Wir möchten Frau Christine A. Winters für hervorragende technische Unterstützung danken. Diese Arbeit wurde durch das Grundneuroscience Programm der NINDS Interne Research Program, NIH (Z01 NS002610) unterstützt.

Der hier beschriebene Ansatz wurde mit spezifischen Instrumente, Tools und Software entwickelt. Da Labors werden nicht mit der gleichen Versuchsanordnung werden der Ansatz verallgemeinert, wo möglich. 1. Schnelles Einfrieren Die Analysemethode beschrieben ist absolut abhängig von kryogenen Ansätze: 1) der &quot;Kryofixation&quot; von Zellen oder Geweben in einer Weise, die quantitativ bewahrt die Verteilung der diffundierbaren Gewebekomponenten und chemische Elemente wie sie in lebenden Zellen zum Zeitpunkt des Einfrierens und 2) die Herstellung von ultradünnen Gefrierschnitten geeignet für in einer TEM-Abbildung und Analyse. Diese Techniken werden hier kurz beschrieben, aber notwendigen Angaben, um diese Verfahren in anderen Laboratorien reproduzieren würde den Rahmen dieses Artikels. Interessierte Leser sind, exzellenten Artikeln 9,14 bezeichnet. Achtung: Dieser Abschnitt beschreibt die Verwendung von liquefied Ethan, die leicht entzündliche und explosions ist, entsprechende Vorkehrungen getroffen werden sollten. Betreiber müssen ebenfalls mit flüssigem Stickstoff vertraut sein (LN 2) Sicherheitsmaßnahmen, einschließlich Schutzmantel, Gläser und cryoresistant Handschuhe. Hinweis: Hier und überall, alle Werkzeuge (Zange, etc.) für die Handhabung gefrorenen Proben müssen in LN 2 vor der Verwendung vorgekühlt werden, um ein versehentliches Auftauen zu vermeiden. Kultivierte Zellen auf Deckgläsern <ol><li> Bereiten Sie eine Tauchgefriergerät durch Kondensation von gasförmigen Ethan bei -160 ° C in der LN 2 gekühlten Zentral gut. Bis zur Marke auffüllen und decken die gut mit der Schwenk Alu-Deckel, wenn sie nicht in Gebrauch ist. </li><li> Mit Filterpapier Keile, unter geeigneten Bedingungen experimentell zu einem dünnen Wasserfilm tupfen Kunststoff-Deckgläser von kultivierten Zellen. Tupfen Sie von der Kante um zu vermeiden, berühren das Gewebe, das Ideal Restfilm, durch Versuch und Irrtum bestimmt wird, ist so dünn wie möglich, aber nicht so thim zu verdampfen und trocknen der Gewebeoberfläche. </li><li> Halten Sie das Deckglas durch die Kante mit Spannzangen, schnell in flüssigem Ethan eintauchen, entweder manuell oder mit Hilfe der Schwerkraft betriebene Kolben. </li><li> Legen Sie die gefrorenen Deckglas in einem nahe gelegenen Styropor-Schale mit LN 2, groß genug, um die gewünschte Anzahl von Deckgläsern in langfristige Lagerbehälter zu manipulieren. Aluminium-Schraubverschluss Dosen, die nicht unter LN 2 ergreifen, werden empfohlen. </li></ol> Schockgefrieren von kultivierten Hirnschnitten <ol start="5"><li> Unter einem Binokular, ansehen und Orient ein organotypischen Hippocampus-Scheibe, ungestört und immer noch auf die Kultur Membraneinsatz befestigt. Zeigen Markierungszeichen auf der Membran in der Nähe der Kante der Scheibe mit einem schwarzen Sharpie-Typ-Stift und Foto. </li><li> Noch unter dem Mikroskop, schneiden Sie ca.. 5 x 5 mm Membran Quadrate mit einzelnen Scheiben auf den Plätzen zentriert. Berühren Sie nicht die Scheibe oder Biegen der MembranE. </li><li> Montieren Sie einen Membran-gestützte Scheibe, durch eine im Durchmesser ¼ Agar-Pad gepolstert, auf einem kundenspezifischen Aluminiumscheibe, um einen cryoultramicrotome (siehe unten) passen. Schnell frieren die Scheibe durch pneumatisch treibt es gegen eine LN2-gekühlten Saphirblock mittels eines maßgeschneiderten &quot;slam Einfrieren&quot;-Gerät. </li><li> Bewegen Sie den Speicher für kultivierten Zellen beschrieben. </li></ol> 2. Kryoschneiden Vorab: Erfolgreich produzieren Trockenschnitt-Bänder von Ultradünnschnitten, während einfach und logisch, erfordert Übung, Geduld und erheblichen Praxis. <ol><li> Backen Sie einen cryoultramicrotome mit einem cryoattachment und kühl bis -135 ° C ausgestattet </li><li> Schneiden gefroren in ca. Deckgläser. 