Wir danken dem US-Department of Homeland Security für die Bereitstellung Teil der Finanzierung.

1. Bakterienstämme und DNA-Template Vorbereitung <ol><li> Wachsen Bakterienstämme von E. coli O157: H7, O157 nicht, und anderen pathogenen Arten, wie Salmonella und Shigella, bei 37 ° C über Nacht unter Schütteln inkubiert. </li><li> Extrahieren von DNA aus Bakterienkulturen mit dem entsprechenden Kit (siehe Tabelle der Werkstoffe) und nach Anweisungen des Herstellers. </li><li> Die optische Dichte (OD 260), um die DNA-Konzentration unter Verwendung eines Spektrophotometers zu bestimmen. </li></ol> 2. Primer-und Sonden-Design für die qPCR Assay <ol><li> E. coli O157: H7-Sequenzen sind von GenBank Zugangsnummer AE00517411. Design-Primer und Sonde mit der entsprechenden Software für die Primer-und Sondendesign für Echtzeit-PCR (siehe Materialtabelle für Details). Die Sequenzen von Primern und Sonden sind wie folgt: Z3276-Vorwärts (F) 5&#39;-TATTCCGCGATGCTTGTTTTT-3 &#39; Z3276-Rücklauf (R)-5&#39;-ATTATCTCACCAGCAAACTGGCGG-3 &#39; Z3276-Probe, FAM-CCGCAATCTTTCC-MGBNFQ </li><li> Rekonstitution des Primers Pulver mit Wasser, was zu einer Konzentration von 10 uM als Primer Arbeitslösung. </li><li> Verdünnen Sie die Sonden bis 10 um als Sonde Arbeitslösungen. Markierte Sonden unterscheiden sich in Potenz mit Chargen. Daher titriert jede Partie markierten Sonden, bevor Sie für eine optimale Leistung qPCR. </li></ol> 3. Einstellen der qPCR Assay AGB <ol><li> Bereiten Reaktionsmischung, die von 25,0 ul 2x Echtzeit-PCR Master Mix, 200 nM von Vorwärts-Primer, 200 nM von Reverse-Primer und 100 nM Sonde besteht. </li><li> Mit 5 ul Probe DNA (100 pg) und einem geeigneten Volumen an Wasser, um ein Endvolumen von 50 &amp;mgr; l zu erreichen. </li><li> Für nontemplate Kontrolle sind 5 ul Wasser zu DNA-Probe zu ersetzen. </li><li> Festlegen der qPCR Bedingungen wie folgt: 95 ° C für 10 Minuten zur Aktivierung des TaqMan, gefolgt von 40 Zyklen von 95 ° C für 10 sec und 60 für die Denaturierung undNr. 176, C 1 min Annealing / Extension. </li></ol> 4. qPCR Empfindlichkeitstest <ol><li> Einen seriellen 10-fachen Verdünnung von einer Kultur der mittleren exponentiellen Phase (OD 600 = 0,5, etwa 1,5 x 10 8 CFU / ml durch Plattieren). </li><li> 100 ml der Zellverdünnungen auf eine 96-Well-Platte in dreifacher Ausfertigung. </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte bei 2500 g für 10 min. </li><li> 50 ml DNA-Extraktionslösung in jede Vertiefung. </li><li> Resuspendieren Zellpellets mit einer Mehrkanalpipette. </li><li> Verschließen Sie die Platte mit einem Film, kochen Sie die Platte in einem Wasserbad für 10 min und zentrifugiert bei 2500 g für 2 min. </li></ol> 5. Vorbereiten Live und Dead Cell Mischungen für PMA-Behandlung <ol><li> Wachsen 10 ml E. coli O157: H7 bei 37 ° C bis zur mittleren exponentiellen Phase und teilen die Kultur in zwei Aliquots. </li><li> Kochen Sie ein Aliquot der Zellen für 10 min in einem Wasserbad für toten Zellen und lassen Sie die anderen aliquoten für lebende Zellen. </li><li> Überprüfen Sie, ob dieWieder sind keine lebenden Zellen aus der Hitze abgetöteten Aliquot durch Ausplattieren der Zellen auf LB-Agar-Platten. </li><li> Nehmen Sie 2 ml der Live-und Hitze abgetöteten Zellen und stellen Sie die Konzentration auf 8 x 10 6 KBE / ml mit LB-Medium. Erstellen vier Sätze von Zellverdünnungen im Bereich von 8 x 10 0 bis 8 × 10 6 CFU / ml. </li><li> Mit den ersten beiden Sätzen von Zellverdünnungen für lebende Zellen mit PMA behandelt oder unbehandelt. </li><li> Um den dritten und vierten Satz von Zellverdünnungen, fügen 8 x 10 6 toten Zellen zu jeder Zelle Verdünnung (8 x 10 0 - 8 x 10 6) an lebenden und toten Zellgemischen zu machen. </li><li> Behandeln Sie den dritten Satz der Verdünnung mit PMA und verwenden Sie den vierten Satz der Verdünnung für die Steuerung. </li></ol> 6. Die Behandlung von Zellen mit PMA <ol><li> Lösen PMA in Dimethylsulfoxid (oder Wasser) auf 10 mM Stammlösung