Diese Arbeit wurde von der Bill-und-Melinda-Gates-Stiftung (Projekt 53085), der JR Oishei Foundation und der American Lung Association (Förder RG-123721-N) zu APH und NIH (NIDCD) F31DC011218 Gemeinschaft EAC unterstützt.

1. Vorbereiten bakterielle Kulturen <ol><li> Wachsende Kultur für den Einsatz in Experimenten <ol><li> In einem 37 ° C Wärmeblock, eine gefrorene auftauen Lager-Fläschchen von S. pneumoniae und fügen den Inhalt in 9 ml frisches, vorgewärmtes Todd-Hewitt-Medium mit 0,5% Hefeextrakt (THY) für ein Gesamtvolumen von 10 ml in einem Glaskulturröhrchen. </li><li> Inkubieren statisch bei 37 ° C, bis die Kultur die mittlere Log-Phase (Abs 600 nm ≈ 0,5-0,6) erreicht. </li></ol></li></ol> 2. Erkennen Depolarisation der Membran und Rupture <ol><li> Vorbereiten Reagenzien <ol><li> Bereiten Sie eine 50 uM Lager von DiBAC 4 (3) in 100% DMSO und eine 2 mg / ml Stamm von PI in ddH 2 O. Die DiBAC 4 (3) stock ist bei -20 ° C stabil für mindestens 6 Monate. Der PI-Lager ist bei 4 ° C stabil für mindestens 6 Monate. </li><li> Wickeln Sie Aktien in Folie aus dem Licht zu schützen. </li></ol></li><li> VerladungBakterien <ol><li> Pellet die Bakterienzellen aus Schritt 1.2.2 durch Zentrifugation bei 2.400 × g für 10 min bei Raumtemperatur und zweimal waschen durch Entfernen des Überstands, Resuspendieren des Pellets in 10 ml 1 × phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), und erneut zentrifugieren bei 2.400 xg für 10 min. </li><li> Überstand abnehmen und das Pellet erneut in PBS auf das ursprüngliche Volumen. Dies wird für etwa 10 8 koloniebildenden Einheiten von Bakterien pro ml ist. Entfernen 1 ml (ausreichend für 5 Proben) der Zellen gewaschen und in einen Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Diese Zellen werden 25 ul einer 1 M steril filtrierten Stammlösung von Glucose (in ddH 2 O hergestellt und durch einen 0,45 um Filter filtriert) für eine Endkonzentration von 25 mM Glucose inkubiert und in einem 37 ° C-Heizblock fünfzehn min. HINWEIS: Dieser liefert Energie für alle ATP-abhängigen Membrankanäle und zellulären Komponenten. Die Notwendigkeit für diesen Schritt kann je nach Experiment. </li><li> In 5 ul der 50 uM DiBAC 4 (3) Lager und 10 ul der 2 mg / ml PI Lager. Dies sorgt für eine Endkonzentration von 250 nM und 20 &amp;mgr; g / ml. Gründlich durch und Abpipettieren mehrmals. In 200 ul dieser Zellsuspension zu jeder Probe und einer klaren 96-Well-Platte. </li></ol></li><li> Detektieren der Fluoreszenz <ol><li> Legen Sie die Platte in einem vorgewärmten (37 ° C) Fluoreszenzdetektion Plattenlesegerät. </li><li> Stellen Sie sicher, dass geeignete Filter sind im Ort für DiBAC 4 (3) (490 nm Anregung, 516 nm Emission) und PI (535 nm Anregung, 617 nm Emission)-Erkennung. </li><li> Um (und gleichzeitig zu überwachen) Ausgleich der DiBAC 4 (3) über die Membran, setzen Sie den Leser auf Fluoreszenzmessungen für ca. 30-40 min dauern jeden min oder bis Messwert stabilisiert erlauben, dies dient als &quot;Vorbehandlung&quot; Lesen. </li><li> Werfen Platte und fügen Sie die experimentellen Mittel der Wahl und immediately legen die Platte wieder in den Leser weiter überwachen DiBAC 4 (3) und PI-Fluoreszenz für die gewünschte Länge der Zeit. Wenn die Behandlung mehrere Proben auf