3 x 3 mm Quadrate mit einem scharfen, vorgekühlt Skalpell. Einbetten Stücke mit Kulturen nach oben in einer viskosen Flüssigkeit &quot;cryoglue&quot; (1:6 Gemisch aus Ethanol und 2-Propanol 11) auf Standard-3mm Durchmesser aus Aluminium entwickelt, um die Pins Mikrotom Probe Futter passen. Vermeiden undicht cryoglue auf Kulturfläche. Festigen cryoglue durch Absenken der Temperatur auf Kryoboxen -160 ° C ≤ <ul class="lalpha"><li> Für tiefgefrorene Hirnschnitten, sicher direkt befestigen Scheiben zu einem maßgeschneiderten Spannfutter Probe mittels einer Schraube Kragen. </li></ul></li><li> Trim ausgewählten Bereichen der gefrorenen Proben - zB Zellreichen Gebieten des Deckglases Stück oder den Bereichen von Scheiben - zu einer ca.. 250 x 250 um Block Gesicht und ~ 100 um Tiefe mit einem Diamantschneidwerkzeug. </li><li> Dry-Cut-Bänder von Dünnschnitten bei ca.. -160 ° C mit einer 35 ° Diamant cryoknife, im wesentlichen wie in referencs 4, 9 beschrieben. Schnittgeschwindigkeit und Messer Freiwinkel werden empirisch bestimmt, ein guter Ausgangspunkt ist 0,4 bis 0,6 mm / sec bei 9 °. Die Nenndicke, dh Probe voraus, von hydrierten Schnitte iist typischerweise 80 nm, obwohl Abschnitte tatsächlich 1,5-2.0x dicker, hauptsächlich aufgrund der Kompression. Für eine einwandfreie Schnitte, ist ein Antistatikvorrichtung notwendig. Setzen Sie den ionisierenden Spitze der Geräte 0,5-1 cm von der Messerkante und stellen Ausgangsleistung, bis eine zufriedenstellende Bänder von Abschnitten hergestellt werden. </li><li> Bereiten Wimpern Sonden durch Kleben (mit Epoxy) Wimpern Applikator Holz-Sticks. Mit einer solchen Sonde, Abholung und Transfer Abschnitte aus dem Messerrücken auf glow-entladen, Kohlenstoff-beschichteten Trägerfolien PIOLOFORM über 100-Mesh-Klappkupfergitter gegossen und auf einem Halb gefaltet Indiumfolie Umschlag auf einem Regal hinter ruhenden Arbeits das Messer. Falten Sie die obere Hälfte des Rasters und Umschlag, drücken Sie mit einem Kaltpresswerkzeug. </li><li> Übergitter eingewickelt in einem geeigneten Gitterbox und Speicher in einem Aluminium kann, wie in Schritt 1.4 beschrieben. </li></ol> 3. Schockgefrierungsobjekthalter von Proben in die Elektronen-Mikroskop Das Kerninstrument für die ESMAin diesem Labor ist eine analytische Elektronenmikroskop bei 120 kV betrieben und für Kryomikroskopie ausgestattet, das heißt, mit einem sauberen Vakuum, Probe-Gebiet anticontaminator, einer 2k x 2k hochempfindlichen Digitalkamera und Schockgefrierungsobjekthalter Probenhalter entworfen. Überprüfen Sie vorher, Mikroskop Ausrichtung und Betriebsbedingungen in beiden Low-und High-Vergrößerung Modi und bestätigen eine zufriedenstellende Spalte Vakuum, idealerweise ≤ 10 -7 Torr. Tune up wie nötig. <ol><li> Bestätigen Sie, dass die Vakuum-Isolierung der Dewar-Komponente des cryoholder ist zufriedenstellend. Pumpe nach Bedarf. </li><li> Kühlen Sie die cryoholder auf die Minimaltemperatur, mindestens -160 ° C, während im Hochvakuum innerhalb der Mikroskoptisch, nehmen Sie das Kabel, das den Halter, seine Steuereinheit. Kippen Sie die Goniometer 45 ° im Uhrzeigersinn, bevor Sie den Inhaber, LN 2 minimieren Verschütten auf Betreiber und Mikroskop Oberflächen. </li><li> Bereiten Sie die Tisch cryoworkstation durch Abkühlen des integralen isolierend-Schale auf 160 ° C ≤ </li><li> Transfer (quickly!) die gekühlte cryoholder von Mikroskop, um Cryo Workstation. Einfahren des Inhabers Frostschirm. </li><li> Rufen Sie unter LN 2 ein Raster-Sandwich von der Lagerung und Platz auf dem Arbeitstisch des cryoworkstation. Ein Haltering für des Inhabers Probe gut ist auch auf den Tisch gelegt. </li><li> Öffnen Sie die Indium-Umschlag und