Die Autoren danken den Kollegen und Mitarbeiter von Gegenwart und Vergangenheit Laboratorien, die die Entwicklung dieser Technik unterstützt haben. SP Labor wird von der kanadischen Institut für Gesundheitsforschung unterstützten Betriebskostenzuschuss der MOP-84473 und Alberta Innovates-Health Solutions (von der Alberta Heritage Foundation for Medical Research Stiftungsfonds finanziert). DP wurde von National Institutes of Health gewährt MD001091-01 und GM068855-02.

1. Vorbereitung von Bakterienkulturen, Tools und Reagenzien (TAG 1, Nachmittag) <ol><li> Am späten Nachmittag, impfen 1-5 ml LB-Medium autoklaviert in sterilen (zum Beispiel 100 x 13 mm) Borosilikat-Glasröhrchen mit einem kleinen Aliquot der Bakterien (E. coli oder V. cholerae). </li><li> Stellen Sie die geimpft Reagenzgläser in einem Bandage bei 37 ° C Temperatur (warmen Raum oder Inkubator) untergebracht ist, schalten Sie die Bandage mit hoher Geschwindigkeit, und Inkubation O / N. </li><li> Vorbereitung eines Zellverteilers in Form eines &quot;Hockeyschläger&quot; aus einem Glasstab durch Erwärmen der Mitte des Stabs in die Flamme eines Bunsenbrenners, bis das Glas weich wird und dann direkt die Kurve sanft mit einer Pinzette oder Zange in einem 135 °-Winkel . Erwärmen die Stange noch einmal in der Mitte zwischen dem Ende und der ersten Biegung und biegen in einem 45 ° Winkel nach innen (in die entgegengesetzte Richtung der ersten Biegung). </li><li> Bereiten LB-Agar ohne Antibiotika und in Petrischalen gießen in Vorbereitung derelectrocompetence Protokoll, und LB-Agarplatten mit den entsprechenden Antibiotika (entsprechend dem Resistenzmarker auf dem Vektor elektroporiert werden), und bei 4 ° C. </li><li> Bereiten Sie einen Filter sterilisiert 2 mM CaCl 2-Lösung für V. cholerae oder Autoklaven ddH2O für E. coli, und bei 4 ° C </li></ol> 2. Das Wachstum der Elektrokompetente Bakterien (Tag 2, Morgen) <ol><li> Geben Sie 100 ul der O / N Bakterienkultur auf jedes LB-Agar-Platte, kann gefrorenen Glycerin Aktien auch verwendet und direkt auf die Platte geliefert werden. </li><li> Tauchen Sie den Hockeyschläger-förmige Zelle Treuer in 100% EtOH, kurz abtropfen lassen und verbrennen die restlichen EtOH, um es vor der Verwendung und Verbreitung zu sterilisieren. Verbreiten Sie die 100 ul O / N Bakterienkultur gleichmäßig mit der sterilen Glaszelle Treuer was sicher nicht zu (Pause) die Agar-Oberfläche stören. </li><li> Die Platte bei 37 ° C für 4-6 Stunden, oder bis ein dünner Rasen des Bakterienwachstums seinkommt zu unterscheiden. Zellen sind kompetentesten, wenn aktiv wachsenden. </li></ol> 3. Herstellung von Elektrokompetente Bakterienzellen (DAY 2, Nachmittag) <ol><li> Ernten Sie die Bakterien mit einer sterilen Impföse was sicher nicht zu durchbohren oder brechen die Oberfläche des Agar. Ein 2 mm Durchmesser Bakterienmasse ist ausreichend für eine einzige Transformation. Typischerweise erfordert dies, Abkratzen der Oberfläche des dünnen Rasen mit der Impföse zwei-oder dreimal. Mehrere Proben (typischerweise zwischen 4-6) aus der gleichen Platte gesammelt werden. </li><li> Resuspendieren Sie das Bakterienmasse in 1 ml eiskaltem 2 mM CaCl 2 (für V. cholerae) oder sterilem ddH 2 O (für E. coli) und gut mischen, bis keine Klumpen sichtbar sind, auf Eis zu halten. </li><li> Centrifuge jeder Bakteriensuspension für 5 min bei 5.000 xg in einer Kühlmikro auf 4 ° C oder in einer Mikro in einem kalten Raum auf 4 ° C eingestellt gespeichert sind </li><li> Überstand verwerfen, resuspEnde der Bakterienpellet im gleichen Volumen eiskaltem 2 mM CaCl 2 oder sterile ddH 2 O, und wiederholen den Zentrifugationsschritt wie vor noch zweimal für insgesamt drei Waschungen durchgeführt. </li><li> Überstand entfernen, resuspendieren und dann lösen Sie die Bakterienpellet gründlich in 40 ul eiskaltem 2 mM CaCl 2 oder sterilen ddH2O und auf Eis zu halten. </li></ol> 4. Die Transformation der elektro Bakterien (Tag 2, Nachmittag) <ol><li> Fügen Sie bis zu 1 pg Plasmid-DNA (in bis zu 1 ul Wasser oder Tris-EDTA-Puffer) an die 40 ul Bakteriensuspension und übertragen Sie diese Mischung in eine vorgekühlte, sterile 0,2 cm Abstand Küvette. Die Salzkonzentration in der DNA-Probe ist ein niedrig sein, da es zu Lichtbogenbildung des Impulses in der nächsten Stufe bei. </li><li> Setzen Sie die Küvette in die Elektroporation Kammer des Impulssteuermodul und Elektroporation bei 1,8 kV, 25 uF. Die Zeitkonstante sollte ~ 5,0 ms sein und keine Lichtbogenbildung auftreten. </li><li> Erholen sich schnell die Zellsuspension durch Resuspendieren in 1 ml LB-Medium übertragen und in vorher autoklaviert Borosilikatglas Reagenzglas. </li><li> Lassen Sie die Zellen durch Inkubation unter belüfteten Wachstumsbedingungen (in einem Rollentrommel) bei 37 ° C für 30 min ohne antibiotische Selektion zu gewinnen. </li><li> Platte, die Bakterien auf die zuvor vorbereiteten LB-Agar-Platten in Gegenwart der entsprechenden Selektionsmittel (Antibiotikum), und bei 37 ° CO / N. Wenn Bakterien werden mit einer hohen Konzentration von gereinigten Vektor (0,1-1 ug supercoiled Plasmid) transformiert, liefern 10 ul der Bakterienkultur auf den Rand des LB-Agar-Platte und mit einer sterilen Impföse Serie für isolierte Kolonien mit dem Quadranten Streifen-Methode. Wenn ein Ligationsgemisch transformiert, liefern 100 ul der Bakterienkultur auf jede Agar-Platte und gleichmäßig verteilt es mit der sterilisierten Glaszelle Treuer. </li></ol> a Wenn die Zeitkonstante ist kurz (seinniedrigen 3,5 msec) oder Pulsieren führt zu Lichtbögen, dann wieder fällt das DNA-Probe, waschen mit 70% EtOH zweimal, um Salze zu entfernen und vor dem Trocknen in TE-Puffer resuspendiert.