und bei -20 ° C im Dunkeln gelagert zu machen. </li><li> 400 ul Aliquot der lebenden Zellen, toten Zellen, und die Mischung von lebenden und toten Zellen indrei separate Mikroröhrchen. </li><li> 2,0 ml von 10 mM PMA jeder Zelle Aliquot auf eine Endkonzentration von 50 uM. </li><li> Die Proben inkubiert bei Raumtemperatur für 5 min in der Dunkelheit sanft ein paar Mal, 3 Sek. jedes Mal zittern. </li><li> 100 ul-Proben auf einer Platte mit 96 Vertiefungen. </li><li> Verschließen Sie die Platte mit einem optischen Film und stellte den Teller auf Eis. </li><li> Stellen Sie die Platte 20 cm von einer 650 W Halogen-Lichtquelle aussetzen und für 2 min für Belichtung. </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte bei 2500 g für 10 min, vorsichtig den Überstand verwerfen und sorgfältig abtropfen lassen die Platte auf ein Stück Papier zu absorbieren. </li><li> Resuspendieren Zellpellets in 50 ul DNA-Extraktionslösung durch Auf-und Abpipettieren zwanzigmal mit einem Mehrkanal-Pipetman. </li><li> Verschließen Sie die Platte mit einem Film, kochen Sie für 10 Minuten in ein Wasserbad, und Zentrifuge bei 2500 g für 2 min. Der Überstand in der Platte ist die DNA aus Zellen mit PMA und bereit für qPCR behandelt. </li><li> Führen qPCR wie beschrieBett über, unter Verwendung von 5 ul der DNA. </li></ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Eine primäre Ziel der Studie beinhaltet die Verwendung von einem ORF Z3276, eine einzigartige E. coli O157: H7, als alleinige Biomarker für qPCR-Assay. Derzeit sind die meisten qPCR-Assays Targeting Virulenz-Gene, wie stx1, stx2 und eaeA 1,2,5,6 oder gemeinsamen phänotypischen Gene, wie uidA 3,4, rfbE und fliC Gene 8,9. Gelegentlich Spezies oder Stamm kann nicht definitiv von Virulenz-Gen (e) identifiziert werden, wie stx 1 und 2 Gene stx, wie diese Gene bei verschiedenen Spezies oder Stämme 16 und vorhanden sind. Verwendung rfbE und fliC für Zielgene, beide Gene benötigt werden, um für eine vollständige Identifizierung 17 verwendet werden. Verwendung ORF Z3276 als Biomarker, hat qPCR-Assay wurde gezeigt, empfindlichen und spezifischen Test (Tabelle 1). H7-Stämme (n = 3: Dieser Test hat den strengen Inklusivität und Exklusivität Tests, einschließlich O157 zogen wurde67), über 100 nicht-O157-Stämme und andere pathogene Arten, wie Salmonella und Shigella. Alle O157: H7-Stämme untersucht wurden positiv detektiert und keine Kreuzreaktivität wurde von den nicht-O157-Stämme (Tabelle 1) gefunden, was anzeigt, dass der ORF Z3276 ist ein einzigartiges und starkes Biomarker zum Nachweis von E. coli O157: H7. Das andere Ziel der Studie ist es, lebende Zellen vor DNA-Extraktion selektiven Nachweis von toten Zellen durch PMA-Behandlung. PMA kann in der toten Zellen mit beeinträchtigter Membran durchdringen und an die DNA binden und hemmt so die DNA-Amplifikation von toten Zellen in 13 PCR. Wir haben die PMA-Behandlung Verfahren modifiziert und angepasst ist, um eine 96-Well-Plattenformat für das Verfahren. Die richtige Intensität der Belichtung notwendig, um die optimale Vernetzung Wirkung zu erzielen. Früher wurden Röhrchen aus diesem Schritt 13-15 verwendet. Allerdings sind separate Mikroröhrchen schwierig zu handhaben in Licht abBelichtungsschritt und diese Röhren nicht absolut transparent für die besten Cross-Geschmack zu erhalten. Verwendung eines 96-Well-Platte, konnten wir die Effizienz der PMA-Behandlung. Diese Änderungen können die Assays auf mehrere Arten beeinflussen: Sie machen es einfacher, eine gründliche und gleichmäßige Vernetzungseffekt zu erzielen, insbesondere bei einer Vielzahl von Proben, die behandelten Proben können von einer Platte zur anderen bewegt werden, um es möglich zu machen Detektion Vielzahl Proben, und sie liefern diese PMA-qPCR-Assay mit Automatisierungspotential für den gesamten Prozess. Die Einschränkung dieser PMA-qPCR-Assay ist, dass PMA-Behandlung erhöht die Kosten etwas PCR und die Empfindlichkeit der PCR-Assay leicht reduziert.