bewegen Sie den beiliegenden Klappgitter auf die Probe auch der cryoholder. Sichern Sie das Gitter mit Haltering mit dem Schraubenschlüssel Werkzeug ein und schließen Sie den Frostschutz. </li><li> Schnelles Entfernen der cryoholder vom cryoworkstation legen und in der Luftschleuse des Mikroskops und gehen durch die Pumpsequenz so schnell wie möglich. Beim Einsetzen, sollte minimale Unterbrechung der Säule Vakuum sein. </li><li> Zurück Goniometer auf 0 ° Neigung. Schließen Sie neue Energie tanken und das Kontrollkästchen und bestätigen, dass die Probentemperatur ≤ 150 ° C </li><li> Füllen Sie den Dewar derProbenhalter und ermöglichen Vakuum-und Temperatur vollständig erholen. </li></ol> 4. Visual Survey der § § <ol><li> Fahren Sie den Frostschirm des Inhabers zur Probe aussetzen und schalten Sie den Elektronenstrahl. </li><li> Visuelle Bewertung der Probe bei geringer Vergrößerung, in der Regel 250X und geringer Beleuchtung. Wie in Abbildung 1 dargestellt ist, sollte Abschnitte dünn und glatt, nicht gefaltet oder überlappenden, flach und gut auf die Trägerfolie angebracht sein, und in der Regel nicht durch Gitterstäbe verdeckt. </li><li> Optional fotografieren ausgewählten Abschnitten. (HINWEIS: Minimieren Belichtung, da tiefgefrorenen Abschnitte sind sehr anfällig für Strahl-induzierten Schäden.) Verwenden Sie die automatisierte digitale Goniometertisch, um die Koordinaten der ausgewählten Abschnitte zu speichern. </li></ol> 5. Die Gefriertrocknung der § § <ol><li> Gefrier trockenen Abschnitte durch die Erhöhung Halter Temperatur auf ca.. -100 ° C ~ 30 min. </li><li> Rückkühlung Halter bis -160 ° C oder darunter. </li><li&gt; Vor der Bildgebung, schalten Sie cryoholder Steuereinheit und physisch trennen Controller-Kabel für Bild Drift durch Temperaturwechsel und / oder Vibration Abholung zu vermeiden. </li></ol> 6. Imaging von Zellen und Organellen Strukturbilder von gefriergetrockneten Abschnitte werden bei ca. erhalten. -160 ° C als low-dose, Zero-Loss-Bilder mit einem 2k x 2k Slow-Scan CCD-Kamera durch entsprechende Software gesteuert digital aufgezeichnet. <ol><li> Aktivieren Sie die EM in hallo-mag-Modus. </li><li> Wählen und Bild bei ~ 2000 X (als TIFF-Dateien, siehe Abbildung 2) markierten Zellen und subzellulärer Bereiche von Interesse in hochwertigen Abschnitte, deren Standorte waren zuvor aufgezeichnet und gespeichert. (Anmerkung: Die getrockneten Abschnitte sind jetzt wesentlich weniger empfindlich und weniger anfällig für Beschädigungen Elektronenstrahl. </li><li> Bewerten Sie Bilder, um Regionen von Interesse (ROI) für die Röntgenanalyse auswählen. Dieser Schritt kann wahlweise off-line durchgeführt werden, in welchem ​​Fall die EM gedreht werden kannaus, und die Probe auf Raumtemperatur erwärmen. </li></ol> 7. Akquisition von Röntgenspektren Röntgenspektren mit einem aufgezeichnet werden mehrere kommerzielle oder kundenspezifische Röntgenanalysesysteme minimal aus einer energiedispersiven Röntgenanalyse (EDX)-Detektor, zugehörigen Impulsprozessor-Elektronik und kompatibel Erfassung und Anzeige-Software. (Der in dieser Übung verwendete System ist in Tabelle 1 beschrieben.) <ol><li> Konfigurieren des EM für die Röntgenaufnahmen durch Einsetzen des EDX-Detektor in der Kolonne (falls erforderlich), Abziehen der Objektivöffnung und Einführen und Zentrieren keine Streustrahlung Öffnungen. Einstellen der cryoholder der niedrigsten Temperatur, bei der Frost Verunreinigung der Probe vermieden wird, sondern zumindest unterhalb -100 ° C </li><li> Neigen Sie den Halter 20 ° in Richtung des Detektors. </li><li> Unter Weitfeldabbildungsbedingungen und unter Annahme einer beabsichtigt, die Matrix aus einer analysieren individual Mitochondrien, wählen Sie ein Mitochondrium für die Analyse, verschieben Sie sie in der Mitte des Feldes und den Schwerpunkt. </li><li> Zum Spot-Modus (bei ​​einigen Mikroskopen nur konvergieren den Strahl mit zweiten Kondensator Fokus) und erhöhen die Strahlstrom auf ca.. 3 nA (wie mit einem Faraday-Cup oder ähnlichen gemessen) in einer 100 nm Ort. </li><li> Starten Sie das Spektrum Erfassungssoftware und beginnen 100 sec Akquisitionen, die Live-Zeit auf dem Monitor betrachtet werden können. Sparen aufgenommene Spektrum (Abb. 2). Der Industriestandard EMSA-Format bevorzugt. </li><li> Fahren Sie den EM und übertragen Sie die Multiple-Spektren-Datei (en) zu einem (offline) Analyse-Workstation. </li></ol> 8. Analyse der Röntgenspektren Qualitative Analyse Eine EDX-Spektrum (Abbildung 2, Einschub) ist im Wesentlichen eine xy-Darstellung der Röntgenintensität vs Energie. Spectra enthalten qualitative und quantitative Informationen über die elementare Zusammensetzung von ter analysiert, Lautstärke, dass der &quot;charakteristischen&quot; Energie einer Spitzen identifiziert das Element, die zu diesem Gipfel, während die Intensität spiegelt die Menge dieses Elements. Die charakteristischen Peaks reiten auf einem sich langsam verändernden Hintergrund, der &quot;Kontinuum&quot;. (Die Legende zu Abbildung 2 weiter diskutiert hervorstechenden Details der EDX-Spektren.) Die Energie der Spitzen Verteiler für das gesamte Periodensystem werden durch die bekannten elektronischen Struktur von Elementen, wodurch alle EDX Software Links zu einer Datenbank, die automatisch identifiziert Komponenten definiert ein Analyt. In einem physiologischen Kontext, Elemente von allgemeinem Interesse, die gut auf EDX-Analyse sind, umfassen Na (K α bei 1,04 keV), P (2,01 keV), K (3,31 keV) und Ca (3,69 keV). <ol><li> Profitieren Sie von der verfügbaren Software-Datenbank und Spitzenpassenden Routinen, um wichtige Elemente in den Spektren zu identifizieren. In einer biologischen Probe zu erwarten Peaks für Na, Mg, P, S, Cl, K und Ca zu finden. (ACHTUNG:Die letzten beiden Elemente überlappen!) </li></ol> Quantitative Analyse Die quantitative Analyse der EDX-Spektren aus der Extraktion der integrierten Fläche der Peaks identifiziert und Konvertieren dieses Wertes in einer Konzentration. Für biologische Analyse ist die etablierten Ansatz der Hall Peak / Kontinuum Verfahren 4,7,10, die Nutzen aus der Tatsache, dass die Intensität des Kontinuums (oben und in Abbildung 2 definiert) ist proportional zu der Trockenmasse des analysierten Volumen nimmt . Somit ist das Verhältnis der Peakfläche / Kontinuum Bereich, verglichen mit dem gleichen Verhältnis in Spektren von Standards bekannter Zusammensetzung, gibt die Konzentration in der Ziel Zellkompartiment. Beachten Sie, dass dieser Ansatz Konzentrationen in Einheiten von Mol pro Gewicht, in der Regel als mmol / kg Trockengewicht ausgedrückt. Diese Einheit ist ungewöhnlich und für die Interpretation erfordern zusätzliche Umwandlung in zB mmol / L Nassgewicht oder mmol / mg Protein, wie beschrieben elsewhere 4,10. <ol start="2"><li> Extrahieren Peakflächen (und Fehlerschätzungen) biologischer Elemente zwischen Z = 10-20 (0,5-4,0 keV), dh Na, Mg, P, S, Cl, K, Ca und unter Verwendung einer der Routinen in den Fitting-Analyse-Software gebaut (siehe Tabelle 1, insbesondere Fußnote 4). Dieses Labor verwendet Simplex-oder Mehr kleinsten Quadrate. Beachten Sie, dass diese Montage erfordert eine sorgfältige Aufmerksamkeit auf die Lösung der Überlappung zwischen K-und Ca-Gipfel (siehe Abbildung 2). </li><li> Integrieren Sie das Kontinuum zwischen 1,45-1,61 keV. Alternative störungsfreien Bereiche können verwendet werden. </li><li> Berechnen Peak / Kontinuum Verhältnisse und dann Konzentrationen im Vergleich zu Standards. Propagieren Fehler während der gesamten Analyse. </li><li> Verwenden Sie Standard-Statistik-Software und Formeln, um Durchschnittswerte, die biologische Variabilität widerspiegeln schätzen. </li></ol>

