Drosophila melanogaster wird weitläufig als Modellorganismus für Untersuchungen der Entwicklung und Reproduktion benutzt. Drosophila entwickeln sich in verschiedenen Stadien, in einem Prozess der Lebenszyklus genannt wird. Jedes Stadium ist eine einzigartige Plattform für die entwicklungsbiologische Forschung.
In diesem Video präsentieren wir die Grundlagen der Drosophila Entwicklung und Reproduktion, einschließlich wie man eine genetische Kreuzung ansetzt und wie man diese Forschung anwenden kann, um Prozesse von der Wundheilung bis hin zum Verhalten besser zu verstehen.
Zuerst schauen wir uns den Drosophila Lebenszyklus an. Drosophila entwickelt sich in 4 Hauptstadien: dem Embryo, der Larve, der Puppe und der erwachsenen Fliege.
Der Embryo ist ein befruchtetes Ei und ist etwa 0.5 mm lang und ovalförmig. Sofort nach der Befruchtung teilt sich der Embryo durch Mitose ohne dabei zu wachsen. Der zygotische Zellkern teilt sich 9 Mal, ohne dass dabei die Zytokinese stattfindet. Dadurch entsteht eine Zelle mit mehreren Zellkernen, die auch als synzytialer Blastoderm bezeichnet wird. Da sich alle Zellkerne im synzytialen Blastoderm das gleiche Zytoplasma teilen, verbreiten sich Proteine ohne Hindernisse. Dadurch werden Morphogengradienten gebildet, welche wichtig sind, um einen Körperplan festzulegen und um die jeweiligen Organe und Gewebe der Fliege zu bilden. Nach der 10. Zellkernteilung, migrieren die Zellkerne zur Außenseite des synzytialen Blastoderms. Nach der 13. Zellkernteilung, die ca. 3 Stunden nach der Befruchtung stattfindet, werden die 6000 Zellkerne in dem synzytialem Blastoderm zu einzelnen Zellen, die dann den zellulären Blastoderm bilden. Der zelluläre Blastoderm enthält eine Monoschicht von Zellen und wird dann in einem Prozess, der Gastrulation genannt wird, in eine komplexe, mehrschichtige Struktur umgebildet. Während der Gastrulation entstehen durch die Verformung der Zellen Einstülpungen in der Monoschicht, die schließlich die endodermen, mesodermen, und ektodermen Keimzellenschichten bilden. Aus dem Endoderm entsteht der Verdauungstrakt, und aus dem Mesoderm entstehen die Muskeln und das Herz. Aus dem Ektoderm entstehen die Epidermis und das zentrale Nervensystem. Nach 24 Stunden werden aus den Embryos die Larven.
Larven sind weiß und wurm-ähnlich geteilte Körper. Sie kriechen in nasser Nahrung herum und essen ständig, was zu ihrem schnellen Wachstum führt. Larven durchlaufen 3 Stadien: das erste Larvenstadium dauert 24 Stunden, das zweite nochmals 24 Stunden, und das dritte 48 Stunden. Eine Häutung findet nach jedem Stadium statt. Wenn die Puppung kurz bevor steht, verlassen Larven im dritten Stadium ihre Nahrungsquelle und setzen sich an einer festen Oberfläche, wie zum Beispiel der Seitenfläche einer Glasflasche fest.
Puppen sind bewegungslos, zuerst weich und weiß, und werden schließlich härter und braun. In 4 Tagen zersetzt sich das Larvengewebe und die erwachsenen Gewebe entwickeln sich. Das Schlüpfen ist das Ende des Puppenstadiums und die Fliegen sind nun erwachsen.
Acht Stunden nach dem Schlüpfen werden die erwachsenen Fliegen sexuell aktiv und beginnen sich zu paaren, womit der Lebenszyklus von neuem beginnt.
Der komplette Lebenszyklus dauert bei 25°C etwa 10 Tage, was jedoch abhängig von der Temperatur ist. Zum Beispiel ist der Lebenszyklus bei 18°C etwa 19 Tage und bei 29°C nur 7 Tage lang.
