Diese Arbeit wurde von der NSF Research Triangle MRSEC (DMR-1121107) unterstützt.

1. ELP Expression <ol><li> Impfen 3 ml steriler Terrific Broth Medien mit einer DMSO-Stamm oder Agar-Platte Kolonie von E. coli geeignet zur Proteinexpression, das den gewünschten ELP-kodierenden Plasmid unter der Kontrolle des T7-lac-Promotor enthält. Fügen Sie den entsprechenden Antibiotikum und bei 37 ° C über Nacht (O / N) unter ständigem Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute. </li><li> 1 ml des O / N-Kultur auf 1 L des Terrific Broth sterile Medium in einem 4-l-Kolben. Fügen Sie den entsprechenden Antibiotikum und bei 37 ° C für 24 h unter ständigem Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute. HINWEIS: Die &quot;leaky&quot; Baseline-Ausdruck mit der T7-lac-Promotor gesehen ist ausreichend für eine hohe Expression von vielen ELPs wenn die Kultur wird für 24 Stunden inkubiert. Jedoch kann eine weitere herkömmliche Ansatz verwendet werden, wobei die Proteinexpression durch die Zugabe von 0,2-1 mM Isopropyl-beta-D-thiogalactosid (IPTG) induziert wird, wenn die optische Dichte der Kultur 0,6 erreicht. </li&gt; <li> Übertragung der Kultur von dem 4-l-Kolben mit einem 1-L-Zentrifugenflasche und Zentrifuge bei 4 ° C für 15 min bei 2.000 x g. </li><li> Überstand verwerfen. HINWEIS: Wenn mehr als 1 l Kultur angebaut wird sie durch das Hinzufügen eines weiteren Liter Kultur zum Pellet-und Wiederholen von Schritt 1.3 kondensiert werden. Bis zu 2 l Kultur kann in einem Zellpellet kondensiert werden. </li><li> Resuspendieren des Pellets in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), Wasser oder anderen gewünschten Puffer zu 45 ml der Zellsuspension und in ein konisches 50 ml-Rohr zu erreichen. </li></ol> 2 ELP Reinigung:. Vorbereitende Schritte und erste Runde der Inverse Transition Cycling <ol><li> Beschallen den Zellpellet resuspendiert für insgesamt 9 min in Zyklen von 10 s &#39;on&#39; und 20 sec &quot;Aus&quot; bei einer Ausgangsleistung von 85 W, während die Probe auf Eis. Kurz damit die Probe auf Eis abkühlen und wiederholen Sie den 9 min Zyklus noch einmal. HINWEIS: Wenn die ELP wird erwartet, dass eine sehr geringe T t haben </sub&gt; die &quot;Aus&quot;-Intervall kann bis zu 40 Sekunden erhöht werden, um die Erwärmung der Lösung auf oberhalb T t zu vermeiden. </li><li> Transfer des Lysats in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen mit rundem Boden. </li><li> 2 ml 10% (w / v) Polyethylenimin (PEI) für jeden Liter Kultur und schütteln zu mischen. HINWEIS: PEI ein positiv geladenes Polymer, das bei der Kondensation von negativ geladenen genetische Verunreinigungen hilft. Führen Sie diesen Schritt nicht, wenn der ELP negativ geladen ist, wie das PEI auch kondensieren und entfernen Sie die ELP Produkt. </li><li> Zentrifuge bei 4 ° C für 10 min bei 16.000 x g. </li><li> Den Überstand in ein sauberes 50 ml Rundbodenzentrifugenröhrchen und entsorgen Sie die Pellets. </li><li> Optional &quot;backen out&quot; Schritt: Inkubation der Probe bei 60 ° C für 10 min auf Proteinverunreinigungen zu denaturieren und dann übertragen auf 4 ° C oder auf Eis, bis das ESP vollständig aufgelöst. Zentrifuge die Probe bei 4 ° C für 10 min bei 16.000 x g. Den Überstand in einem clean 50 ml Rundbodenzentrifugenröhrchen und entsorgen Sie die Pellets. HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt nicht, wenn ein Peptid oder Protein an die ELP fusioniert und wird voraussichtlich in den Zustand der erhöhten Wärme denaturieren. Dies kann bewirken, dass der Übergang zum Wärme ELP-irreversibel werden oder können die Aktivität des fusionierten Einheit zu zerstören. </li><li> Induzieren die ELP Übergang mit der Zugabe von kristallinem NaCl (nicht mehr als 3 M). Alternativ können Natrium-Citrat (0,3 M nicht überschreitet) für ESPs, die eine höhere T t s oder niedrigen Renditen haben verwendet werden. HINWEIS: Die Lösung sollte bewölkt drehen einmal das Salz gelöst hat, das die Phasentrennung von ELP aus der Lösung. Sehr hydrophil ELPs mit hoher T t s kann einige Grad der Erwärmung in Kombination mit der Zugabe von Salz, um die Phasentrennung des ELP in dieser vorläufigen Induktion der ELP Übergang zu induzieren. </li><li> Zentrifugieren bei Raum temperatue (RT) für 10 min bei 16.000 xg (Hot Spin). HINWEIS: Eine ELP Pellet sollte be beobachtet, dessen Größe von der Expressionsausbeute des ESP. Diese ELP Pellet auf den ersten undurchsichtig erscheinen, aber nach dem Abkühlen wird es schein erscheinen und kann in der Farbe braun sein. Das ESP-Pellet wird farbloser geworden als Reinigungserlös und Verunreinigungen entfernt werden. </li><li> Überstand verwerfen und fügen Sie 1-5 ml gewünschten Puffer zum Pellet. Das Pellet durch Pipettieren