<ol>
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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+electroporation+and+cloning+vector+system+for+gram-positive+bacteria.">Improved electroporation and cloning vector system for gram-positive bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 57 (4), 1194-1201 (1991).</li><li>Micheletti, P. A., Sment, K. A., Konisky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+coenzyme+M-auxotrophic+mutant+and+transformation+by+electroporation+in+Methanococcus+voltae.">Isolation of a coenzyme M-auxotrophic mutant and transformation by electroporation in Methanococcus voltae.</a> J. Bacteriol. 173 (11), 3414-3418 (1991).</li><li>Schleper, C., Kubo, K., Zillig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+particle+SSV1+from+the+extremely+thermophilic+archaeon+Sulfolobus+is+a+virus:+demonstration+of+infectivity+and+of+transfection+with+viral+DNA.">The particle SSV1 from the extremely thermophilic archaeon Sulfolobus is a virus: demonstration of infectivity and of transfection with viral DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (16), 7645-7649 (1992).</li><li>Aune, T. E., Aachmann, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+to+increase+the+transformation+efficiencies+and+the+range+of+bacteria+that+can+be+transformed.">Methodologies to increase the transformation efficiencies and the range of bacteria that can be transformed.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 85 (5), 1301-1313 (2010).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> J. Mol. Biol. 166, 557 (1983).</li><li>Unterweger, D., Kitaoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+Type+VI+Secretion+System+Expression+Gives+Vibrio+cholerae+Intra-+and+Interspecific+Competitive+Advantages.">Constitutive Type VI Secretion System Expression Gives Vibrio cholerae Intra- and Interspecific Competitive Advantages.</a> PLoS One. 7 (10), e48320 (2012).</li></ol>

Keine Angaben gelten.