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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxic+calcium+overload+in+a+subpopulation+of+mitochondria+triggers+delayed+death+in+hippocampal+neurons.">Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons.</a> J. Neurosci. 24, 5611-5622 (2004).</li><li>Ritchie, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrum+simulation+in+DTSA-II.">Spectrum simulation in DTSA-II.</a> Microsc. Microanal. 15, 454-468 (2009).</li><li>Stanika, R. I., Winters, C. A., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+NMDA+receptor-dependent+calcium+loading+and+mitochondrial+dysfunction+in+CA1+vs.+CA3+hippocampal+neurons.">Differential NMDA receptor-dependent calcium loading and mitochondrial dysfunction in CA1 vs. CA3 hippocampal neurons.</a> Neurobiol. Dis. 37, 403-411 (2010).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+receptor+arrays+in+frozen-hydrated+sections+and+plunge-frozen+specimens+of+E.+coli+engineered+to+overproduce+the+hemotaxis+receptor+Tsr.">Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the hemotaxis receptor Tsr.</a> J. Microsc. 216, 76-83 (2004).</li></ol>

Die Autoren berichten, keine Interessenkonflikte.

Die hier vorgestellte Elektronenmikroskop-basierten Analysemethode ermöglicht die Detektion, Identifizierung und Quantifizierung von mehreren Elementen von biologischem Interesse, einschließlich Na, K, P, insbesondere Ca. Diese Analysen können bei subzellulärer geführt werden, dh, intra-Organellen, die Auflösung aufgrund der Fähigkeit, zu lokalisieren und zu identifizieren Strukturen von Interesse in Bildern hoher Qualität von Gefrierschnitten aus rasch eingefroren Proben vorbereitet. Beachten Sie, dass...