einmal, mit einer Mehrkanalpipette kann hilfreich sein, um den Agenten gleichzeitig in alle Vertiefungen hinzuzufügen. </li><li> Exportieren Sie die Messwerte mit einer Datenanalyseprogramm wie Microsoft Excel. Plot Fluoreszenz über die Zeit zu Depolarisation der Membran und Bruch zu evaluieren. Steigende Fluoreszenz DiBAC und PI zeigt, dass Depolarisation und Bruch auftreten. </li></ol></li></ol> 3. Erfassen von Änderungen in der intrazellulären Ca 2 +-oder K +-Konzentrationen <ol><li> Vorbereiten Reagenzien und Ladepuffer <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Reagenzien: 5 mM Stamm der ionensensitiven Fluoreszenzfarbstoff (Fura-2/AM oder PBFI / AM, fügen Sie die entsprechende Menge an DMSO in ein Röhrchen mit 50 ug der Farbstoff), &quot;100x&quot; Probenecid (1 hinzufügen ml PBS auf eine 77 mg Ampulle). Das gelösteFarbstoffe können bei -20 ° C eingefroren und einmal in Lösung für 3 Monate stabil, wohingegen die Probenecid in Lösung stabil bei -20 ° C für 6 Monate. </li><li> Herstellung von 1 ml 2 × Ladepuffer wie folgt: In den Boden eines 15 ml konischen Kunststoffrohr verzichten 20 ul 100x Konzentrat Antriebsladung (bei 2-8 ° C für 6 Monate), gefolgt von 2 ul 5 mM Ionen empfindlichen Farbstoff direkt in die Antriebsladung. Vortex kurz mischen. In 960 ul PBS, gefolgt von 20 ul 100x Probenecid. Mischen Sie die Mischung ein letztes Mal. In Folie wickeln, um vor Licht zu schützen. </li></ol></li><li> Laden der Bakterien, die mit Farbstoff <ol><li> Pellet und waschen Sie den mittleren logarithmischen Phase Bakterienkultur wie in 2.2.1 beschrieben. Überstand entfernen und Pellet erneut in 5 ml PBS, eine &quot;2x&quot; Zellsuspension zu machen. </li><li> 1 ml der Zellsuspension 2x auf das 2x Ladepuffer. Dies wird für ein Endvolumen von 2 ml, und letzte Konzentr bereitzustellenErwartungen über 1x Antriebsladung, 5 uM Fluoreszenzfarbstoff und 1x Probenecid. HINWEIS: Diese Suspension bietet genügend Volumen für 10 Proben, da jede Probe auch für die Messung werden 200 ul enthalten. </li><li> Inkubation in einem 37 ° C Wasserbad für 75 min, vor Licht geschützt. HINWEIS: Der Farbstoff wird in die Bakterienzellen in der Abwesenheit von glykolytischen Substraten und in Gegenwart von Probenecid zu Efflux des Farbstoffs zu minimieren geladen. </li><li> WASH 1: Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 2.400 × g für 10 min, zu entfernen Standes und Resuspension in 2 ml PBS, 1x Probenecid. WASH 2, 3: Wiederholen Sie Schritt 3.2.4 2x. Inkubieren bei 37 ° C für weitere 30 min. Dies ermöglicht es Zeit für bakterielle Esterasen, die Estergruppe Uhr von den verinnerlichten Fluoreszenzfarbstoffe hydrolysieren. </li><li> WASH 4: Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 2.400 × g für 10 min, zu entfernen Standes und Resuspension in 2 ml PBS, 1x Probenecid. HINWEIS: Je nach experiment, Glucose kann wieder hier, um neue Energie zu tanken die Bakterien aufgenommen werden. </li></ol></li><li> Detektieren der Fluoreszenz <ol><li> Vorwärmen die Fluoreszenzdetektion Plattenleser Plattenlesegerät auf 37 ° C </li><li> Für jede gewünschte Probe, 200 ul der beladenen Zellen (aus Schritt 3.2.8) in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte. (Führen Sie die folgenden Schritte bis zur