Transformationseffizienz ist Gegenstand einer Vielzahl von Faktoren ab, unabhängig von der verwendeten, um kompetente Zellen herzustellen Verfahren. Analog Variablen gelten für diese Verfahren, muss darauf geachtet werden, dass, wenn die Zellen von der Agar-Platte, so dass sie bei einer konstanten kalten Temperatur (nicht höher als 4 ° C) gehalten wird geerntet. Der Bakterienrasen muss aktiv wachsenden werden zum Zeitpunkt der Sammlung; Zellen müssen in mittleren logarithmischen Phase des Wachstums sein. Qualität der DNA (dh Verschmutzung der Salze) beeinflusst Transformationseffizienz. Insbesondere bei Verwendung dieses Verfahrens der Agar nicht gebrochen wird, wie Agar-Fragmente in der Küvette wird der Pulsschlag verursachen. Die meisten Probleme bei dieser Technik angetroffen werden, mit zwei Problemen verbunden ist; Sammeln der Bakterien während der richtigen Zeitfenster von der Agar-Platte, wenn sie aktiv wächst. Sammeln sie zu früh unzureichend Zellzahlen ergeben und führt zum Erlöschen derAbschaben der LB-Agar-Platte frustrierend, weil die &quot;pellicule&quot; bilden sie ist schwer zu heben Sie die Oberfläche der Platte. Sammeln Bakterien zu spät, werden ihre Kompetenz drastisch verringern. Das Zeitfenster wird natürlich in Abhängigkeit von der Dichte des Inokulums auf den LB-Agarplatten variieren. Der zweite entscheidende Schritt ist, um die Bakterien aus dem Moment, wo sie von der Agar-Platte angehoben werden und in CaCl 2 oder ddH2O suspendiert, bis sie auf der LB-Agar plattiert sind folgende Transformation kaltem (4 ° C) zu halten. Die Mikrozentrifugenröhrchen, die die Bakterien, Küvetten und Puffer sollte vorgekühlt sein und auf Eis gehalten, zu allen Zeiten, bis die Bakterien überzogen sind. Allerdings können zusätzliche Probleme entstehen, wenn die sterile ddH2O oder CaCl 2 enthalten oder Niederschlag verunreinigt sind. Aus diesem Grund empfehlen wir, dieses Reagenz frisch zubereiten. Fehlerbehebung Transformation wird durch die auch Kontrollen bei der Transformation ba erleichtertcteria kompetent gemacht mit keiner Methode. Eine negative Kontrolle, die aus einer Charge von nicht-transformierten kompetenten Bakterien auf einem LB-Agar-Platte, die den Selektionsmarker ausplattiert schnell zu bestimmen, ob das Antibiotikum auf der Platte wirksam ist. Eine positive Kontrolle Transformation mit einem Plasmid bekannt Herstellung von guter Qualität und Quantität beherbergen die gleiche selektive Marker als Versuchsprobe wird bei der Bestimmung, ob die Bakterien zuständig sind, sondern auch, ob die transformierten experimentellen DNA war in ausreichender Menge oder Qualität hilfreich sein. Die Vorteile dieser Technik sind mehrere, kann das Verfahren in dem selben Tag, eine Transformation geplant durchgeführt werden. Wir haben festgestellt, dass gefrorene Bakterien Glycerin Lager direkt auf der LB-Agar ohne Verlust an electrocompetence plattiert werden, wir haben dies in &quot;Notfall&quot;-Situationen getan (nach vergessen, den Tag vor der Nacht der Kultur beginnen). Zwar konnten wir nicht testen, eBelastung sehr bekannt ist, keine E. coli oder V. Cholera-Stamm, die durch Elektroporation transformiert werden können, ist in unseren Händen zugänglich zu diesem Protokoll. Das Verfahren ist schnell, effektiv und Ausbeuten Transformationseffizienz vergleichbar mit denen von Herstellung elektro Bakterien Anwendung traditioneller Verfahren erhalten. Das Verfahren beseitigt das Erfordernis für Hochgeschwindigkeitszentrifuge und zugehörigen Rotoren, einem Orbitalschüttler Inkubator und sterile Zentrifugenbehälter (Container), und große Mengen von Puffer autoklaviert. Obwohl die Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte ist recht umfassend, werden die meisten Labore, durchführen Elektroporation meisten, wenn nicht alle, dieser Materialien bereits verfügbar. Vielleicht am wichtigsten ist, kann die Technik ohne weiteres angewendet werden, um elektrospezifische Laborstämme mit Mutantenhintergründe schnell zu generieren. Wir wissen nicht, irgendwelche Einschränkungen dieser Technik, wie es die traditionelle Methode der Herstellung von Elektro ersetzttrocompetent Bakterien in unserem Labor. Die Ergebnisse der hier gezeigten Experimente wurden mit frischem elektrokompetente Zellen, die mit dem herkömmlichen Verfahren, die bei -80 ° C über 1 Woche lang gelagert worden waren, nicht mehr hergestellt werden durchgeführt. Allerdings, gefroren elektro Zelle Aktien verlieren Kompetenz und Lebensfähigkeit oder über längere Lagerung. Unsere gekürzte Protokoll erlaubt am selben Tag die Transformation ohne Bedenken über das Alter der Aktie, die zu einer verminderten Trans Ausbeute führen kann plante die Zubereitung frischer elektroZellen. Wir haben versucht Speicherung elektro Zellen hergestellt durch das Schnellverfahren zur Verwendung an einem anderen Tag, da dies nicht notwendig war. Wenn dies hier nicht dargestellt ist, die Effizienz der elektro Zellen unter Verwendung unserer schnelles Verfahren ist ausreichend für Ligationsgemische. Die für Nicht-O1 V. berichtet Transformationen cholerae in einem kürzlich erschienenen Artikel von Unterweger et al.17 wurden unter Verwendung von elektro Bakterien durch das hier beschriebene (mit Ausnahme der durch Konjugation durchgeführt)-Methode hergestellt wurde. Diese Technik bietet Forschern, Stämme mit mutierten Hintergründe schnell und effektiv, ohne große Chargen von Zellen herzustellen verwandeln. Diese schnelle Herstellung von elektro Bakterien Methode könnte zu anderen Prokaryoten, die gezeigt wurden Elektroporation zugänglich zu sein, wie das Prinzip der Herstellung und die Elektroporation Einstellungen gehen, um die gleichen wie die der traditionellen Protokolle sein angepasst werden.