Calciumionen sind wohl die wichtigsten und vielseitigsten Zellsignalisierungseinheit in der Biologie, spielen eine wesentliche Rolle in der normalen Prozesse so vielfältig wie die synaptische Transmission und Genexpression. Auf der anderen Seite, ist Calcium in Zelltod ebenso wichtig. Insbesondere ist ein Schlüsselfaktor in der neuronalen Verletzungen in der Schlaganfall-Kalzium Deregulierung, Parkinson, Alzheimer und anderen neurodegenerativen Erkrankungen 3,5. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, um quantitativ zu verstehen, wie Calcium in den Zellen verteilt und wie diese Veränderungen nach physiologischen oder pathophysiologischen Stimuli. Frei in Lösung oder an ein Substrat gebunden - - und das zelluläre Calciumkonzentrationen über mehrere Größenordnungen als Folge der Stimulation verändern Dieses Ziel wird durch die Tatsache, dass Kalzium wird dynamisch zwischen zwei physikalische Zustände verteilt kompliziert. Zwar gibt es mehrere Methoden für die erweiterte Analyse fr verfügbaree intrazellulären Calcium ist die Bestimmung der Gesamtcalciumkonzentrationen in definierten intrazellulären Kompartimenten realistisch auf einem Ansatz, nämlich Elektronenstrahlmikroanalyse (ESMA) begrenzt. EPMA ist eine Technik, die Paare ein Röntgenspektrometer mit einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM). Die TEM-Elektronenkanone konzentriert sich eine stationäre, Submikron Elektronensonde auf subzellulärer Region von Interesse und den elementspezifischen Röntgenstrahlen als Folge der Elektronenbeschuss emittiert werden, werden gesammelt und analysiert (siehe Referenzen 7, 4 für technische Detailbewertung). Vorteile der ESMA sind einzelne Organellen-Level-Auflösung und Empfindlichkeit submillimolaren. In der Praxis jedoch, ESMA erfordert spezielle cryotechniques und Instrumente für die Probenvorbereitung und Analyse. Hier werden die Werkzeuge, Techniken und Instrumente für die Messung von intrazellulären Kalzium mittels ESMA entsprechende beschrieben. Intramitochondrialen Kalzium ist besonders interest wegen der entscheidenden Rolle, dass die mitochondriale Calciumüberladung spielt bei neurodegenerativen Erkrankungen.

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	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS/MATERIALS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermanox plastic coverslips</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>72280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture inserts</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353090</td>
			<td>For 6-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryopins</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>16701952</td>
			<td>Grooved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood applicators</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>72300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folding EM grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>4GC100/100</td>
			<td>100 mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium foil</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>13982</td>
			<td>0.25 mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunge freezing device</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>KF-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slam freezing device</td>
			<td>LifeCell</td>
			<td>CF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>UC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoattachment for microtome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>FC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond cryotrimming tool</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Cryotrim 45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond cryoknife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Cryo 35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antistatic device</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Hauf Static Line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo electron microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>EM912 Omega</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM cryo specimen holder</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>CT3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow-scan CCD camera, 2k x 2k</td>
			<td>Troendle (TRS)</td>
			<td>Sharpeye</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition software</td>
			<td>Olympus SIS</td>
			<td>iTEM suite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ED x-ray detector</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>Linksystem Pentafet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse Processor</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>XP-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCI backplane card</td>
			<td>4pi Systems</td>
			<td>Spectral Engine II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer</td>
			<td>Apple</td>
			<td>Any OS9-compatible model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray analysis software</td>
			<td>NIST</td>
			<td>DTSA, DTSA II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<ol>
				<li>The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line.</li>
				<li>A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at <a href="http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4" target="_blank">http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4</a>.</li>
				<li>The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online.</li>
				<li>The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (<a href="http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm" target="_blank">http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm</a>)</li>
			</ol>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of total calcium in neurons by electron probe x-ray microanalysis