und das Röhrchen bei 4 ° C drehen Hinweis: Das erforderliche Volumen an Puffer von der Größe der Pellets ab ELP und damit die Ausbeute an ELP Expression, in dem eine ausreichende Menge des Puffers sollte hinzugefügt werden, um die Wiederauflösung der ELP Pellet zu ermöglichen. ELP mit hohem Cysteingehalt profitieren Reinigung in Wasser mit 10 mM Tris (2-carboxyethyl) phosphin-Hydrochlorid (TCEP-HCl) bei pH 7 bis Disulfid-Interaktionen mit kontaminierenden Proteine ​​zu eliminieren. ELPs mit hoher Ladungsinhalt profitieren von Reinigung bei einem pH-Wert eingestellt werden, um ihre Ladung zu neutralisieren und zu reduzieren electrostatic Wechselwirkungen mit verunreinigenden Proteinen. </li><li> Übertragen Sie die resuspendierten ELP-Lösung in 1 ml Aliquots in sauberes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifuge bei 4 ° C für 10 min bei 16.000 × g (Kaltrotations). Eine kleine Pellet von unlöslichen Verunreinigungen sind zu beachten. </li><li> Den Überstand in ein sauberes Röhrchen und entsorgen Sie die Pellets. </li></ol> . 3 ELP Reinigung: Nachfolgende Runden von Inverse Transition Cycling <ol><li> Induzieren die ELP-Übergang mit Wärme und / oder der Zugabe von NaCl. Proben können auf einem Heizblock oder in einem Wasserbad für 15 min bei einer Temperatur oberhalb der T T inkubiert werden. Wenn jedoch die ELP an ein Protein fusioniert ist (was die Verwendung von Wärme) oder wenn die ELP eine hohe T t, die nicht mit Wärme allein erreicht werden kann, einer 5 M NaCl-Lösung zugegeben werden tropfenweise zu induzieren ELP Übergang. HINWEIS: Die Lösung sollte trüb, was auf die Phasentrennung des ELP aus der Lösung. </li><li&gt; Zentrifuge für 10 min bei 16.000 xg (Hot Spin). Wenn Wärme in Schritt 3.1 verwendet, führen diese Zentrifugationsschritt bei einer Temperatur oberhalb derjenigen, die benötigt wurde, um die ELP Übergang zu induzieren. Wenn allein NaCl wurde in Schritt 3.1 verwendet, führen Sie diesen Schritt Zentrifugation bei RT. HINWEIS: Eine ELP Pellet zu beachten. </li><li> Überstand verwerfen, fügen 500-750 ul gewünschten Puffer und das Pellet durch Pipettieren und das Röhrchen bei 4 ° C drehen </li><li> Zentrifuge bei 4 ° C für 10 min bei 16.000 × g (Kaltrotations). Eine kleine Pellet von unlöslichen Verunreinigungen sind zu beachten. </li><li> Den Überstand in ein sauberes Röhrchen und entsorgen Sie die Pellets. </li><li> Die Schritte 3.1 bis 3.5, bis keine Verunreinigung Pellet wird in Schritt 3.4 festgestellt. </li></ol> 4. Post-Reinigung Verarbeitung (optional) <ol><li> Wenn gewünscht, dialysiert die Probe gegen einen geeigneten Puffer, um überschüssiges Salz aus dem gereinigten ELP Lösung zu entfernen. HINWEIS: ELPs die lyophilisiert werden sollgegen ddH 2 OO / N bei 4 ° C dialysiert </li><li> Falls gewünscht, lyophilisieren die ELP für Langzeitlagerung durch Einfrieren der Lösung bei -80 ° C für 30 min vor der Lyophilisierung O / N. HINWEIS: Die Lyophilisierung sollte nicht für ELP mit anhängenden Proteine ​​verwendet werden. </li><li> Wenn gewünscht, wieder frei Peptid oder Protein aus einem Peptid oder Protein ELP-Fusion durch Entfernen der ELP tag: <ol><li> Verdauen das Peptid oder Fusionsprotein ELP mit biotinyliertem Protease (wie durch den Hersteller empfohlen Protease) oder mit einer Protease ELP Fusions entsprechend der Proteasestelle gentechnisch zwischen dem Peptid oder Protein und ELP gestalten. </li><li> Entfernen Sie gegebenenfalls die biotinylierten Protease unter Verwendung von Streptavidin-modifizierten Perlen (wie von der Protease-Anbieter empfohlen). </li><li> Induziert den Übergang des ELP abgespalten und / oder Protease-ELP-Fusions durch tropfenweise Zugabe von 5 M NaCl-Lösung. </li><li> Zentrifuge bei RT für 10 min bei 16.000 x g. HINWEIS: Eine ELP Pellet zu beachten. </li><li>Sammeln Sie den Überstand und entsorgen Sie die ELP Pellets. Dialysiere den Überstand gegen einen gewünschten Puffer oder eine Filterzentrifuge, einen Pufferaustausch durchzuführen, um die hohe Salzkonzentration von der reinen Peptid-oder Proteinlösung zu entfernen. </li><li> Bestätigen Sie die vollständige Spaltung der freien Peptid oder Protein aus der ELP-Tag durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE). </li></ol></li></ol> 5 Charakterisierung:. SDS-PAGE <ol><li> Vorbereitung ELP Proben für SDS-PAGE durch Mischen von 10 ul ELP in Wasser mit 10 ul Probenpuffer, der 2-Mercaptoethanol verdünnt. HINWEIS: 40 ug von ELP ist oft ausreichend, um die Größe und Reinheit des ELP Produkt zu testen. </li><li> Inkubieren der Probe bei 100 ° C für 2 min und geladen auf einem Polyacrylamid-Gel zusammen mit einem passenden Proteinleiter dann. </li><li> Die Elektrophorese bei 180 V, bis der Farbstoff das Ende des Gels (etwa 45 min) nähert. </li><li> Färben Sie dieGel mit 0,5 M CuCl 2-Lösung für 5 min, während die Schwing. HINWEIS: ELPs werden typischerweise nicht durch Coomassie-Brilliant-Blue-Färbung sichtbar gemacht, wie einige ELP-Sequenzen nicht mit diesem Farbstoff interagieren. Coomassie Brilliant Blue interagiert primär mit Argininresten und interagiert mit anderen schwach basischen Reste Histidin-und Lysin-Resten und aromatischen-Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin 26. Somit ELPs und Peptid oder Protein ELP-Fusionen mit Coomassie Brilliant Blue angefärbt werden, wenn ihre Primärsequenz eine ausreichende Anzahl dieser spezifischen Resten. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die MW der ELP-Band entspricht der theoretischen MW von der ELP-Gen und keine Fremdschadstoff Bänder vorhanden sind, erwartet. ANMERKUNG: Manche ELPs migrieren mit einem scheinbaren MW bis zu 20% höher als erwarteten MW 9, 27. </li></ol> 6. Charakterisierung:. Matrix-assisted Laser Desorption /Ionisation Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF-MS) <ol><li> Vorbereiten eines ELP-Lösung in 50% wässrigem Acetonitril, das 0,1% Trifluoressigsäure enthielt, um eine ELP-Konzentration von etwa 25 uM zu erreichen. HINWEIS: Diese Lösung sollte frei von Salz, so ELP müssen gegen H 2 O dialysiert werden nach der Reinigung. </li><li> Vorbereitung einer Matrixlösung, gesättigter Sinapinsäure in 50% wässrigem Acetonitril mit 0,1% Trifluoressigsäure. </li><li> 1 ul der Lösung ELP bis 9 &amp;mgr; l der Matrix-Lösung, um ein ELP-Konzentration von ungefähr 2,5 pmol / &amp;mgr; l zu erreichen. ANMERKUNG: Diese Mischung kann weiter mit Matrixlösung verdünnt werden, um die MALDI-TOF-Signal zu optimieren. </li><li> Kaution 1-2 ul ELP-Matrix-Gemisch auf eine Metallplatte MALDI und lassen Sie den Ort vollständig trocknen. </li><li> 5-10 erhalten Spektren mit MALDI-TOF, um die Masse zu bestimmen, um Verhältnis (m / z) des ESP zu laden und schließen die gemessene MW. </li></ol> 7. Characterization: Temperatur-programmierte Turbidimetrie und dynamische Lichtstreuung <ol><li> Bestimmen Sie die T t der ELP durch Temperatur-programmierte Trübungsmessung: <ol><li> Verdünnungsreihe (z. B. 5-100 &amp;mgr; M) von ELP-Lösungen im gewünschten Puffer. </li><li> Verwendung eines temperaturgesteuerten UV-Vis-Spektrophotometer, wird die optische Dichte (OD) bei 350 nm über einen Bereich von Temperaturen (z. B. 20-80 ° C) bei einer Aufheizrate von 1 ° C / min. HINWEIS: Wenn kein Anstieg der OD gesehen kann der T t die obere Temperaturgrenze des Geräts übersteigt. Die scheinbare T t kann durch die Zugabe von NaCl verringert werden. Starten Sie bei 1 M NaCl und erhöhen in Schritten von 0,5 M bis der ELP Übergang innerhalb einer messbaren Temperaturbereich festgestellt. </li><li> Verifizierung der Reversibilität der ELP Übergang durch Messung der Abnahme der OD über den gleichen Temperaturbereich mit einer Abkühlungsgeschwindigkeit von 1 ° C / min. </li><li> Bestimmen Sie die T t des homoPolymer ELP durch Identifizieren der Wendepunkt der Trübung Profil (OD aufgetragen gegen die Temperatur). ANMERKUNG: Diese Temperatur kann leicht von der Ableitung der OD-Kurve, wobei die Temperatur, die dem Maximum der Ableitung wird als t definiert werden. Komplexere ELP Architekturen komplizierter Trübung Profile angezeigt und sollte weiter untersucht werden, wie in Abschnitt 7.2 beschrieben. </li></ol></li><li> Weitere Charakterisierung von ESPs, die komplexer thermischen Eigenschaften (zB ELP Diblock-Copolymere, die Selbstorganisation in kugelförmige Mizellen) angezeigt wird durch dynamische Lichtstreuung (DLS) erreicht: <ol><li> Bereiten Sie einen ELP-Lösung in der gewünschten Puffer und die Probe durch einen Filter mit einer Porengröße von 20 bis 450 nm. HINWEIS: Die Auswahl der Filterporengröße wird auf der Anwesenheit, Größe und Stabilität von ELP Baugruppen in Lösung ab. Die kleinste führbar Filterporengröße ist bevorzugt, Verunreinigungen, wie zu eliminierenStaub, die die Qualität der DLS-Messungen verringern. Eine größere Filterporengröße verwendet, wenn bedeutende Widerstand erlebt, wenn Gabe eines ELP-Lösung durch kleinere Filterporengrößen werden. </li><li> Messung des hydrodynamischen Radius (R H) über einen Bereich von Temperaturen, die zu einer Region von Interesse in dem Profil identifiziert Trübung entspricht. HINWEIS: ELP Unimere haben typischerweise einen R H &lt;10 nm, Nanopartikel-Baugruppen haben ein R H ~ 20-100 nm und Aggregate eine R H&gt; 500 nm aufweisen. Jeder Anstieg der R H sollte zu einer Erhöhung der OD bei 350 nm durch UV-Vis-Spektrophotometrie als Funktion der Temperatur, die proportional zu der Größe der Teilchen, gemessen entsprechen. </li></ol></li></ol>