Seit seiner &quot;Gründung in den frühen 1980er Jahren ein, hat der Elektroporation zu einem integralen Molekularbiologie Technik, wahrscheinlich die häufigste eingesetzt, um / Transfektion lebende Zellen mit kreisförmigen oder linearen Nukleinsäuren Transformationsmethode. Ursprünglich für die Transfektion von eukaryotischen Zellen 1 entwickelt wurde Elektroporation anschließend für die Transformation von E. angepasst coli, 2, 3. In Bakteriologie, hat Elektroporation werden die Laborstandard und wurde modifiziert, um ein breites Spektrum von Bakterien, einschließlich gramnegativen Pseudomonas 4, 5 Salmonellen, Vibrionen 6, Serratiae, Shigellen und 7 zu verwandeln, Gram-positive Clostridien 8, 9 Bazillen, Laktobazillen 10 und Enterokokken 11. Sogar einige Archaebakterien haben durch Elektroporation für eine Transformation erwiesen, einschließlich Methanococcen </em&gt; 12 und Sulfolobus 13 Arten. Eine umfassende Übersicht finden Sie Aune und Aachmann 14 verweisen. Effizienz der Transformation durch Elektroporation ist angeblich 10 bis 20-fach höher als chemische Kompetenz oder Hitzeschock-2. Doch ähnlich wie die Vorbereitung Bakterien für die chemische Kompetenz als von Douglas Hanahan in den 1980er Jahren 15 optimiert, Zellen müssen auch bereit, um elektro sein. Elektroporation ist ein schnelles und wirksames Mittel zur bakteriellen Transformation, erfordern elektro Bakterien, gereinigte DNA, ein Pulssteuermodul, das den elektrischen Impuls liefert, und eine Kammer, die kleine Einweg-Küvetten, die als Elektrode fungiert aufnimmt. Kurz gesagt, werden kalt, kompetente Bakterien mit Plasmid-DNA, um einen Hochspannungsimpuls in einer Küvette unterzogen, in Wachstumsmedium resuspendiert, bei 30-37 ° C für 30-45 min inkubiert und dann auf halbfestem Medium (Nähragar ausplattiert Platten) mit ca.opriate selektive Antibiotikum. Im Gegensatz zu dem pulsierenden Schritt der Herstellung elektrokompetenter E. coli bleibt ein mehrteiliges Verfahren, das traditionell in großen Mengen durchgeführt wird. Kurz gesagt, wird eine Übernachtkultur von Bakterien in einen Erlenmeyerkolben mit 100 ml auf 1 Liter Luria Broth (LB), den mittleren logarithmischen Wachstumsphase (OD 600 von &lt;1,0) gezüchtet, und die Serien Waschen mit einem sterilen nicht unterworfen inokuliert ionischen Puffer oder doppelt destilliertem Wasser (ddH 2 O) in abnehmender Mengen bei 4 ° C. Muss mit großer Sorgfalt getroffen werden, um die Zellen zu kalt während des gesamten Verfahrens zu halten und verhindern, dass Verunreinigungen sein. Dies erfordert die Verwendung von Autoklaven Zentrifugation Eimer und nichtionischen Puffer oder ddH 2 O, einem Schüttler-Inkubator, eine große Menge Hochgeschwindigkeits-Kühlzentrifuge und einen Satz von Rotoren. Bakterien werden schließlich in einem kleinen Volumen Puffer mit 10% Glycerin resuspendiert und in ~ 40 &amp;mgr; l Volumina, wh aliquotiertICH werden bei -80 ° C bis zur Verwendung gelagert. Tieftemperatur-Speicher führt oft zu einer verringerten Transformationseffizienzen durch den Verlust der Lebensfähigkeit über die Zeit. Elektrobakterienzellen sind von einer Vielzahl von kommerziellen Quellen, aber nur für eine begrenzte Anzahl von (oft Rekombinations-defizient) E. verfügbaren coli-Stämmen, die herkömmlich als Gastgeber eine breite Palette von Plasmiden zu propagieren. Als Ergebnis Forscher verlassen sich auf in-house Methoden, um ihre eigenen Stämme / Mutanten für die Transformation vorzubereiten. Eine alternative, schnelle und effiziente Protokoll für die Herstellung von elektrokompetenten E. coli im Einsatz von ein paar molekulare Bakteriologie Labors seit einiger Zeit und hat zusätzliche Gram-negative Bakterien erweitert, in unserem Fall V. cholerae. Der Urheber der Protokoll kann nicht identifiziert werden, da er von anderen Forschern über die Zeit optimiert. Das hier vorgestellte Verfahren wurde in unserer laborator verwendeties seit fast zwei Jahrzehnten, und es ist unser Ziel, diese nützliche Protokoll mit unseren Kollegen teilen.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Module</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2668</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Cuvette Chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2669</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrocuvettes (0.2 cm gap)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 x 100 mm Pyrex Rimless Culture Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>70820-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 mm Culture Tube Closures</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-04500-00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 x 250 mm Glass Rod</td>
			<td>Lab Source</td>
			<td>11381D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Drum Motor Assembly</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1053-4004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Drum for 13 x 100 mm Culture Tubes</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1053-0306</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Chemicals</td>
			<td>C5670</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, anhydrous/denatured</td>
			<td>Sigma Chemicals</td>
			<td>227649</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating Loop</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>MP182-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Microcentrifuge 5451 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22621425</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen Burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-917Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth MILLER</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.10285.0500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25127</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid protocol for preparation of electrocompetent escherichia coli and vibrio cholerae