Während der Entwicklung wird der Körperplan durch eine sorgfältige Regulierung der Segmentierung festgelegt. So werden die einzelnen Gewebe und Organe spezifiziert. Die anterior-posteriore Achse definiert die Kopf-Schwanz Ausrichtung des Organismus und wird durch mehrere Gengruppen reguliert.
Erstens werden die Maternaleffektgene durch die Eizelle bereitgestellt und von dem Weibchen vererbt. Sie sind wichtig im synzytialen Blastoderm und um anfänglich den anterioren und posterioren Teil des Embryos festzulegen. Um genau zu sein, definiert das bicoid Gen den anterioren Teil des Embryos, einschließlich des Kopfes und des Thorax, und das nanos Gen definiert den posterioren Teil des Embryos, einschließlich des Abdomens.
Zweitens beinhalten die Segmentierungsgene, die durch die Maternaleffektgene reguliert werden, die Lücken- und Paarregelgene. Die Lückengene setzen den Körperplan von der anterioren zu der posterioren Achse fest und teilen den Embryo grob ein. Die Paarregelgene werden in einem Streifenmuster rechtwinklig zu der anterior-posterioren Achse exprimiert, und unterteilen den Embryo in weitere kleine Segmente. Danach legen die segmentierten Polaritätsgene, wie zum Beispiel engrailed, das Zellschicksal in jedem Segment fest.
Zuletzt sind die homeotischen Gene verantwortlich um bestimmte anatomische Strukturen, wie zum Beispiel die Flügel oder die Beine, zu definieren. Interessanterweise bestimmt die Reihenfolge der Gene auf den Chromosomen wie sie auf der anterior-posterioren Achse exprimiert werden.
Drosophila sind extrem fruchtbare Organismen, die tausende Nachkommen in ihrer Lebensspanne erzeugen können. Weibchen legen hunderte Eier pro Tag und befruchten Eier noch weit nachdem die Paarung stattgefunden hat.
Drosophila sind außerdem sexuell dimorphische Organismen, das heißt das die Weibchen phänotypisch anders als die Männchen sind. Konkret sind die Männchen kleiner als die Weibchen und haben dunkel gefärbte externe Genitalien und eine stärker schwarze Pigmentierung ihres unteren Abdomens. Männchen haben außerdem eine Stelle mit Borsten auf ihren Vorderbeinen, die Sexkamm genannt wird, und verwendet wird um das Weibchen während der Paarung zu besteigen. Diese individuellen phänotypischen Merkmale vereinfachen es Männchen von Weibchen zu unterscheiden, was besonders nützlich ist wenn man eine genetische Kreuzung ansetzen möchte.
Eine genetische Kreuzung anzusetzen ist eine nützliche Methode um genetische Experimente zu machen. Los geht’s!
Der erste Schritt um eine Kreuzung anzusetzen ist die jungfräulichen Weibchen des gewünschten Genotyps zu sammeln, womit man genau kontrollieren kann mit welchen Männchen sie sich paaren. Drosophila können sich nicht in den ersten 8 Stunden nach dem Schlüpfen vermehren, und indem man sehr junge erwachsene Fliegen sammelt stellt man sicher, dass sie Jungfrauen sind. Um neu geschlüpfte Weibchen zu sammeln schüttet man alle erwachsenen Fliegen aus dem Behältnis weg. Alle 3-4 Stunden prüft man dann die Behältnisse, ob neu geschlüpfte erwachsene Fliegen vorhanden sind, und sammelt die Weibchen in einem neuen Behältnis ohne Männchen, bis sie weiterverwendet werden können. Jungfräuliche Weibchen kann man an ihrer sehr hellen Körperfarbe erkennen und an einem dunklen Fleck an dem Abdomen, der auch als Mekonium bezeichnet wird.
Wenn man die Kreuzung ansetzt, gibt man 4-6 Männchen zu je 4-6 jungfräulichen Weibchen des gewünschten Genotyps in einem datierten Behälter mit Nahrung, und lagert diesen bei 25°C und 60% Luftfeuchtigkeit. Nach 3-4 Tagen sieht man Larven. Nun sollten die erwachsenen Fliegen in ein neues Behältnis transferiert werden, damit sich die Eltern nicht mit den Nachkommen paaren. Nach etwa 10 Tagen sieht man die ersten Nachkommen und kann deren Phänotyp untersuchen.