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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+purification+by+reversible+phase+transition+following+Escherichia+coli+expression+of+genes+encoding+up+to+251+repeats+of+the+elastomeric+pentapeptide+GVGVP.">Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP.</a> Protein expression and purification. 7, 51-57 (1996).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally-responsive+polypeptides.">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.</a> Nat Biotechnol. 17, 1112-1115 (1999).</li><li>McDaniel, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+thermally+responsive+nanoparticles+of+a+genetically+encoded+peptide+polymer+by+drug+conjugation.">Self-assembly of thermally responsive nanoparticles of a genetically encoded peptide polymer by drug conjugation.</a> Angewandte Chemie. 52, 1683-1687 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben keine finanziellen Interessen im Wettbewerb offen zu legen.

ELPs bieten eine kostengünstige und Chromatographie freie Mittel der Reinigung durch Ausbeutung ihrer stimuliresponsiven Phasenverhalten. Dieser Ansatz nutzt die LCST-Verhalten von ESPs und Peptid-oder Protein ELP-Fusionen, sowohl lösliche und unlösliche Verunreinigungen nach der Expression von genetisch kodierten ELPs in E. beseitigen coli. Diese Leichtigkeit der Reinigung verwendet werden, um ELP für eine Vielzahl von Anwendungen zu erzeugen, oder für die Reinigung von rekombinanten Peptide oder Proteine, in denen die ELP als Reinigungs-Tags, die mit Nachreinigung der Verarbeitung entfernt werden kann, handeln nutzt werden. ELP Reinigung beinhaltet vorbereitenden Schritte, um die Lyse von E. coli und entfernen genomischen und unlösliche Zelltrümmer aus dem rohen Lysat Kultur (Fig. 1), gefolgt von der Entfernung der restlichen löslichen und unlöslichen Verunreinigungen durch ITC (Abbildung 2). Zentrifugation nach dem Auslösen der ELP Übergang von der ADDIvon Wärme oder Salz trennt die ELP von löslichen Verunreinigungen im Überstand, in einem Schritt bezeichnet eine heiße Spin. Nach Resolubilisieren der ELP wird die Lösung wieder auf eine Temperatur unterhalb der T t zentrifugiert, um unlösliche Verunreinigungen zu entfernen Pellet wird in einem Schritt ein Kaltrotations bezeichnet. Abwechselnd heiß und kalt Spins verbessert die Reinheit des ELP-Lösung mit jedem Zyklus, gegen einen kleinen Aufpreis zu erhalten. Reinigungsausbeuten hängen von ELP-T t, die Länge und verschmolzen Peptide oder Proteine. Normalerweise ergibt dieses Protokoll 100 mg gereinigtes ELP pro Liter E. coli-Kultur, aber die Renditen können bis zu 500 mg / l zu erreichen bis Die endgültige Reinheit der ELP Produkt durch SDS-PAGE (Fig. 3) bestätigt. Der MW des gereinigten ELP sollte eng mit der theoretischen MW von der ELP-Gen kodiert entsprechen. Wandern jedoch einige ELPs in SDS-PAGE mit einem scheinbaren Molekulargewicht von bis zu 20% höher als erwarteten MW 9, 27. Genauere Analyse der ELPMW kann durch MALDI-TOF-MS, das auch zusätzliche Informationen über die Reinheit des ELP Produkt zusammen mit orthogonalen analytische Techniken, wie Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) zur Verfügung stellen kann erreicht werden. Nach der Reinigung wird die ELP T t durch Temperatur-programmierte Trübungsmessung gemessen. Diese Technik überwacht die OD eines ELP-Lösung, während die Temperatur erhöht wird. Die T t ist konzentrationsabhängig, so ist es ratsam, eine Konzentrationsreihe, die für die beabsichtigte Anwendung des ESP zu charakterisieren. Für ELP Homopolymere die Trübung Profil eine einzige starke Zunahme, die der ELP Übergang entspricht aus Unimeren bis Mikrometermaßstab Aggregate (Abbildung 4A). Die T t wird als die Temperatur entsprechend dem Wendepunkt der Trübung Profil genau dem Maximum der ersten Ableitung der OD hinsichtlich Temperatur bestimmt wird. Die Reversibilität derELP Phasenübergang wird durch eine Abnahme der OD bestätigt die Basislinie, wenn die Temperatur unterhalb der T t (4B) verringert. Die Trübung Profil mit zunehmender und abnehmender Temperaturrampen werden in Größe und Kinetik durch Absetzen des ELP Koazervate und variable Hysterese von ELP Resolubilisierung abweichen. Peptid oder Protein ELP-Fusionen ähnlich LCST-Verhalten aufweisen, auf diese Weise, wobei das Peptid oder Protein fusioniert an die ELP beeinflußt die T t. Für ELP Protein-Fusionen der Übergang ist reversibel unter der Schmelztemperatur des Proteins. Während temperaturprogrammierte Turbidimetrie ist ein ausgezeichnetes Verfahren für die anfängliche thermische Charakterisierung von ELP-Produkte, alternative Techniken, wie z. B. Differential Scanning Calorimetry (DSC), kann auch verwendet werden, um die ELP-T t zu messen. ELPs mit komplexeren Architekturen Ausstellung komplizierter thermische Verhalten, das auch durch Temperatur-progra charakterisiert werden könnenMMEd Trübungsmessung. ELP-Diblock-Copolymere, beispielsweise, eine charakteristische Trübung Profil entsprechend ihrer Temperatur-gesteuerte Selbstorganisation in sphärische Mizellen in ihrer kritischen Temperatur Mizellenbildung. Für solche ELP Diblockcopolymere der OD 0,1-0,5 Einheiten über der Grundlinie, die den Übergang von Unimere Micellen, wonach eine starke Zunahme der OD (bis 2,0 Einheiten über dem Ausgangswert) bei einer höheren Temperatur zeigt die Bildung von Mikrometer-Maßstab erhöht typischerweise zuerst Aggregate (5A). Weitere Informationen über Temperatur ausgelöste selbstorganisierten Strukturen ELP mit DLS, eine Technik, die die R-H von ELP Baugruppen misst in Lösung erhalten. Änderungen in der R H zustimmen eng mit Veränderungen in OD mit Trübungsmessung (5B) gemessen. ELP Unimere typischerweise eine H R &lt;10 nm, während Nanopartikel Baugruppen weisen eine R H ~ 20-100 nm und Aggregate weisen eine R H </sub &gt;&gt; 500 nm aufweisen. Weitere Informationen über selbstorganisierte ELP Nanopartikel wie Aggregationszahl und Morphologie, können durch statische Lichtstreuung oder kryogene Transmissionselektronenmikroskopie 17, 23, 29 erhalten werden. Durch die Einstellbarkeit der ELP thermischen Eigenschaften wird ein Bereich von T t s von verschiedenen Designs ELP erhalten. Es ist wichtig, im Auge zu behalten, dass die inhärente T t wird die Optimierung des Reinigungsprotokoll für jeden ELP, wo extrem niedrigen oder hohen T t s die meisten Änderungen an diesem Standardprotokoll erfordern beeinflussen. ELPs mit extrem hohen Übergangstemperaturen können für die Reinigung mit diesem Ansatz ungeeignet sein. Wenn das Design neuartiger ELPs und Peptid oder Protein ELP-Fusionen kann die thermische Antwort des ELP gefährden, kann eine einfache Histidin-Tag für alternative Reinigung durch immobilisierte Metall-Affinitätschromatographie enthalten. ZusätzlichEigenschaften des ELP-Sequenz kann verlangen, Modifikation dieses Protokoll, wenn der Gast Rückstand wird geladen. Manipulation des Puffers pH-Wert kann als eine Methode, um die Gesamtladung des ELP in dem Bemühen, elektrostatische Wechselwirkungen mit Verunreinigungen zu beseitigen ändern 17 verwendet werden. Darüber hinaus ist dieses Protokoll für die speziellen Umstände des ELP-Fusionen mit Peptiden und Proteinen, wenn geeignete Maßnahmen getroffen werden, um sicherzustellen, dass der Reinigungsprozess nicht die Aktivität des fusionierten Einheit stören geeignet. Hinweise in der gesamten Protokoll über solche Änderungen dienen dazu, die Reinigung von ELP, die diese Herausforderungen in Bezug auf T t, Ladung, oder Fusions Anliegen präsentieren kann lenken. Die Reinigung von ELP durch ihre LCST-Verhalten stellt eine einfache und Chromatographie freien Ansatz, um die Mehrheit der ELP und Peptid-oder Protein ELP-Fusionen in E. ausgedrückt reinigen coli. Die hier zusammengefassten Protokoll ermöglicht die Reinigung of ELPs an einem einzigen Tag mit Hilfe von Geräten, die in den meisten biologischen Laboratorien ist. Die Leichtigkeit der Reinigung von ELP und ihre Fusionen wird, hoffen wir, ermutigen eine ständig wachsende Vielfalt der ELP Entwürfe für neue Anwendungen in den Materialwissenschaften, Biotechnologie und Medizin.