PCR ist eine übliche Technik zum Nachweis von E. coli O157: von Lebensmittel-und Umweltproben H7. Beschreibung spezifischer Biomarker für E. coli O157: H7 ist einer der Schlüsselfaktoren für die erfolgreiche Detektion in PCR-Assays. Die üblicherweise in PCR-Assays für den Nachweis von E. verwendet Biomarker coli O157: H7 gehören Shiga-Toxine (STX 1 und stx 2) 1,2, 3,4 uidA, eaeA 5,6, rfbE 7 und 8,9 fliC Gene. Diese Biomarker können variable Effizienz zur Identifizierung bereitzustellen, aber die meisten der Biomarker kann nicht als eine einzigartige Biomarker zum Nachweis von E. verwendet werden coli O157: H7. Diese Unzulänglichkeit in der Differenzierung von Zielgenen Leistung fordert mehr und stärker spezifische Biomarker (s) zur Identifizierung von E. coli O157: H7 10. Zahlreiche Sonden für Gene oder hypothetischen offenen Leserahmen (ORFs) in E. coliO157: H7 11 wurden für die qPCR-Assay auf der Grundlage der Hinweise von DNA-Microarrays Genotypisierung aus unserem Labor und durch die Suche in der Datenbank GenBank des National Center for Biotechnology Information ausgelegt. Die Reihenfolge der Z3276 ORF, der ein Gen Fimbrien-11 wurde für die qPCR-Assay ausgewählt. Anschließend wurde eine qPCR Assay durch zahlreiche Studien auf PCR-Parameter wie Konzentrationen von Primer und Sonden sowie Rungs-und Verlängerungstemperaturen (Daten nicht gezeigt) entwickelt. Nach Anreiz Inklusivität und Exklusivität Tests an Referenzstämme wie E. coli O157: H7, nicht-O157-und Shigella-Stämme in der qPCR wurde die ORF-Z3276 als eine spezifische und starke genetische Marker zur Identifizierung von E. identifiziert coli O157: H7. Dann entwickeln wir eine neue qPCR-Methode mit dieser einzigartigen Biomarker für die Identifizierung von E. coli O157: H7. Eine weitere Herausforderung bei der Detektion von E. coli O157: H7 in für kontaminierteMethoden und Umwelt ist eine genaue Bestimmung der lebenden Zellen aus Proben. Die erweiterte Präsenz von DNA aus toten Zellen und die Unfähigkeit zur Lebensfähigkeit in PCR-Assays unterscheiden könnte falsch-positive Werte verursachen, was zu einer Überschätzung von Live-Zahlen Zelle in Erkennung. Folglich schränkt dies die PCR-Nutzung in präzise Erkennung von Krankheitserregern 12. Ein neuer Ansatz zur DNA der toten Zellen differenzieren, wurde durch die Kombination von Propidium Monoazid (PMA) der Behandlung mit PCR-Verfahren in den letzten Jahren 13 bis 15 übernommen. PMA ist in der Lage, innerhalb der toten Zellen zu gehen, und die in die DNA interkalieren, wenn sie Licht ausgesetzt wird, aber es kann nicht innerhalb von lebenden Zellen gehen, um mit der DNA der lebenden Zellen reagieren. Somit wird in PMA-behandelten Mischungen von lebenden und toten Zellen, die DNA aus toten Zellen können in PCR 13 verstärkt werden. Wir kombinierten PMA-Behandlung mit dem neu entwickelten qPCR Assay zur selektiven Nachweis Live E. coli O157: H7-Zellen. Darüber hinaus haben wir die PMA-qPCR eine gemacht habenssay für Hochdurchsatz-Erkennung möglich.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="901">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">AB 7900HT Fast Real-time PCR system</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:319px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">2 x Universal master mix</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td align="right" style="width:171px;">4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">PrepMan Ultra</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td align="right" style="width:171px;">4318930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Primer Express</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="58" rowspan="2" style="height:58px;width:249px;">Probes</td>
			<td rowspan="2" style="width:164px;">ABI</td>
			<td>Top of Form</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">4316033 Bottom of Form</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">PMA</td>
			<td style="width:164px;">Biodium</td>
			<td align="right" style="width:171px;">40013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="87" rowspan="3" style="height:87px;width:249px;">Puregen cell and tissue kit</td>
			<td rowspan="3" style="width:164px;">Qiagene</td>
			<td>Top of Form</td>
			<td rowspan="3"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td align="right" height="29" style="height:29px;">158622</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">Bottom of Form</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">DU530 spectrophotometer</td>
			<td style="width:164px;">Beckman</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:164px;">NanoDrop Technology</td>
			<td style="width:171px;">&#160;ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">650 w halogen light source</td>
			<td style="width:164px;">Britek</td>
			<td style="width:171px;">H8061S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Otptical Adhesive film</td>
			<td>ABI</td>
			<td align="right">4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Optical 96-well reaction plate</td>
			<td>ABI</td>
			<td align="right">4316813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of live escherichia coli o157:h7 cells by pma-qpcr