In diesem Artikel werden die Werkzeuge, Techniken und Instrumente für quantitative Messungen der intrazellulären Elementgehalt falls unter Verwendung der Technik, die als Elektronenstrahl-Mikroanalyse (ESMA) bekannt sind, beschrieben. Intramitochondrialen Kalzium ist ein besonderer Schwerpunkt wegen der kritischen Rolle, dass die mitochondriale Calciumüberladung spielt bei neurodegenerativen Erkrankungen. Die Methode basiert auf der Analyse der Röntgenstrahlen erzeugt in einem Elektronenmikroskop (EM) durch Wechselwirkung eines Elektronenstrahls mit der Probe berechnet. Um die native Verteilung der diffusionsfähigen Elemente in der Elektronenmikroskopie Proben zu erhalten, erfordert ESMA &quot;Kryofixation&quot; von Gewebe, gefolgt von der Herstellung von ultradünnen Gefrierschnitten. Schockgefrieren von kultivierten Zellen oder organotypischen Kulturen wird durch Eint Einfrieren in flüssigem Ethan oder durch Einfrieren Slam gegen einen kalten Metallblock bzw. durchgeführt. Cryoschnitte nominell 80 nm dick sind trocken mit einem Diamantmesser bei ca. geschnitten. -16076, C, auf Kohlenstoff / PIOLOFORM beschichteten Kupfergitter montiert und cryotransferred in eine Kryo-EM mit Hilfe eines speziellen cryospecimen Halter. Nach der visuellen Mapping-Umfrage und die Lage bei ≤ 160 ° C und niedriger Elektronendosis, sind tiefgefrorenen Gefrierschnitten gefriergetrockneten bei -100 ° C ~ 30 min. Organell Stufenbilder von getrockneten Kryoabschnitte aufgezeichnet sind, auch bei niedrigen Dosis mittels einer Slow-Scan-CCD-Kamera und subzellulären Regionen von Interesse für die Analyse ausgewählt. Röntgenstrahlen von einem stationären, konzentriert, mit hoher Intensität Elektronensonde von ROIs emittiert werden, von einer energiedispersiven Röntgenanalyse (EDX)-Spektrometer, um die zugehörige Elektronik verarbeitet und als Röntgenspektrum präsentiert gesammelt, das heißt, ein Grundstück von Röntgenintensität vs Energie. Zusätzliche Software erleichtert: 1) Identifizierung von elementaren Komponenten durch ihre &quot;charakteristisch&quot; Spitzen Energien und Fingerabdruck, und 2) die quantitative Analyse durch Extraktion der Peakflächen / Hintergrund. Das Papier schließt mit zwei Beispiele, die veranschaulichen typischeEPMA-Anwendungen, in denen eine mitochondriale Calciumanalyse vorgesehen kritischen Einblick in Mechanismen der exzitotoxischen Schädigung und eine andere, die die Grundlage der Ischämie Beständigkeit zeigte.

Gehirnzellen zu erhalten in der Regel exzitotoxische Verletzungen als Folge des pathologischen Neurotransmitter-Freisetzung, die unter ischämischen Bedingungen auftritt. ESMA war entscheidend für die Entdeckung, wie die Fähigkeit der neuronalen Mitochondrien, riesige Mengen an Kalzium zu maskieren zugrunde liegt, den Mechanismus der Verletzung. Die elektronenmikroskopische Aufnahme in Fig. 3 veranschaulicht das Aussehen von Mitochondrien in gefriergetrockneter Gefrierschnitten von kultivierten hippoc...

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Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis

Dieses Papier beschreibt die Anwendung von cryoanalytical Elektronenmikroskopie auf die quantitative Messung der Gesamtkalziumgehalt und die Verteilung auf subzellulärer Auflösung in physiologisch definierte biologische Proben.

Messung des Gesamtcalciums in Neuronen, die durch Elektronensonden-Röntgenmikroanalyse

In this article the tools, techniques, and instruments appropriate for quantitative measurements of intracellular elemental content using the technique ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.9K Aufrufe.  National Institutes of Health.  Dieses Papier beschreibt die Anwendung von cryoanalytical Elektronenmikroskopie auf die quantitative Messung der Gesamtkalziumgehalt und die Verteilung auf subzellulärer Auflösung in physiologisch definierte biologische Proben. 

