, bevor Sie fortfahren trocknen. </li><li> Nach dem Trocknen, tauchen das Gehirn in BABB und legen Sie die Petrischale unter dem Mikroskop-Objektiv für die Bildgebung. </li><li> Wir verwenden ein Multiphotonen-Mikroskop, das einen Mai Tai Titan-Saphir-Laser zwischen einer 710 nm bis 990 nm Anregungswellenlänge enthält. Die Anregungswellenlänge wir verwenden, um YFP-Signale erzeugen, ist 886 nm. Laserleistung variiert von 30 bis 100 mW je Bildtiefe. </li><li> Nehmen Sie das reflektierte Fluoreszenzsignal mit einer Nikon 5X Objektiv (NA, 0,5), die für große ermöglichtfield-of-view Bildgebung (2 x 2 mm). </li><li> Filtern der reflektierten fluoreszierenden Signals unter Verwendung eines 535/50 Bandpass-Filter und sammeln sie unter Verwendung einer GaAsP PMT (H7422PA-40, Hamamatsu, Bridgewater, New Jersey). </li><li> Prozess Bilder mit scanimage Software 6 bei einer Auflösung von 2048 x 2048 Pixel mit einer Abtastrate von 2 ms pro Zeile, um hochauflösende, YFP Bilder zu erzeugen. </li><li> Sobald Bildgebung abgeschlossen ist, entfernen das Gehirn aus der Petrischale mit einer Pinzette und lagern BABB von Licht für die Zukunft Bildgebung abgeschirmt. Für Proben verklebt, entfernen das Gewebe durch Ausführen einer Rasierklinge zwischen dem Klebstoff und der Petrischale mit einem Winkel nicht größer als 30 Grad ist. Wir haben Proben in BABB gespeichert bis zu 1 Jahr ohne sichtbare Verschlechterung. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse Die repräsentativen Bilder und Videos hier gezeigten belegen die hohe Auflösung Multiphotonen-Imaging-Fähigkeit ermöglicht durch optische Lichtung. Whole-Brain-Imaging ermöglichtfür YFP-markierten Neuronen in den verschiedenen Schichten des Hippocampus und Kortex deutlich sichtbar sein, so tief wie 2 mm unterhalb der Gewebeoberfläche. Abbildung 1 zeigt ein repräsentatives Bild eines koronalen Ansicht entsprechend den anatomischen Merkmalen des Hippocampus bei 2,92 mm caudal zum Bregma 7. Die Tiefe der Bildgebung in der Probe betrug 1,94 mm. Einige dieser Unterschied war aufgrund der Entfernung des Kleinhirns am kaudalen Ende des Gehirns und der Rest war aufgrund von Schrumpfung aus dem Dehydratationsverfahren. Ein weiteres Bild aus dem Stapel zeigt Schicht V / VI Pyramidenzellen des Neokortex Ausdruck YFP 2 mm unterhalb der Gewebeoberfläche (Abbildung 2). Alle Bilder wurden mit der Nikon 5X objektive und Vergrößerung fertig war mit dem digitalen Zoom-Funktion für die Bildaufnahme in scanimage Software. Durch Vergrößern des Neocortex, sind die einzelnen Axone und Neuron Zellkörper der Pyramidenzellen in Layer V des Neokortex klarely unterscheidbaren bis 1,02 mm unter der Gewebeoberfläche (Abbildung 3). Mit dem Bildstapel aus Abbildung 3 wurde eine 3D-Rekonstruktion des Neurons Region gemacht mit ImageJ-Software 8 (Abbildung 4). Das hochauflösende Fähigkeit MPM erlaubt uns auch Bilder insgesamt, einzelne Neuronen zu präsentieren. Hier zeigen wir, eine Rekonstruktion einer Schicht V pyramidalen Neuronen der Großhirnrinde, in denen einzelne dendritischen Prozesse deutlich sichtbar sind (Abbildung 5). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig1.jpg" /> Abbildung 1 Repräsentative Bild aus einer 1,2 mm Bildstapels (0,8 - 2 mm unterhalb der Gewebeoberfläche). Ganzer Mäusehirn Neokortex und zeigt die verschiedenen Schichten des Hippocampus. Kennzeichen des Hippocampus sind sichtbar 1,1 mm unterhalb der Gewebeoberfläche und wurden unter Verwendung der markierten Followten Code:. DG = Gyrus dentatus, GrDG = Körnerschicht DG, Lmol = lacunosum moleculare Schicht Mol = molekulare Schicht DG, Or = oriens Schicht PoDG = polymorphe Schicht DG, Py = pyramidalen Zellschicht, Rad = Stratum radiatum 7 Das Bild ist 1,8 x 1,8 mm in der Größe, Maßstab = 200 um. Die rostralen Ende des Gehirns wurde in eine Petrischale mit der kaudalen Ende nach oben in Richtung des Ziels befestigt. Dies erleichterte Bildgebung in der Frontalebene. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig2.jpg" /> Abbildung 2 Repräsentative Rahmens vom 1,2 mm Bildstapels (0,8 - 2 mm unterhalb der Gewebeoberfläche). Ganzer Mäusehirn Hervorhebung der Großhirnrinde. Pyramidenzellen und Prozesse exprimieren YFP in Schicht V / VI des Cortex sichtbar sind 2 mm unterhalb der Gewebeoberfläche. Der Grad der Kennzeichnung steht im Einklang mit früheren Berichten des spärlichen Kennzeichnung in der Großhirnrinde. 9 Inset (rechts) von b vergrößert<html> oxed Bereich auf der linken Seite. Das Bild ist 1,8 x 1,8 mm in der Größe, Maßstab = 200 um (50 um Kasten). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig3.jpg" /> Abbildung 3. Repräsentative Rahmens 774 um unterhalb der Gewebeoberfläche aus dem Bildvolumen der Schicht V pyramidalen Neuronen in der Großhirnrinde des Gehirns entnommen. Stack geht von 700 um bis 1.020 um unterhalb der Gewebeoberfläche. Ein 8-fachem Digitalzoom verwendet wurde, um Details wie feine Prozesse zu erfassen. Das Bild ist 225 x 225 um Größe, Maßstab = 20 um. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig4.jpg" /> Abbildung 4. Repräsentatives Bild der 3D-Rekonstruktion (225 x 225 x 320 um) der Bildstapel in Abbildung 3. Das Bild ist 225 x 225 um Größe, Maßstab = 28 um. s &quot;&gt; <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig5.jpg" /> Abbildung 5. Hochauflösende rekonstruierten Bildes einer Schicht V Pyramidenzellen Neuronen des Neocortex mit einem 10x digitalen Zoom. Neuron misst 485 um in der Länge, Maßstab = 25 um. Das Sichtfeld für jedes Bild Fliese 180 um x 180 um. Jede Fliese ist in unterschiedlicher Tiefe (z-Ebene). Die kortikalen apikalen Dendriten nicht im allgemeinen ausdrückliche YFP sowie der Soma. Um beide im selben Sichtfeld haben, wie hier gezeigt, die Macht abgesenkt wurde bis zur Sättigung von Soma zu minimieren; dies macht den feinen Verfahrens Blick Dimmer. Unser Schwerpunkt hier war die Demonstration field-of-view anstatt feinen Details. Um feinere Details verraten, verwenden Sie einen digitalen Zoom, Fokus auf eine Region ohne Soma und erhöhen die Laserleistung.