Eine einzigartige offene Leserahmen (ORF) Z3276 wurde als ein spezifischer genetischer Marker für E. identifiziert coli O157: H7. Ein qPCR-Assay wurde für den Nachweis von E. entwickelt coli O157: H7, indem sie auf ORF-Z3276. Mit diesem Test können wir so niedrig wie ein paar Kopien des Genoms von DNA von E. erkennen coli O157: H7. Die Empfindlichkeit und Spezifität des Assays wurden durch intensive Validierungstests mit einer großen Anzahl von E. bestätigt coli O157: H7-Stämme (n = 369) und nicht-O157-Stämme (n = 112). Darüber hinaus haben wir Propidium Monoazid (PMA) Verfahren mit den neu entwickelten qPCR-Protokoll für den selektiven Nachweis von lebenden Zellen von toten Zellen kombiniert. Die Amplifikation von DNA aus PMA-behandelten toten Zellen wurde fast vollständig im Gegensatz zu nahezu unbeeinflusst Amplifikation von DNA aus PMA-behandelten lebenden Zellen gehemmt. Außerdem wird das Protokoll geändert wurde und auf eine 96-Well-Plattenformat für eine einfache und einheitliche Handhabung einer großen Anzahl von Proben geeignet. Tseine Methode wird erwartet, dass die Auswirkungen auf genaue mikrobiologische und epidemiologische Überwachung der Lebensmittelsicherheit und Umwelt Quelle haben.