Die Elektroporation hat sich ein weit verbreitetes Verfahren zur schnellen und effizienten Einführung fremder DNA in eine Vielzahl von Zellen. Elektrotransformation hat sich die Methode der Wahl für die Einführung von DNA in Prokaryonten, die nicht natürlich kompetent sind. Elektroporation ist eine schnelle, effiziente und optimierte Transformationsmethode, die, zusätzlich zu DNA gereinigt und kompetente Bakterien erfordert kommerziell erhältlichen Gen Impulscontroller und-Küvetten. Im Gegensatz zu dem pulsierenden Schritt ist die Herstellung von elektrokompetenten Zellen zeitaufwendig und arbeitsintensiv das wiederholte Runden Zentrifugation und Waschen in abnehmender Mengen von sterilen, Kaltwasser, oder nicht-ionische Puffer, der große Mengen der Kulturen mittleren logarithmischen Phase gezüchtet Wachstum. Aufwand kann durch den Erwerb elektro Zellen aus kommerziellen Quellen gespeichert werden, aber die Auswahl beschränkt sich üblicherweise verwendeten E. coli Laborstämme. Wir werden hiermit eine schnelle Verbreitung undeffizientes Verfahren zur Herstellung von elektrokompetenten E. coli, das in Gebrauch ist bakteriologisch Laboratorien für einige Zeit, bis V können angepasst werden cholerae und anderen Prokaryoten. Wir können zwar nicht festzustellen, wem sie Kredit für die Entwicklung der ursprünglichen Technik werden wir hiermit zur Verfügung zu der wissenschaftlichen Gemeinschaft.