Fertigstellung für ein gut / Probe zu einem Zeitpunkt). </li><li> Um eine Basislektüre für einen Brunnen, Platz Platte in der Fluoreszenzdetektion Plattenleser, um die Fluoreszenz (340 nm Anregung / 510 nm Emissions für &quot;Wert 1&quot; und 380 nm Anregung / 510 nm Emissions für &quot;Wert 2&quot;) am messen sollen jede Sekunde für eine min. </li><li> Werfen Platte, fügen Sie die Therapie der Wahl zu diesem auch (in einem kleinen Volumen von ca. 5 ul), schnell zu pipettieren, oben und unten ein paar Mal, um zu mischen und sofort wieder auf das in der Fluoreszenz-Detektionsplatte-Leser, jeden sec für die gewünschte lesen Dauer. (Wenn die inProjektoren mit dem Plattenlesegerät zugeordnet sind, diese könnten auch verwendet werden, um nahtlos fügen Sie die gewünschte Behandlung, wodurch die Notwendigkeit, um den Lese Auswerfen der Platte). </li><li> Exportieren Sie die Messwerte mit einer Datenanalyseprogramm wie Microsoft Excel. Berechnen Sie das Verhältnis der Fluoreszenzwerte für jede Zeitpunkt berechnet, indem ein Wert von Wert 2, und zeichnen Sie die Verhältniswerte in einer Grafik. </li></ol></li></ol> 4. Erfassen von Änderungen in der intrazellulären pH-Wert <ol><li> Vorbereiten Reagenzien und Puffer Kalibrierung <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Reagenzien: 5 mM Stamm BCECF / AM (. Fügen Sie die entsprechende Menge DMSO in ein Röhrchen mit 50 ug des Farbstoffs Dieser Bestand ist bei -20 ° C 3 Monate haltbar), 100x Probenecid (1 ml PBS auf eine 77-mg-Durchstechflasche). 1 mM Stoffaufbereitung Nigericin in Ethanol (erforderlich, um den intrazellulären pH-Wert (pH-Wert ins Gleichgewicht i) der Zellen auf den pH-Wert der umgebenden Puffer Dieser Bestand ist sTabelle bei -20 ° C für 6 Monate);. 0,5 mM Stamm von Carbonyl Cyanid 3-chlorphenylhydrazon (CCCP) in DMSO (protonophore die Protonenantriebskraft entkoppeln Dieser Bestand ist bei -20 ° C stabil für 6 Monate) </li><li> Vorbereitung 10 ml der folgenden hohen Kalium Puffer: 135 mM KH 2 PO 4/20 mm NaOH (einbasischen) und 110 mM K 2 HPO 4/20 mm NaOH (dibasischen). Filter sterilisieren unter Verwendung eines 0,45 um-Filter. (Diese Puffer können bei 4 ° C bis zur Verwendung gelagert werden.) </li><li> Mischen der hohen Kaliumpuffer in den notwendigen Mengen, um hohe Kaliumpuffer mit mindestens 5-6 pH-Werten im Bereich von 6,5 bis 8,0 zu schaffen. </li><li> Herstellung von 1 ml 2 × Ladepuffer wie folgt: In den Boden eines 15 ml konischen Kunststoffrohr verzichten 40 ul 100x Antriebsladung, gefolgt von 20 ul 5 mM ionenempfindlichen Farbstoff direkt in die Antriebsladung. Vortex kurz mischen. In 900 ul PBS, gefolgt von 40 ul 100x Probenecid. VortEx die Mischung ein letztes Mal. In Folie wickeln, um vor Licht zu schützen. </li></ol></li><li> Laden der Bakterien, die mit Farbstoff <ol><li> Pellet und waschen Sie die 8 ml der mittleren logarithmischen Phase Bakterienkultur wie in 2.2.1 beschrieben. Überstand entfernen, Pellet erneut in 2 ml PBS, eine &quot;4x&quot; Zellsuspension zu machen. </li><li> 1 ml der Zellsuspension 4x an den 2x Ladepuffer. Dies wird für ein Endvolumen von 2 ml, und Endkonzentrationen von Zellen 2x, 2x Antriebsladung 50 um Fluoreszenzfarbstoff und 2x Probenecid bereitzustellen. </li><li> Inkubation in einem 30 ° C Wasserbad für 40 min, vor Licht geschützt. HINWEIS: Der Farbstoff wird in die Bakterienzelle bei der niedrigeren Temperatur von 30 ° C und in Abwesenheit von glykolytischen Substrate Efflux des Farbstoffs zu minimieren geladen. </li><li> WASH 1: Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 2.400 xg für 10 min Überstand zu entfernen, um überschüssige Farbe zu entfernen, und resuspendieren in 4 ml PBS, enthaltend 2x Probenecid einnd 1 mM Glukose (Kraft zu tanken, um die Bakterien). WASH 2, 3: Wiederholen Sie Schritt 4.2.7 zweimal mit endgültigen Resuspension in 4 ml PBS (für eine Endkonzentration von 1x Zellen) enthält, 2x Probenecid und 10 mM Glucose. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C für 5 min. Dadurch können die Zellen vollständig mit Energie zu versorgen und damit Zeit für die bakterielle Esterasen, um die Uhr Estergruppe vom verinnerlicht BCECF spalten. </li></ol></li><li> Gründung Hintergrundfluoreszenz und in vivo Eichkurve <ol><li> Vorwärmen die Fluoreszenzdetektion Plattenleser Plattenlesegerät auf 37 ° C </li><li> Zu bestimmen, die Hintergrundfluoreszenz, Filter-sterilisiert etwa 500 ul der belasteten und erregt bakteriellen Suspension (aus Schritt 4.2.7), um die Bakterien zu entfernen, und mit 200 &amp;mgr; l Filtrat nach der Vertiefung der 96-Well-Platte. </li><li> Zeigen Platte in der Fluoreszenzdetektion Plattenleser, um die Fluoreszenz zu messen (490 nm Anregung / Emission 530 nm für&quot;Wert 1&quot; und 440 nm Anregung / 530 nm Emissions für &quot;Wert 2&quot;) für 1 min. Dieses Hintergrundfluoreszenz sollte vor der Berechnung der Verhältnisse sowohl für die Eichkurve und die experimentellen Proben abgezogen. </li><li> Um eine in vivo-Eichkurve zu erhalten, waschen Sie 500 ul Aliquots der geladenen und energiegeladen Zellen aus Schritt 4.2.7 und resuspendieren einmal in hohen Kalium-Puffer bei verschiedenen pH-Werten (im Bereich von 6,5 bis 8,0). </li><li> Mit 20 &amp;mgr; M Nigericin zu den Proben, um den intrazellulären pH-Wert der Zellen, den pH-Wert der umgebenden Puffer äquilibriert und bei 37 ° C für 5 min. Gib 200 ul Bakterien / pH Pufferkombinationen in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte. </li><li> Zeigen Platte in der Fluoreszenzdetektion Plattenleser, um die Fluoreszenz für ein paar Minuten zu messen, um eine stetige Lektüre für jeden gut zu etablieren. Exportieren Sie die Messwerte mit einer Datenanalyseprogramm wie Microsoft Excel. </li><li> Nach Abzug der background Fluoreszenzwerte, berechnen Sie das Verhältnis der Fluoreszenzwerte durch Division von Wert 1 Wert 2. Zeichnen Sie die Ratio-Werte für jede pH-Puffer, um die Eichkurve zu erstellen. (Eine Eichkurve sollte für jede neue Charge des beladenen Zellen erzeugt werden, wie die Menge an Fluoreszenzfarbstoff, der in den Bakterien beladen ist, kann jedes Mal variieren). </li></ol></li><li> Messen von Veränderungen der intrazellulären pH-Wert <ol><li> Für jede gewünschte Probe, 200 ul der belasteten und erregten Zellen (aus Schritt 4.2.7) in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte. </li><li> Zeigen Platte in der Fluoreszenzdetektion Plattenleser und messen die Fluoreszenz der Proben alle 5 Sekunden für 5 min. </li><li> Werfen Sie die Platte, und fügen