Serie: Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Forschung

Neurowissenschaften

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of neurons and circuits requires methods with the spatial selectivity and temporal resolution appropriate for mechanistic analysis of neural ensembles in the behaving animal, i.e. recording of representatively large samples of isolated single neurons. Ensemble monitoring of neuronal activity has progressed remarkably in the past decade in both small and large-brained animals, including human subjects1-11. Multiple-site recording with silicon-based devices are particularly effective because of their scalability, small volume and geometric design.
Here, we describe methods for recording multiple single neurons and local field potential in behaving rodents, using commercially available micro-machined silicon probes with custom-made accessory components. There are two basic options for interfacing silicon probes to preamplifiers: printed circuit boards and flexible cables. Probe supplying companies (<a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a>; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a>; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a>) usually provide the bonding service and deliver probes bonded to printed circuit boards or flexible cables. Here, we describe the implantation of a 4-shank, 32-site probe attached to flexible polyimide cable, and mounted on a movable microdrive. Each step of the probe preparation, microdrive construction and surgery is illustrated so that the end user can easily replicate the process.

We describe methods for large-scale recording of multiple single units and local field potential in behaving rodents with silicon probes. Drive fabrication, probe attachment to the drive and probe implantation processes are illustrated in sufficient details for easy replication.

Großflächige Aufnahme von Neuronen durch Movable Silicon Probes in Behaving Nagetiere

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

Gleichzeitige Aufnahme von Calcium-Signale von identifizierten Neuronen und Fressverhalten von Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Imaging Calcium Antworten in GFP-markierten Neuronen des Hypothalamus Maus Hirnschnitten

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the structure of neurites is critical to understanding how these processes move materials and signals that support synaptic communication. Electron microscopy (EM) has been traditionally used to assess the ultrastructural features within neurites; however, the exposure to organic solvent during dehydration and resin embedding can distort structures. An important unmet goal is the formulation of procedures that allow for structural evaluations not impacted by such artifacts.
Here, we have established a detailed and reproducible protocol for growing and flash-freezing whole neurites of different primary neurons on electron microscopy grids followed by their examination with cryo-electron tomography (cryo-ET). This technique allows for 3-D visualization of frozen, hydrated neurites at nanometer resolution, facilitating assessment of their morphological differences. Our protocol yields an unprecedented view of dorsal root ganglion (DRG) neurites, and a visualization of hippocampal neurites in their near-native state. As such, these methods create a foundation for future studies on neurites of both normal neurons and those impacted by neurological disorders.

To preserve neuronal processes for ultrastructural analysis, we describe a protocol for plating of primary neurons on electron microscopy grids followed by flash freezing, yielding samples suspended in a layer of vitreous ice. These samples can be examined with a cryo-electron microscope to visualize structures at the nanometer scale.

Herstellung von primären Neuronen für die Visualisierung von Neuriten in einem tiefgefrorenen Zustand unter Verwendung von Kryo-Elektronentomographie

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

Calciumphosphat-Transfektion von primären Hippocampus-Neuronen

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Ratiometrischen Kalzium Imaging einzelner Neuronen im Verhalten Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional abnormalities of LC impact several brain regions including cortex, hippocampus, and cerebellum and may contribute to depression, bipolar disorder, anxiety, as well as Parkinson disease and Alzheimer disease. These disorders are often associated with metal misbalance, but the role of metals in LC is only partially understood. Morphologic and functional studies of LC are needed to better understand the human pathologies and contribution of metals. Mice are a widely used experimental model, but the mouse LC is small (~0.3 mm diameter) and hard to identify for a non-expert. Here, we describe a step-by-step immunohistochemistry-based protocol to localize the LC in the mouse brain. Dopamine-&#946;-hydroxylase (DBH), and alternatively, tyrosine hydroxylase (TH), both enzymes highly expressed in the LC, are used as immunohistochemical markers in brain slices. Sections adjacent to LC-containing sections can be used for further analysis, including histology for morphological studies, metabolic testing, as well as metal imaging by X-ray fluorescence microscopy (XFM).

The locus coeruleus is a small cluster of neurons involved in a variety of physiological processes. Here, we describe a protocol to prepare mouse brain sections for studies of proteins and metals in this nucleus.

Lokalisierung von Locus Coeruleus im Gehirn Maus

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.