Wir führten eine Reihe von Transformationen mit E. coli und V. cholerae, um Transformationseffizienz von unserer schnellen Methodik mit einer Anpassung des (traditionellen)-Methode ursprünglich von Dower et al. 2 für die Herstellung von elektro Bakterien beschrieben vergleichen. Zur Durchführung der traditionellen Herstellung von kompetenten Zellen wurden 500 ml LB in einem 2-L-Erlenmeyerkolben mit 500 ul-Nacht-Kultur von E. geimpft coli DH5a oder V. cholerae O395, in einem Orbitalschüttler (215 Upm bei 37 ° C) inkubiert und bei OD 600 von 0,5-1,0 geerntet. Der Kolben wurde auf Eis gekühlt und die Kulturen in ein vorgekühltes Rotor zentrifugiert bei 4000 g für 10 min bei 4 ° C. Die Zellpellets wurden gründlich in 500 ml eiskaltem 2 mM CaCl 2 resuspendiert V. cholerae und ddH2O für E. coli und erneut unter denselben Bedingungen zentrifugiert. Folgerunden Aufwirbelung eind Zentrifugation wurden in abnehmender Mengen von 200 und 100 ml Volumen machen, dass die Kultur blieb bei 4 ° C gekühlt durch Schließlich wurde eine Resuspendierung und Zentrifugation in einem 10 ml Volumen mit 10% Glycerin durchgeführt. Das endgültige Pellet wurde in 2 ml 10% Glycerin resuspendiert und 40 ul Aliquots wurden bei -80 ° C eingefroren und nicht länger gespeichert als eine Woche vor der Elektroporation. Elektroporation Bedingungen einschließlich Pulseinstellungen und Küvettengröße waren unabhängig von Verfahren zur Herstellung von kompetenten Zellen für beide Bakterienarten in allen electroporations. Der einzige Unterschied war, dass wir durchgeführt, die wäscht in kaltem ddH2O für E. coli-und Kalt 2 mM CaCl 2 für V. cholerae. Tabelle 1 zeigt Ergebnisse von Bakterien durch Elektroporation kompetent gemacht identisch, aber entweder mit dem schnellen Protokoll oder mit dem herkömmlichen Verfahren transformiert. Wir beschäftigten Stamm O395 und DH5a als gemeinsamely verwendet, repräsentative Stämme von V. cholerae und E. coli sind; können ähnliche Ergebnisse mit anderen Stämmen der gleichen Spezies erhalten werden (wenn auch nicht jeder Stamm wurde getestet) und andere Gram-negative Bakterien und wahrscheinlich außerhalb angepasst wahrscheinlich. Um sicherzustellen, dass gleiche Zellzahlen in jeder Charge gepulst anwesend waren, wurden elektro Bakterien erzeugt die Nutzung der Schnellmethode bei Abholung gebündelt, gemischt, gehalten homogen suspendiert und kurz vor der Elektroporation in 40 ul-Volumina aliquotiert. Elektro Bakterien erzeugt unter Verwendung der traditionellen Methode wurden in ähnlicher Weise vor dem Einfrieren in 40 ul Aliquots behandelt. Nach Abgabe des Impulses wurde jede Charge von 40 ul Elektroporation Bakterien in 400 ul LB suspendiert und seriell 1:10 verdünnt. Einhundert Mikroliter jeder Verdünnung wurden auf LB-Agar in Gegenwart von 100 ug / ml Ampicillin verteilt und unter Verwendung eines sterilen Glaszelle Treuerund bei 37 ° C über Nacht inkubiert. Um die Gesamtzahl der Bakterien in jeder Transformation verwendet zu quantifizieren, wurden 40 ul-Volumina von elektro Bakterien jeder vorbereiteten Partie seriell verdünnt und ohne Antibiotika identisch parallel auf LB-Agar. Ein Aliquot gleich behandelt werden Bakterien aus jeder Charge wurde mit 1 ul Tris-EDTA (TE)-Puffer, aber ohne DNA (mock-Transformation), seriell verdünnt und auf LB-Agar ohne Antibiotika, die Anzahl der Zellen, die durch die Lieferung der verlorene schätzen Elektroporation elektrischen Impuls. Schließlich ist eine weitere Variation der Versuch wurde bei 37 ° C in 1 ml LB nach Elektroporation jedoch vor, auf LB-Agar-Überzug würde die Rückgewinnung von transformierten Zellen beeinflussen geführt, ob 30 min Inkubation zu bestimmen. Kolonie-bildenden Einheiten (CFUs) wurden am folgenden Tag gezählt. Für dieses Experiment verwendeten wir pUC18, ein gemeinsames Labor Plasmid und Chargen von kompetenten Bakterien, bestehend aus einemtwa 10 8 KBE für Zellen hergestellt, wobei die traditionelle Methode und 10 7 KBE für Zellen hergestellt, wobei die schnelle Protokoll. Elektroporation allein (ohne DNA) reduziert tragfähige KBE von 10-100 fach unabhängig von der verwendeten, um die elektro Zellen herzustellen Methode. Wie in