Elastin-ähnlichen Polypeptide (ELP) stellen Biopolymere der Wiederholungspenta VPGXG wobei X die Gast Rückstand, eine beliebige Aminosäure außer Prolin. ELPs weisen untere kritische Lösungstemperatur (LCST) Phasenübergangsverhalten, so daß eine homogene Lösung ELP wird in zwei Phasen beim Erhitzen auf ihre LCST, die üblicherweise die inverse Umwandlungstemperatur (T t) in der ELP Literatur 1 bezeichnet wird trennen. Die beiden Phasen werden von einer sehr verdünnten ELP Kügelchen Phase und einer ELP reichen Sedimentphase zusammen. Das ESP reichen Sediment wird auf einer kurzen Zeitskala auf die Aggregation der ELP-Ketten in Mikrometer große Partikel, die anschließend zusammenwachsen ist. Dieses Verhalten tritt über einen Bereich von einigen Grad Celsius und ist in der Regel reversibel, wie eine homogene Lösung nach der Rückkehr auf eine Temperatur unterhalb T t gewonnen. ELPs werden typischerweise in Escherichia coli (E. coli) synthetisiert from ein künstliches Gen, das in ein Expressionsplasmid ligiert wird. Dieses Plasmid wird dann in einen transformierten E. coli-Zelllinie, die optimal für die Proteinexpression. Wir haben ausschließlich die T7-lac pET-Vektorsystem zur Expression einer Vielzahl von ELP in E. coli, obwohl andere Expressionssysteme in Hefe 2-4, 5 Pilze und Pflanzen 6-8 wurden auch von anderen Forschern genutzt. Eine Reihe von Ansätzen existieren, um genetisch konstruieren wiederholende ELP Gene, einschließlich rekursive gerichtete Ligation (RDL) 9, rekursive gerichtete Ligation von Plasmid-Rekonstruktion (Pre-RDL) 10 und überlappen Erweiterung Rolling-Circle-Amplifikation (OERCA) 11. Die Fähigkeit, ELPs auf der genetischen Ebene zu konstruieren bietet die Möglichkeit, rekombinante DNA-Techniken zu verwenden, um ELP mit einer Vielzahl von Architekturen (z. B. Monoblöcke, Diblock, Triblock, etc.), die mit weiteren funktionellen hängt werden kann erstellenPeptiden und Proteinen. Kontrolle auf der genetischen Ebene auch sichergestellt, dass jeder ELP ist mit der genauen Länge und Zusammensetzung von seiner genetischen Plasmid-Vorlage vorgegeben ausgedrückt und bietet perfekt monodisperse Biopolymer Produkte. Die thermischen Eigenschaften der einzelnen ELP hängen von intrinsischen Parametern an das Biopolymer wie sein Molekulargewicht (MW) und Reihenfolge, als auch extrinsische Faktoren, einschließlich der Konzentration in der Lösung und der Gegenwart von anderen Kosoluten, wie Salze. Die Länge der ELP 12 und seinen Gästen Restzusammensetzung 1, 13, 14 sind zwei orthogonalen Parameter in ELP-Design, die verwendet werden können, um die T t, wobei hydrophobe Gast Rückstände und mehr Kettenlängen führen zu geringeren T t s zu steuern, während hydrophile Gast Rückstände und kürzere Kettenlängen führen zu höheren T t s. ELP-Konzentration umgekehrt proportional zu der T t, wobei Lösungen von gr bezogenenEsser ELP Konzentration niedrigere T t s 12. Die Art und Konzentration der Salze beeinflussen die ELP-T t, bei denen die Wirkung von Salzen folgt der Hofmeister-Reihe 15. Kosmotropen Anionen (Cl - und höher auf der Hofmeister-Serie) senken die ELP T t und steigender Salzkonzentration verstärkt diesen Effekt. Diese inneren und äußeren Parameter können eingestellt werden, um das thermische Verhalten in einem Zieltemperaturbereich, der für eine bestimmte Anwendung eines ELP erforderlich zu erhalten. Der Stimulus-responsive Verhalten ELPs ist nützlich für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich der Biosensorik 16, 17, 18 Tissue Engineering und Drug-Delivery-19, 20. Außerdem, wenn ELPs werden Peptide oder Proteine ​​auf der genetischen Ebene verschmolzen, das ESP kann als einfache Reinigungs-Tag dazu dienen, eine kostengünstige Batch-Verfahren zur Reinigung von rekombinantem pep bietenGezeiten oder Proteine, die keine 21-Chromatographie erfordert. Modifikation der Reinigungsprozess wird sichergestellt, dass die Aktivität des Peptids oder Proteins an die ELP fusioniert gehalten. Peptid oder Protein ELP-Fusionen können für Anwendungen, in denen die ELP-Tag ist nützlich 22, 23 oder alternativ, wenn das freie Peptid oder Protein erforderlich ist, kann eine Protease-Erkennungsstelle zwischen dem Peptid oder Protein und ELP eingefügt werden, gereinigt werden. Die Entfernung des ELP-Tag kann dann durch Verdauung mit kosten Protease oder einer Protease ELP-Fusion, wobei letztere bietet die zusätzliche Leichtigkeit der Verarbeitung als letzte Runde der ELP Reinigung kann das ESP-Tag-und Protease-ELP-Fusion aus dem Zielpeptid oder trennen erreicht werden Protein in einem Schritt 24, 25. Das folgende Protokoll beschreibt die Reinigung Verfahren zur ELPs und Peptid oder Protein ELP-Fusionen durch ihre thermischen Eigenschaften und erörtert grundlegende Techniken zur Charakterisierungdie thermische Reaktion der ELP-Produkte.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1503">
	<tbody>
		<tr>
			<td>pET-24a(+) 
			pET-25b(+)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69749-3 
			69753-3</td>
			<td>T7-lac expression vectors with resistance to kanamycin (pET-24) or ampicillin (pET-25).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra BL21 (DE3) competent cells</td>
			<td>Edge BioSystems</td>
			<td>45363</td>
			<td>Competent E. coli for recombinant protein expression.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth (TB) Dry Powder Growth Media</td>
			<td>MO BIO Laboratories</td>
			<td>12105</td>
			<td>Media is reconstituted in DI H2O and autoclaved before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I2481C</td>
			<td>IPTG is reconstituted in DI H2O, sterile filtered, and added to cultures to induce enhanced expression.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) tablet</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>524650</td>
			<td>These PBS tablets, when dissolved in 1 L of DI H2O, yield a 10 mM phosphate buffer with 140 mM NaCl, and 3 mM KCl with a pH of 7.4 at 25 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine (PEI) Solution (~50% w/v)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>195444</td>
			<td>PEI is prepared as a 10% (w/v) solution in deionized H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Oak Ridge high-speed centrifuge tubes, 50 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3138-0050</td>
			<td>These round-bottom tubes withstand high-speed centrifugation of 30-50 ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP-HCl)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20491</td>
			<td>A stock solution of TCEP-HCl is prepared at 100 mM in DI H2O and adjusted to pH 7.0. For ELPs with a high cysteine content the stock solution of this reducing agent is added to the ELP pellet to reach 10 mM in H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ready Gel Tris-HCL gel, 4-20% linear gradient polyacrylamide gel, 10 well, 30 &#956;l</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>161-1105</td>
			<td>These linear gradient gels offer good visualization of ELPs with a range of MWs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cupric chloride dihydrate (CuCl2-2H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C454-500</td>
			<td>A filtered 0.5 M solution is prepared for negative staining of Tris-HCL polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anotop 10 syringe filter: 
			0.02 &#956;m 
			0.1 &#956;m 
			0.2 &#956;m</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>6809-1002 
			6809-1012 
			6809-1022</td>
			<td>These 10 mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes for DLS measurements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV filter: 
			0.45 &#956;m</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLHVX13NK</td>
			<td>These 13 mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes of solutions with large nanoparticle assemblies for DLS measurements.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-chromatographic purification of recombinant elastin-like polypeptides and their fusions with peptides and proteins from escherichia coli