Nachweis von E. coli O157: von qPCR mit ORF Z3276 H7 Einer der Schlüsselfaktoren für diesen Test ist die Sensitivität und Spezifität des Z3276 Sonde in der qPCR eingesetzt. Es kann als nur einige wenige Kopien des Genoms von DNA von E. erkennen coli O157: H7, wie in 1A gezeigt. Der 120 nicht-O157-Stämme untersucht, einschließlich der sechs großen nicht-O157 STEC-Stämme O104: H4-Stämme, Salmonella und Shigella-Stämme wurde keine Kreuzreaktivität festgestellt, wie in Tabelle 1 gezeigt. Die Kombination der Behandlung mit PMA qPCR Ausbrüten E. coli O157: H7-Zellen mit PMA (50 mM) für 5 min im Dunkeln und Belichten für 2 min wurden PMA Behandlungsbedingungen ausgewählt. Zusätzlich modifiziert wir PMA Behandlungsverfahren. Vergleich verschiedener transparenter Mikroröhrchen in dem Vernetzungsschritt verwendet wurde, wurde eine Platte mit 96 Vertiefungen gefunden, um effizienter zuerreichen die optimale Vernetzungseffekt und bequemer Handhabung einer großen Anzahl von Probenröhrchen während der Belichtungsprozess. Die Amplifikation von DNA aus PMA-behandelten lebenden und toten Zellen in qPCR Die Wirkungen von PMA-vermittelte Hemmung der Amplifikation von DNA aus toten Zellen in diesem Assay wurden qPCR in Fig. 1 durch die Verwendung von zwei seriellen 10-fachen lebenden oder toten Zellverdünnungen abgeleitete DNA gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass die aus den lebenden Zellen mit PMA (rote Kurve) und ohne PMA (blaue Kurve) behandelt erzeugt Kurven scheinen linearen und nahezu identisch zueinander. Leichte CT Wertdifferenzen zwischen den lebenden Zellen, die mit PMA und ohne PMA (1A) behandelt, die vermuten lassen, dass PMA-Behandlung hatte wenig Einfluss auf die Amplifikation der DNA der lebenden Zellen in der qPCR. Aber ein 15 - CT-Wert-Differenz (32.000-fach) wurde zwischen der toten Zellen mit PMA behandelt und ohne PMA, Demo gezeigtnstrating dass PMA-Behandlung effizient unterdrückt DNA-Amplifikation von den toten Zellen (Abbildung 1B). Nachweis von lebenden Zellen von lebenden und toten Zellgemischen in qPCR Zwei Sätze von lebenden Zellen Verdünnungen (8 x 10 0 - 8 x 10 6 CFU) wurden mit oder ohne PMA PMA behandelt, um lebende Zellen von Live / Dead-Zellgemischen zu erkennen. Die Ergebnisse qPCR (2A) gezeigt, eine parallel inverse progressive Entwicklung der CT-Werte, um die Zahl der lebenden Zellen behandelt (lila Balken) auf die unbehandelten Proben (blaue Balken) bezogen. Die behandelten lebenden Zellen ergab eine etwas höhere CT-Werte als die der unbehandelten lebenden Zellen. Eine ähnliche inverse progressive Tendenz in CT-Werte wurde mit der realen Zahl der lebenden Zellen in den mit PMA (grüne Balken) in 2B behandelt sowie Live / Dead-Zellgemischen beobachtet. Zusätzlich sind Abwärtstrend der CT-Werte wartrotz der Anwesenheit von 106 toten Zellen mit der Anzahl lebender Zellen in der Mischung beobachtet. Diese Ergebnisse zeigten, daß die CT-Werte der lebenden / toten Zellgemischen dargestellt DNA aus den lebenden Zellen alleine, während der DNA-Amplifikation aus den toten Zellen effizient durch PMA-Behandlung unterdrückt. Aber die CT-Werte von Live mit PMA behandelt / tote Zelle Mischungen wurden schwankte und es versäumt, reflektiert die Live-Zahlen Zelle in den Mischungen in 2B (gelbe Balken). <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50967/50967fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50967/50967fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Lebenden und toten Zellen mit PMA oder ohne PMA in qPCR-Assay behandelt. (A) Eine Serie von 10-fach verdünnte Live E. coli O157: H7 Zelle Verdünnungen (8 x 10 0 - 8 x 10 6 CFU) wurden mit PMA oder ohne PMA behandelt.Die CT-Werte stellen die Mittelwerte der CT dreifach in der qPCR-Assays. (B) Vergleich der DNA-Amplifikation von lebenden und toten Zellen mit PMA und ohne PMA in der q Vergleich qPCR-Assay behandelt. ΔRn bezieht sich auf Intensitätsänderung der Fluoreszenz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50967/50967fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50967/50967fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50967/50967fig2.jpg" /> 2. Differenzierung von lebenden Zellen von lebenden / toten Zellgemischen durch PMA-qPCR Vier Sätze von 10-fachen Verdünnungen von Zellkulturen (8 x 10 0 - 8 x 10 6 CFU). Wurden wie angegeben. (A) Erste Reihe von Zellverdünnung wurde mit PMA behandelt, während die zweite Zelle Verdünnung war oder unbehandelt, bevor die DNA-Extraktion.(B) 8 x 10 6 Tote Zellen wurden mit den dritten und vierten Sätzen von Zellen Verdünnungen vermischt, um zwei Sätze von lebenden / toten Zellgemische stellen, wie angegeben. Ein Satz der Zellgemische wurden mit PMA behandelt und die andere Gruppe wurde ohne PMA vor der DNA-Extraktion behandelt. Jeder Balken stellt den Mittelwert CT-Werte eines Dreifachversuch ± SD. <table><tbody><tr><td> Organismus </td><td> Serotyp </td><td> Anzahl der getesteten Stämme </td></tr><tr><td rowspan="15"> E. coli </td><td> 2006 Spinat O157: H7 Ausbruch Isolate </td><td> 186 </td></tr><tr><td> 2006 Taco Bell O157: H7-Isolate </td><td> 58 </td></tr><tr><td> 2006 Taco John O157: H7-Isolate </td><td> 11 </td></tr><tr><td> DMB Stammsammlungen von anderen O157: H7 Ausbrüche </td><td> 112 </td></tr><tr><td> O104: H4 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> O26 </td><td> 18 </td></tr><tr><td> O103 </td><td> 13 </td></tr><tr><td> O111 </td><td> 24 </td></tr><tr><td> O121 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> O45 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> O145 </td><td> 9 </td></tr><tr><td> O113 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> O91 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> O55 </td><td> 9 </td></tr><tr><td> Andere </td><td> 19 </td></tr><tr><td rowspan="2"> Salmonellen </td><td> Typhi </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Newport </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Shigella dysenteriae </td><td> 6 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Shigella sonnei </td><td> Unbekannt </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Shigella flexneri </td><td> 4 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Shigella boydii </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td colspan="2"> Gesamt </td><td> 481 </td></tr></tbody></table> TLage ein. Stämme für die Validierung in Echtzeit PCR-Test für die Identifizierung von E. verwendet coli O157: H7.