Tabelle 1 gezeigt, war Trans Ausbeute im Bereich von 10 6 bis 10 7 CFU / ug DNA-Bereich in drei Wiederholungsexperimenten (Standardabweichungen in Klammern) für E. coli (DH5 &amp;agr;) und V. cholerae (O395), die jeweils mit der herkömmlichen, längere Verfahren zur elektroZellPräparation. Trans Ausbeute erschien um 10-fach bis 10 5 bis 10 6 KBE / ug DNA in drei Wiederholungsexperimenten (Standardabweichung in Klammern) für E. coli und V. cholerae jeweils mit der schnellen Methode. Aus diesem Grund entschlossen wir den Prozentsatz der transformierten Bakterien durch Teilung verwandelt KBEdurch die Anzahl der KBE von &quot;Schein-Transformationen&quot; (ohne Plasmid) erholte sich von sonst identischen Chargen von kompetenten Zellen. Der Prozentsatz der transformierten Bakterien wurde innerhalb eines log (2,5-9,4%), unabhängig von dem Herstellungsverfahren und transformiert (Tabelle 1 Zahlen in Klammern)-Spezies. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Effizienz des Schnellverfahren ist vergleichbar mit der des herkömmlichen Verfahrens zur Herstellung von längeren kompetenten Zellen und die repräsentative Stämme von Vibrio cholerae und Escherichia coli sind ebenfalls zugänglich für die schnelle Prozedur. Wir fanden, dass die Transformationseffizienz für Plasmide wie pUC18 beherbergen β-Lactamase-Kassetten nicht durch die Wiederherstellungszeit von 30 min in LB-Medium beeinflusst. Die gleiche Anzahl an Transformanten wurden gewonnen, ob die Zellen auf LB-Agar in Gegenwart von Ampicillin unmittelbar nach der Elektroporation, oder ob sie eine Wiederherstellungszeit von 30-45 min erlaubtin LB-Brühe bei 37 º C vor dem Beschichten. Unsere Ergebnisse, dass Ampicillin-Resistenz nicht Auswuchs unter nichtselektiven Bedingungen erfordern legt nahe, dass β-Lactamase-Expression erfolgt ausreichend schnell auf Transformation. Es sollte jedoch angemerkt, dass wir geführt serielle Verdünnungen von gepulsten Bakterien in LB-Brühe, die Erholung von dem elektrischen Schlag bei und initiieren Genexpression haben können. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50684/50684fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Graphische Darstellung der Methode zur schnellen Herstellung von elektro Bakterien. Nach 4-6 Stunden (abhängig von der Dichte des Inokulums) eine ausreichende Zahl von Bakterien können gesammelt werden, um aus einer LB-Agar-Platte durchzuführen vier vor sechs Transformationen. Um die gleiche Anzahl von kompetenten Zellen für jeden Endvolumen auf elektroporiert werden, zu gewährleisten, wurden die Bakterien aus der LB-Agar-Platte gesammelt zunächst gesammelt und dann zusammen gewaschen alin 40 ul-Volumina in Abhängigkeit von der Größe des Pellets iquoted (größere Pellets wurden in größeren Mengen teilbar durch 40 ul verdünnt). <table border="1"><tbody><tr><td colspan="3"> Anzahl der Ampicillin-resistenten Transformanten / ug DNA (Ampicillin-resistenten Transformanten gewonnen [%]) </td></tr><tr><td> Dehnungs </td><td> Traditionelle Methode </td><td> Rapid-Verfahren </td></tr><tr><td> E. coli (DH5 &amp;agr;) </td><td> 2,3 x 10 6 (± 7,3 x 10 5) [9,4%] </td><td> 3 x 10 6 (± 7,1 x 10 5) [2,5%] </td></tr><tr><td> V. cholerae (O395) </td><td> 4 x 10 7 (± 1,7 x 10 7) [5%] </td><td> 6,7 x 10 5 (± 2,1 x 10 5) [3,3%] </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Die Transformationseffizienz pro Mikrogramm DNA (pUC18) des elektro bacteria nach der traditionellen Methode im Vergleich zu der schnellen Methode hergestellt. Alle Umsetzungen wurden mit 500 ng pUC18-DNA durchgeführt (~ 80% supercoiled DNA, wie durch 1% Agarosegel-Elektrophorese sichtbar) und die elektroporierten Zellen wurden seriell 10-fach verdünnt in LB-Brühe vor für CFU auf LB-Agar mit Antibiotika beschichtet. Kontrollen von Nicht-Bakterien elektroporiert und Bakterien elektroporiert ohne Plasmid, seriell verdünnt und auf LB-Agar ohne Antibiotika wurden für jeden Satz von Transformationen durchgeführt, um die Anzahl der lebensfähigen Bakterien vor und nach dem Pulsen zu bestimmen. Die Elektroporation Kontrollen repräsentiert die Basislinie für die Prozent der lebensfähigen Bakterien erfolgreich transformiert.