Elastin-ähnliche Polypeptide sind sich wiederholende Biopolymere, die eine untere kritische Lösungstemperatur Phasenübergangsverhalten zeigen, bestehende als lösliche Unimere unterhalb einer charakteristischen Übergangstemperatur und Aggregation in Mikrometer-Skala Koazervate über ihren Übergangstemperatur. Das Design des Elastin-ähnliche Polypeptide auf der genetischen Ebene erlaubt eine genaue Steuerung ihrer Sequenz und Länge, die den thermischen Eigenschaften bestimmt. Elastin-ähnliche Polypeptide in einer Vielzahl von Anwendungen einschließlich der Biosensorik, Tissue Engineering und Drug-Delivery, wobei die Übergangstemperatur und Biopolymer Architektur des ELP kann für die spezielle Anwendung von Interesse abgestimmt werden verwendet. Ferner die untere kritische Lösungstemperatur Phasenübergangsverhalten von Elastin-ähnlichen Polypeptide können ihre Reinigung durch ihre thermische Reaktion, so daß ihre selektive Koazervation und Wiederauflösung ermöglicht die Entfernung der löslichen und unlöslichen Verunreinigungens nach Expression in Escherichia coli. Dieser Ansatz kann für die Reinigung von Elastin-ähnliche Polypeptide allein oder als Reinigungswerkzeug für Peptid-oder Proteinfusionen in dem rekombinanten Peptide oder Proteine ​​genetisch mit Elastin-ähnlichen Polypeptid-Tags angehängt werden können, ohne gereinigt werden verwendet werden. Dieses Protokoll beschreibt die Reinigung von Elastin-ähnliche Polypeptide und deren Peptid-oder Protein-Fusionen und diskutiert grundlegenden Charakterisierung Techniken des thermischen Verhaltens des reinen Elastin-ähnlichen Polypeptid-Produkte abzuschätzen.