Ein Werkzeug das Drosophila Forscher häufig benutzen sind sogenannte Balancer-Chromosomen, durch welche man genetische Rekombination verhindert und die genetische Marker, wie gekräuselte Flügel, enthalten, die nützlich sind um den richtigen Genotyp der Fliege zu bestimmen. Wenn man heterozygote Fliegen mit zwei Mutationen möchte, kann man einen Fliegenschwarm mit der 1. Mutation und dem Balancer-Chromosom CyO, mit einem zweiten Fliegenschwarm mit der 2. Mutation und dem Balancer-Chromosom das auch CyO ist, paaren. Nachkommen ohne gekräuselte Flügel sind heterozygot für beide Mutationen.
Ein anderes häufig benutztes Werkzeug in der Drosophila Forschung ist das UAS-GAL4 System, das es Forschern erlaubt ein bestimmtes Gen in einem bestimmten Gewebe zu exprimieren oder zu unterdrücken. GAL4 ist ein hefespezifischer Transkriptionsfaktor, der durch einen speziellen gewebespezifischen Promoter bestimmt wird. UAS ist die „Upstream activating sequence“, welche die Expression des gewünschten Gens kontrolliert. Wenn eine Fliege mit einem gewebespezifischen GAL4 Transgen mit einer Fliegen mit einem UAS Transgen und dem gewünschten Gen direkt downstream davon gekreuzt wird, bindet sich das GAL4 Protein an den UAS Promoter und bestimmt die Expression des gewünschten Gens. Wenn beispielsweise das UAS-GFP Gen mit apterous-GAL4 gekreuzt wird, welches spezifisch für die Flügelscheiben in den Puppen ist, wird GFP in genau diesen Zellen exprimiert.
Es gibt viele Anwendungen, mit denen man die Drosophila Entwicklung und Reproduktion untersuchen kann. Eine Anwendung sind Verhaltensanalysen, speziell das Balzverhalten. Während des Balzens, orientiert sich das Männchen zum Weibchen hin und folgt ihr, währen der sie mit seinen Vorderbeinen berührt. Wenn das Weibchen empfänglich ist, erlaubt sie dem Männchen sie zu besteigen. Das Männchen windet sein Abdomen und transferiert Samenflüssigkeit in das Weibchen, in einem Prozess der auch Kopulation genannt wird. Die Analyse dieses Balzverhaltens von bestimmten Mutanten gibt Einblicke in die genetische Kontrolle dieses komplexen Verhaltens.
Die Drosophila Entwicklung ist ein extrem dynamischer Prozess, der viele Zellbewegungen und Formveränderungen beinhaltet, die mit Echtzeitmikroskopie untersucht werden können. Zum Beispiel tritt die dorsale Schließung während der Embryogenese auf, wenn eine Lücke in dem Epithel reißverschlussähnlich geschlossen wird, was die Koordination von vielen Zellarten erfordert. Die dorsale Schließung in der Entwicklung wird oft benutzt um Wundheilung zu untersuchen, was viele klinische Anwendungen hat.
Eine dritte Anwendung für welche die Drosophila Entwicklung benutzt wird, ist die RNA Interferenz, welche die Aktivität von individuellen Genen verringert, und welche für große, umgekehrt genetische Screens verwendet werden kann. Doppelsträngige RNA kann zum Beispiel direkt in die Embryos injiziert werden, wodurch die Auswirkung dieser Genknockdowns auf die Organentwicklung bestimmt werden kann. Hier ist durch die RNA Interferenz ein Gen identifiziert worden, welches wichtig für die tracheale Entwicklung ist.
as war die Einführung in die Reproduktion und die Entwicklung von Drosophila melanogaster von JoVE. In diesem Video haben wir den Drosophila Lebenszyklus wiederholt, einschließlich der Details von jedem Entwicklungsstadium. Wir haben außerdem gelernt wie man die reproduktiven Möglichkeiten von Drosophila ausnutzt, um die Genetik zu untersuchen und eine Kreuzung anzusetzen. Schließlich haben wir gelernt wie die Drosophila Entwicklung und Reproduktion genutzt werden kann, um komplexe Prozesse wie Wundheilung und Organentwicklung zu verstehen. Danke für eure Aufmerksamkeit!