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Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Elektroporation ist ein häufig verwendetes Verfahren zur Einführung von DNA in Bakterien in einem als Transformation bekannt. Traditionellen Protokolle zur Herstellung von elektrokompetenten Zellen sind zeitaufwendig und arbeitsintensiv. Dieser Artikel beschreibt eine alternative, schnelle und effiziente Methode zur Herstellung von elektrokompetenten Zellen derzeit von einigen Labors eingesetzt.

Rapid-Protokoll für die Herstellung von Elektrokompetente<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Und<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

rapid-protocol-for-preparation-electrocompetent-escherichia-coli

Research

JoVE Journal

Biology

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

76.2K Aufrufe.  University of Texas Brownsville.  Elektroporation ist ein häufig verwendetes Verfahren zur Einführung von DNA in Bakterien in einem als Transformation bekannt. Traditionellen Protokolle zur Herstellung von elektrokompetenten Zellen sind zeitaufwendig und arbeitsintensiv. Dieser Artikel beschreibt eine alternative, schnelle und effiziente Methode zur Herstellung von elektrokompetenten Zellen derzeit von einigen Labors eingesetzt. 

Serie: Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Vibrio cholerae: Model Organism to Study Bacterial Pathogenesis - Interview

Vibrio cholerae: Model Organism, um bakterielle Pathogenese Study - Interview

Forschung

Biologie

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Ein Assay zur Messung der Aktivität von Escherichia coli Inducible Lysin Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

High Throughput Screening von Fungal Endoglucanaseaktivität in Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Mapping Bakterielle Functional Netzwerke und Pathways in<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Verwendung von Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identifizierung von Protein-Komplexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

Protokolle für die Implementierung einer<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Basierend TX-TL Zellfreie Expression System für Synthetische Biologie

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

Erkennung von Live-<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7-Zellen durch PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

Nicht-chromatographischen Reinigung von rekombinantem Elastin-ähnliche Polypeptide und deren Fusionen mit Peptiden und Proteinen aus<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

Die vielfältigen Vorteile von Protein Co-expression in<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...