Hier beschreiben wir repräsentative Ergebnisse für die Reinigung und Charakterisierung eines ELP-Homopolymer und einem ELP-Diblockcopolymer. Nach 24 h Expression in E. coli-Zellen werden durch Zentrifugation gesammelt und durch Beschallung lysiert. Typischerweise wird eine kleine Änderung in der Farbe erfolgt nach der Beschallung bestätigt ausreichende Zell-Lyse (Fig. 1A). Nach der Zugabe von PEI sind genomische Komponenten und Zelltrümmer durch Zentrifugation gesammelt, Abtrennen eines großen Pellets von unlöslichen Verunreinigungen aus der löslichen ELP im Überstand (Fig. 1B). ELP wird durch inverse Übergang Radfahren (ITC), die die LCST-Verhalten ausgenutzt, um die ELP aus löslichen und unlöslichen Verunreinigungen (Fig. 2) 28 getrennt, gereinigt. Der Phasenübergang des ELP wird durch die Zugabe von Wärme und / oder Salz ausgelöst. Zentrifugation führt zur Bildung eines Pellets am Boden der Röhre, die eine aus der ELPnd einige unlösliche Verunreinigungen (Abbildung 1C). Diese Schritt-bezeichnet eine heiße Spin-Rückwürfe lösliche Verunreinigungen im Überstand, während die ELP-Pellet wird beibehalten und in kaltem Puffer. Die resolubilisierten ELP wieder bei 4 ° C zentrifugiert, Diese Schritt-bezeichnet eine kalte Spin-Würfen das Pellet der unlöslichen Verunreinigungen während der Überstand mit löslichen ELP wird beibehalten. Die Wiederholung des Zyklus abwechselnd heiß und kalt Spins erhöht die Reinheit des ELP, aber auf Kosten der leicht rückläufigen Ertrag, als Rest ELP während jeder Runde ITC in Zentrifugenröhrchen und Pipettenspitzen verloren. Erfolgreiche Reinigung von ELP-und Peptid-oder Protein-Fusionen ELP wird durch SDS-PAGE bestätigt. Kleinen Portionen während des Reinigungsprozesses genommen zeigen die progressive Reinigung von ELP aus dem E. coli-Lysat. ELP im rohen E. überexprimiert coli-Lysat und Schadstoffe verringern Witzh aufeinanderfolgenden Runden der ITC (Abbildung 3). Gereinigtes ELP erscheint als eine einzige Bande in der Nähe der vorhergesagten theoretischen MW. Das ESP T t wird durch temperaturprogrammierte Trübungsmessung aus. Die Trübung Profil eines ELP-Homopolymer weist einen einzigen starken Anstieg der OD bei 350 nm (etwa 2,0 Einheiten über dem Ausgangswert für einen ELP-Konzentration von 25 uM) (Abbildung 4A). Kühltrübungs Scans bestätigen die reversible Natur der ELP Übergang als die OD wieder auf den Ausgangswert zurück, wenn die Temperatur unterhalb der T t (4B) verringert. ELP-Diblock-Copolymere zeigen ein komplexeres Profil Trübung im Vergleich zu ELPs Homopolymer ist. Die OD erhöht typischerweise ersten 0,1-0,5 Einheiten über der Grundlinie, nach der die OD erhöht sich deutlich auf 2,0 Einheiten über der Basislinie (Fig. 5A). DLS-Messungen liefern Informationen über die Änderung in R H in Bezug auf Temperatur, Co<html> rroborating die gewonnenen Informationen aus der Trübung Profil (5B). <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig1highres.jpg" width="600" /> Abbildung 1. Preliminary ELP Reinigung. Nach 24 Stunden des Ausdrucks, E. coli-Zellen werden durch Zentrifugation gesammelt und in PBS resuspendiert. sind a) Zellen durch Ultraschallbehandlung, die durch eine kleine Änderung in der Farbe, so dass das Lysat dunkelt nach der Beschallung. B) nach Zugabe von PEI-DNA-Verunreinigungen zu kondensieren, ist das Lysat begleitet wird lysiert zentrifugiert und ein großes Pellet der unlöslichen Trümmer aus löslichen ELP im Überstand. C) getrennt Die ELP Übergang wird mit der Zugabe von Wärme und / oder Salz und Zentrifugation bildet eine durchschein ELP Pellet induziert.ank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig2highres.jpg" width="600" /> 2. Inverse Gangs Radfahren. ELP mittels dessen LCST-Verhalten von löslichen und unlöslichen Verunreinigungen gereinigt. (2) beginnend mit dem ELP-reiche Lysat (1) die ELP-Übergang mit der Zugabe von Wärme und / oder Salz und dem ELP induziert wird durch Zentrifugation (hot Spin) getrennt. Die ELP Pellet zurückgehalten (3a) während der Überstand, der lösliche Verunreinigungen verworfen wird (3b). Das ESP in kaltem Puffer (4) resuspendiert und erneut bei 4 ° C (Kaltrotations) zentrifugiert (5). Das Pellet, das unlösliche Verunreinigungen verworfen (6a), während der Überstand, der lösliche ELP beibehalten wird (6b). Zyklen von abwechselnd heiß und kalt Spins werden wiederholt, bis die gewünschte Reinheit erreicht ist, wie bei festSDS-PAGE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig3highres.jpg" width="600" /> 3. SDS-PAGE-Analyse von ELP Reinigungsprodukte. Erfolgreiche Reinigung eines ELP wird durch SDS-PAGE bestätigt. Überexprimiert ELP ist in der rohen E. offensichtlich coli-Lysat nach der Beschallung (2). Nach der Zugabe von PEI und Zentrifugation der löslichen ELP weitgehend im Überstand (3) zurückgehalten, obwohl einige ELP in der Pellet verworfen unlöslicher Verunreinigungen hat (4). Überstand nach dem ersten Heiß Spin enthält bedeutende Mengen von löslichen Verunreinigungen (5). Überstand nach dem ersten Kaltrotations zeigt eine gute Trennung von ELP von unlöslichen Verunreinigungen (6). Zusätzliche Zyklen heißem (7) und calt Spins (8) entfernen restliche lösliche und unlösliche Verunreinigungen jeweils bis zur endgültigen Heiß (9) und Kaltrotations (10) Überstände weisen keine fremden kontaminierenden Banden bestätigt zufriedenstellende Reinheit des ELP Produkt. Diese ELP-Homopolymer, mit einer Folge von SKGPG-(VGVPG) 80-Y, hat eine erwartete Molekulargewicht von 33,37 kDa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig4highres.jpg" width="600" /> 4. Charakterisierung von ELP-Homopolymer durch temperaturprogrammierte Turbidimetrie. Die ELP-T t wird durch Überwachen der OD bei 350 nm, während die Temperatur mit einer Geschwindigkeit von 1 ° C / min. A) ELP Homopolymere weisen einen einzigen scharfen Anstieg fest OD, dass defines ihre T t bei einer gegebenen Konzentration. B) Die Reversibilität der ELP Übergang wird durch Überwachen der OD bei 350 nm von weniger als 25 μ M Lösung, während die Verringerung der Temperatur, bei der Reversibilität wird durch die Rückkehr der OD auf die Grundlinie bestätigt verifiziert. Diese ELP-Homopolymer hat die Sequenz SKGPG-(VGVPG) 80-Y. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig5highres.jpg" width="600" /> Abbildung 5. Charakterisierung von ELP Diblockcopolymer durch Temperatur-programmierte Trübungsmessung und dynamische Lichtstreuung. ELPs, die Nano-Selbstorganisation zu unterziehen, wie ELP Zweiblockcopolymere, die Selbstorganisation in kugelförmige Mizellen, Ausstellungs komplexer Trübung Profilen. <stronG&gt; A) moderate Erhöhung OD zeigt den Übergang von Unimere Micellen vor einem raschen Anstieg der OD, die vollständige Aggregation des ELP in Mikrometermaßstab Aggregate. B) DLS-Messungen bestätigen das Verhalten der Trübung Profil für ein gefolgert zeigt Lösung bei 25 &amp;mgr; M durch Information über die Änderung in R H in Bezug auf die Temperatur. Hier wird der ELP Unimeren hat eine R H ~ 8 nm und die Mizellen eine R H ~ 25 nm auf. Diese ELP Diblockcopolymer die Sequenz GCGWPG-(VGVPG) 60 - (AGVPGGGVPG) 30-PGGS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig5highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-ähnliche Polypeptide sind stimuliresponsiven Biopolymeren mit Anwendungen von rekombinanten Proteinreinigung zu Drug Delivery. Dieses Protokoll beschreibt die Reinigung und Charakterisierung von Elastin-ähnliche Polypeptide und deren Peptid-oder Protein-Fusionen aus Escherichia coli unter Verwendung der unteren kritischen Lösungstemperatur Phasenübergangsverhalten, wie eine einfache Alternative zur Chromatographie.