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	<li>Parra, S. G., Chia, T. H., Zinter, J. P., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+microscopy+of+cleared+mouse+organs.">Multiphoton microscopy of cleared mouse organs.</a> J. Biomed. Opt. 15, 036017 (2010).</li><li>Vesuna, S., Torres, R., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+fluorescence,+second+harmonic+generation,+and+fluorescence+lifetime+imaging+of+whole+cleared+mouse+organs.">Multiphoton fluorescence, second harmonic generation, and fluorescence lifetime imaging of whole cleared mouse organs.</a> J. Biomed. Opt. 16, 106009 (2011).</li><li>Zucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+insect+and+mammalian+embryo+imaging+with+confocal+microscopy:+Morphology+and+apoptosis.">Whole insect and mammalian embryo imaging with confocal microscopy: Morphology and apoptosis.</a> Cytometry. A69, 1143-1152 (2006).</li><li>Sakhalkar, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+in+bulk+tissue+specimens+using+optical+emission+tomography:+Fluorescence+preservation+during+optical+clearing.">Functional imaging in bulk tissue specimens using optical emission tomography: Fluorescence preservation during optical clearing.</a> Phys. Med. Biol. 52, 2035-2054 (2007).</li><li>Dazai, J., Spring, S., Cahill, L. S., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-mouse+Neuroanatomical+Magnetic+Resonance+Imaging.">Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging.</a> J. Vis. Exp. (48), e2497 (2011).</li><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed. Eng. Online. 2, (2003).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).</li><li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+with+ImageJ.">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Neuronal+Subsets+in+Transgenic+Mice+Expressing+Multiple+Spectral+Variants+of+GFP.">Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Hama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neuro. 14, 1481-1488 (2011).</li></ol>

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Regelungen, die durch Institutional Tier Yale University Care &amp; Use Committee eingerichtet durchgeführt.