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Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

H7 gezielt eine einzigartige genetische Marker, Z3276: Ein qPCR-Assay wurde für den Nachweis von Escherichia coli O157 entwickelt. Die qPCR wurde mit Propidium Monoazid (PMA)-Behandlung für Lebendzellerkennung kombiniert. Dieses Protokoll wurde modifiziert und auf eine 96-Well-Plattenformat für die einfache und einheitliche Behandlung einer Vielzahl von Proben geeignet ist

Erkennung von Live-<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7-Zellen durch PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

16.5K Aufrufe.  Food and Drug Administration.  H7 gezielt eine einzigartige genetische Marker, Z3276: Ein qPCR-Assay wurde für den Nachweis von Escherichia coli O157 entwickelt. Die qPCR wurde mit Propidium Monoazid (PMA)-Behandlung für Lebendzellerkennung kombiniert. Dieses Protokoll wurde modifiziert und auf eine 96-Well-Plattenformat für die einfache und einheitliche Behandlung einer Vielzahl von Proben geeignet ist 

Serie: Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Ein Assay zur Messung der Aktivität von Escherichia coli Inducible Lysin Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Forschung

Biologie

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

High Throughput Screening von Fungal Endoglucanaseaktivität in Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Mapping Bakterielle Functional Netzwerke und Pathways in<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Verwendung von Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has become the method of choice for introducing DNA into prokaryotes that are not naturally competent. Electroporation is a rapid, efficient, and streamlined transformation method that, in addition to purified DNA and competent bacteria, requires commercially available gene pulse controller and cuvettes. In contrast to the pulsing step, preparation of electrocompetent cells is time consuming and labor intensive involving repeated rounds of centrifugation and washes in decreasing volumes of sterile, cold water, or non-ionic buffers of large volumes of cultures grown to mid-logarithmic phase of growth. Time and effort can be saved by purchasing electrocompetent cells from commercial sources, but the selection is limited to commonly employed E. coli laboratory strains. We are hereby disseminating a rapid and efficient method for preparing electrocompetent E. coli, which has been in use by bacteriology laboratories for some time, can be adapted to V. cholerae and other prokaryotes. While we cannot ascertain whom to credit for developing the original technique, we are hereby making it available to the scientific community.

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation is a commonly employed method for introducing DNA into bacteria in a process known as transformation. Traditional protocols for the preparation of electrocompetent cells are time consuming and labor intensive. This article describes an alternate, rapid, and efficient method for the preparation of electrocompetent cells presently employed by some laboratories.

Rapid-Protokoll für die Herstellung von Elektrokompetente<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Und<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

Protokolle für die Implementierung einer<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Basierend TX-TL Zellfreie Expression System für Synthetische Biologie

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

Nicht-chromatographischen Reinigung von rekombinantem Elastin-ähnliche Polypeptide und deren Fusionen mit Peptiden und Proteinen aus<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

Die vielfältigen Vorteile von Protein Co-expression in<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.

Der Nachweis von modifizierte Formen von Cytosin Mit Sensitive Immunhistochemie

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

Methode zur Kennzeichnung Transkripte in einzelnen Escherichia coli Zellen für Einzelmolekül-Fluoreszenz In Situ Hybridisierung Experimente