Nicht-chromatographischen Reinigung von rekombinantem Elastin-ähnliche Polypeptide und deren Fusionen mit Peptiden und Proteinen aus<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

non-chromatographic-purification-recombinant-elastin-like

Research

JoVE Journal

Biology

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

21.5K Aufrufe.  Duke University.  Elastin-ähnliche Polypeptide sind stimuliresponsiven Biopolymeren mit Anwendungen von rekombinanten Proteinreinigung zu Drug Delivery. Dieses Protokoll beschreibt die Reinigung und Charakterisierung von Elastin-ähnliche Polypeptide und deren Peptid-oder Protein-Fusionen aus Escherichia coli unter Verwendung der unteren kritischen Lösungstemperatur Phasenübergangsverhalten, wie eine einfache Alternative zur Chromatographie. 

Serie: Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Forschung

Biologie

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

High Throughput Screening von Fungal Endoglucanaseaktivität in Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identifizierung von Protein-Komplexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

High-throughput Reinigung von Affinity-markierter rekombinanter Proteine

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has become the method of choice for introducing DNA into prokaryotes that are not naturally competent. Electroporation is a rapid, efficient, and streamlined transformation method that, in addition to purified DNA and competent bacteria, requires commercially available gene pulse controller and cuvettes. In contrast to the pulsing step, preparation of electrocompetent cells is time consuming and labor intensive involving repeated rounds of centrifugation and washes in decreasing volumes of sterile, cold water, or non-ionic buffers of large volumes of cultures grown to mid-logarithmic phase of growth. Time and effort can be saved by purchasing electrocompetent cells from commercial sources, but the selection is limited to commonly employed E. coli laboratory strains. We are hereby disseminating a rapid and efficient method for preparing electrocompetent E. coli, which has been in use by bacteriology laboratories for some time, can be adapted to V. cholerae and other prokaryotes. While we cannot ascertain whom to credit for developing the original technique, we are hereby making it available to the scientific community.

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation is a commonly employed method for introducing DNA into bacteria in a process known as transformation. Traditional protocols for the preparation of electrocompetent cells are time consuming and labor intensive. This article describes an alternate, rapid, and efficient method for the preparation of electrocompetent cells presently employed by some laboratories.

Rapid-Protokoll für die Herstellung von Elektrokompetente<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Und<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

Hochdurchsatz-Screening Quantitative Expression und Aufreinigung rekombinanter zu Disulfid-reichen Proteine ​​Venom Produziert in Applied<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

Die vielfältigen Vorteile von Protein Co-expression in<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein belonging to the prion family. A chromatographic method for the purification of (His)6-tagged recombinant Shadoo expressed as inclusion bodies is described. The inclusion bodies are solubilized in 8 M urea and bound to a Ni2+-charged column to perform ion affinity chromatography. Bound proteins are eluted by a gradient of imidazole. Fractions containing Shadoo protein are subjected to size exclusion chromatography to obtain a highly purified protein. In the final step purified Shadoo is desalted to remove salts, urea and imidazole. Recombinant Shadoo protein is an important reagent for biophysical and biochemical studies of protein conformation disorders occurring in prion diseases. Many reports demonstrated that prion neurodegenerative diseases originate from the deposition of stable, ordered amyloid fibrils. Sample protocols describing how to fibrillate Shadoo into amyloid fibrils at acidic and neutral/basic pHs are presented. The methods on how to produce and fibrillate Shadoo can facilitate research in laboratories working on prion diseases, since it allows for production of large amounts of protein in a rapid and low cost manner.

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of His6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

A two-step chromatographic method is described for the purification of recombinant Shadoo protein expressed as inclusion bodies in Escherichia coli, as well as a protocol to fibrillate purified Shadoo into amyloid structures.

Reinigung und Rückfaltung an Amyloidfibrillen von (His)<sub&gt; 6</sub&gt; -markierte Recombinant Protein Shadoo als Einschlusskörper in Ausgedrückt<em&gt; E. coli</em

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules derived from the parental cells. EVs function as intra- and inter-species communication vectors while also contributing to the interaction between bacteria and host organisms in the context of infection and colonization. Given the multitude of functions attributed to EVs in health and disease, there is a growing interest in isolating EVs for in vitro and in vivo studies. It was hypothesized that the separation of EVs based on physical properties, namely size, would facilitate the isolation of vesicles from diverse bacterial cultures. 
The isolation workflow consists of centrifugation, filtration, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography (SEC) for the isolation of EVs from bacterial cultures. A pump-driven tangential flow filtration (TFF) step was incorporated to enhance scalability, enabling the isolation of material from liters of starting cell culture. Escherichia coli was used as a model system expressing EV-associated nanoluciferase and non-EV-associated mCherry as reporter proteins. The nanoluciferase was targeted to the EVs by fusing its N-terminus with cytolysin A. Early chromatography fractions containing 20-100 nm EVs with associated cytolysin A - nanoLuc were distinct from the later fractions containing the free proteins. The presence of EV-associated nanoluciferase was confirmed by immunogold labeling and transmission electron microscopy. This EV isolation workflow is applicable to other human gut-associated gram-negative and gram-positive bacterial species. In conclusion, combining centrifugation, filtration, ultrafiltration/TFF, and SEC enables scalable isolation of EVs from diverse bacterial species. Employing a standardized isolation workflow will facilitate comparative studies of microbial EVs across species.

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Bacteria secrete nanometer-sized extracellular vesicles (EVs) carrying bioactive biological molecules. EV research focuses on understanding their biogenesis, role in microbe-microbe and host-microbe interactions and disease, as well as their potential therapeutic applications. A workflow for scalable isolation of EVs from various bacteria is presented to facilitate standardization of EV research.

Skalierbare Isolierung und Reinigung extrazellulärer Vesikel aus Escherichia coli und anderen Bakterien

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...