Während herkömmliche organische Farbstoffe kompatibel mit einer Reihe von organischen Lösungsmitteln sind, und daher nicht stellen eine besondere Herausforderung für das Clearing von Protokollen, sind fluoreszierende Proteine ​​oft weniger tolerant Veränderungen in Lösungsmittel. 4 Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine ernsthafte Einschränkung zu überwinden bisherigen optischen Clearing Protokolle, bei denen Fluoreszenz XFPs verloren oder wurde stark beeinträchtigt. Die Bilder, die hier v...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Phosphate Buffered Saline </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> D8537 </td><td> 500 ml, pH 7,2 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15710 </td><td> 10 x 10 ml, 16% Paraformaldehyd </td></tr><tr><td> Ethylalkohol </td><td> Amerikanischen Bioanalytical </td><td> AB00515-00500 </td><td> 500 ml, 200 proof </td></tr><tr><td> Ethylalkohol </td><td> Pharmco Products, Inc. </td><td> 111000190 </td><td> 1 gal., 190 proof </td></tr><tr><td> Benzylalkohol </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> 402834 </td><td> 500 ml, 99 +% </td></tr><tr><td> Benzylbenzoat </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> B6630-IL </td><td> 500 ml, ≥ 99% </td></tr><tr><td> 5X/0.5 NA Ziel </td><td> Nikon </td><td> AZ-Plan Flour 5X </td><td> 15 WD </td></tr></tbody></table>

multiphoton microscopy of cleared mouse brain expressing yfp

Mehrphotonenmikroskopie intrinsischer Fluoreszenz und Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG) von ganzen Mausorganen ermöglicht wird. Durch optisches Löschen des Organs vor der Bildgebung 1,2 Jedoch für Organe, die fluoreszierende Proteine ​​wie GFP und YFP enthalten, optische Clearing-Protokolle verwenden, die Methanol Austrocknung und klare Benzylalkohol: Benzylbenzoat (BABB), während ungeschützt Licht 3 nicht beibehalten das Fluoreszenzsignal. Das Protokoll präsentiert hier ist eine neue Art und Weise, in der ganzen Organs optische Lichtung am Gehirn der Maus ausführen, um unter Wahrung der Fluoreszenzsignal YFP ausgedrückt in Neuronen. Verändern der optischen Clearing-Protokoll, so dass das Organ dehydratisiert wird mit einem Ethanol abgestuften Serie wurde gefunden, um den Schaden an den fluoreszierenden Proteinen reduzieren und Erhaltung ihrer Fluoreszenzsignal für Mehrphotonen Bildgebung. 4 Verwendung eines optimierten Verfahren der optischen Lichtung mit Ethanolbasis Dehydratisierung und Clearing durch BABBwährend von Licht abgeschirmt wird gezeigt, hochauflösende Bilder der Multiphotonen gelb fluoreszierendes Protein (YFP)-Expression in den Neuronen einer Mäusehirn mehr als 2 mm unter der Gewebeoberfläche.

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Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Mehrphotonenmikroskopie ganzer Mausorganen ist durch optisches Löschen des Organs vor der Bildgebung möglich, aber nicht alle Protokolle bewahren das Fluoreszenzsignal von fluoreszierenden Proteinen. Unter Verwendung eines optischen Clearing-Methode mit Ethanol-basierte Austrocknung und Benzylalkohol: Benzylbenzoat Lichtung zeigen wir, hochauflösende Multiphotonen Bilder gesamte Gehirn der Maus zum Ausdruck YFP.

Multiphotonen Mikroskopie Cleared Maushirn Ausdruck YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

multiphoton-microscopy-of-cleared-mouse-brain-expressing-yfp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.8K Aufrufe.  Yale University. Mehrphotonenmikroskopie ganzer Mausorganen ist durch optisches Löschen des Organs vor der Bildgebung möglich, aber nicht alle Protokolle bewahren das Fluoreszenzsignal von fluoreszierenden Proteinen. Unter Verwendung eines optischen Clearing-Methode mit Ethanol-basierte Austrocknung und Benzylalkohol: Benzylbenzoat Lichtung zeigen wir, hochauflösende Multiphotonen Bilder gesamte Gehirn der Maus zum Ausdruck YFP.

Serie: Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

Vorbereitung von Gehirngewebe der Maus für Immunelektronenmikroskopie

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Forschung

Neurowissenschaften

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, inflammatory and metabolic conditions, using in vivo fluorescence microscopy. A closed cranial window is placed over the left parieto-occipital cortex of the mice. Local microcirculation is recorded in real time through the window using epi and fluorescence illumination, and measurements of vessels diameters and red blood cell (RBC) velocities are performed. RBC velocity is measured using real-time cross-correlation and/or fluorescent-labeled erythrocytes. Leukocyte and platelet adherence to pial vessels and assessment of perfusion and vascular leakage are made with the help of fluorescence-labeled markers such as Albumin-FITC and anti-CD45-TxR antibodies. Microcirculation can be repeatedly video-recorded over several days. We used for the first time the close window brain intravital microscopy to study the pial microcirculation to follow dynamic changes during the course of Plasmodium berghei ANKA infection in mice and show that expression of CM is associated with microcirculatory dysfunctions characterized by vasoconstriction, profound decrease in blood flow and eventually vascular collapse.

Intravital microscopy to follow temporal and spatial hemodynamic and inflammatory events in the pial microcirculation.

Intravitalmikroskopie von Gehirn der Maus Mikrozirkulation mit einem Closed Cranial Fenster

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

Fokussierten Ionenstrahl-Fräs-und Rasterelektronenmikroskopie des Hirngewebes

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

Isolating LacZ-exprimierenden Zellen aus Maus Innenohrgeweben mittels Durchflusszytometrie

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Funktionelle Bildgebung mit Ultraschall-Blut-Hirnschranke Störung und Mangan-MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

Micron-Skala Resolution Optical Tomography von Entire Gehirn der Maus mit der konfokalen Mikroskopie Licht Blatt

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Genetische Manipulation von Kleinhirnkörnerzellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt;, Um neuronale Morphologie und Migration Studieren

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Das olfaktorische System als Modell zur Axonal Wachstumsmuster und Morphologie Studieren<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Purification of Mouse Brain Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and immune cells between the brain and the blood. Moreover, the huge neuronal metabolic demand requires a moment-to-moment regulation of blood flow. Notably, abnormalities of these regulations are etiological hallmarks of most brain pathologies; including glioblastoma, stroke, edema, epilepsy, degenerative diseases (ex: Parkinson&#8217;s disease, Alzheimer&#8217;s disease), brain tumors, as well as inflammatory conditions such as multiple sclerosis, meningitis and sepsis-induced brain dysfunctions. Thus, understanding the signaling events modulating the cerebrovascular physiology is a major challenge. Much insight into the cellular and molecular properties of the various cell types that compose the cerebrovascular system can be gained from primary culture or cell sorting from freshly dissociated brain tissue. However, properties such as cell polarity, morphology and intercellular relationships are not maintained in such preparations. The protocol that we describe here is designed to purify brain vessel fragments, whilst maintaining structural integrity. We show that isolated vessels consist of endothelial cells sealed by tight junctions that are surrounded by a continuous basal lamina. Pericytes, smooth muscle cells as well as the perivascular astrocyte endfeet membranes remain attached to the endothelial layer. Finally, we describe how to perform immunostaining experiments on purified brain vessels.

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

Reinigung von Maus-Hirngefäße

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and study the distribution, tropism, and abundance of pathogens inside of organ tissues provides pivotal data on disease development and progression. Using conventional microscopy methods, immunolabeling is mostly restricted to thin sections obtained from paraffin-embedded or frozen samples. However, the limited 2D image plane of these thin sections may lead to the loss of crucial information on the complex structure of an infected organ and the cellular context of the infection. Modern multicolor, immunostaining-compatible tissue clearing techniques now provide a relatively fast and inexpensive way to study high-volume 3D image stacks of virus-infected organ tissue. By exposing the tissue to organic solvents, it becomes optically transparent. This matches the sample&#8217;s refractive indices and eventually leads to a significant reduction of light scattering. Thus, in combination with long free working distance objectives, large tissue sections up to 1 mm in size can be imaged by conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM) at high resolution. Here, we describe a protocol to apply deep-tissue imaging after tissue clearing to visualize rabies virus distribution in infected brains in order to study topics like virus pathogenesis, spread, tropism, and neuroinvasion.

Novel, immunostaining-compatible tissue clearing techniques like the ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs allow the 3D visualization of rabies virus brain infection and its complex cellular environment. Thick, antibody-labeled brain tissue slices are made optically transparent to increase imaging depth and to enable 3D analysis by confocal laser scanning microscopy.

Hochauflösende 3D-Bildgebung der Tollwut-Virusinfektion im lösungsmittelfreien Hirngewebe

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...