Sie 10 uM CCCP, um ein gut (dient als positive Kontrolle für die Verringerung der intrazellulären pH-Wert) und der Versuchsmittel (n) von Interesse für den anderen Brunnen. Um deren Auswirkungen genau zu vergleichen mit der Zeit, fügen Sie die CCCP und Mittel der Wahl in der gleichen Zeit mit Uhrultichannel Pipette. </li><li> Sofort die Platte zurück auf die Platte-Leser und weiter Fluoreszenzmessung alle 5 Sekunden für 10 min. Als zusätzliche Kontrolle, werfen Sie die Platte und mit 20 uM Nigericin für alle Proben, um den pH i der Bakterien auf den pH-Wert der umgebenden Puffer ins Gleichgewicht, und lesen für 5 min. </li><li> Nach Subtraktion der Hintergrund-Fluoreszenz-Werte berechnen die Verhältnisse der Fluoreszenz für jede Probe. Interpolieren des pH i für jede Messung aus der Eichkurve. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben keine finanziellen Interessen im Wettbewerb zu erklären.

Trotz der Einschränkung, dass Größe stellt für die Verwendung von klassischen Methoden der Elektrophysiologie, Änderungen in der Polarität und der Unversehrtheit der Membran und Änderungen der Ionenkonzentration in Bakterien zu detektieren, haben wir einen Weg, um diese Ereignisse zu messen beschrieben in S. pneumoniae Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen. Unsere Protokolle sind die ersten ihrer Art für die Pneumokokken und einer der wenigen, für die Bakterienarten im Allgemeinen beschrieben wird. Dur...

Unser Labor hat ein Protein-Lipid-Komplex aus menschlicher Milch namens Hamlet (für Menschen Alpha-Lactalbumin Aus tödlich Tumorzellen), die Apoptose in Tumorzellen induziert identifiziert, aber auch in der Lage, eine Vielzahl von Bakterienarten 1,2 töten. Die Arten, die sich als besonders sensitiv waren diejenigen, die die Atemwege zielen, mit Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) Anzeigen des größten Empfindlichkeit und ein Apoptose-ähnlichen Phänotyp Todes 2,3. Membrandepolarisation und spezifische Ionentransportereignisse sind gut beschrieben und entscheidenden Ereignisse während der Apoptose in eukaryotischen Zellen, insbesondere in den Mitochondrien, wo radioaktive TPP +-Ionen und Fluoreszenzfarbstoffe einschließlich JC-1 und TMRE wurden zur Depolarisation der Mitochondrienmembran 3 zeigen, -5. So haben wir versucht, mehr über die Wirkung von HAMLET auf diesen Membran-bezogene Funktionen in der Pneumokokken zu lernen, wie wir unsere Anstrengungen konzentrierenein besseres Verständnis der mechanistischen Komponenten des Apoptose-ähnlichen Phänotyps in Bakterien mit großem Potential zur Identifizierung neuer antibakterielle Therapien oder Impfstoffkandidaten in den Prozess. In dem Bestreben, Protokolle für unsere mechanistische Untersuchungen zu schaffen, haben wir entdeckt, dass im Gegensatz zu den gut beschriebenen Methodik in eukaryontischen Systemen, gibt es sehr wenige veröffentlichte Studien Detaillierung Elektrophysiologie und Ionentransportmechanismen der bakteriellen Membran 6,7. Dies ist vor allem auf die kleinere Größe der Mikroorganismen und ihrer Oberflächenarchitektur, insbesondere die Anwesenheit von Zellwand beschränkt, dass die Zugänglichkeit der Membran für die Verwendung von herkömmlichen Methoden, wie eukaryontische Patch-Clamping, obwohl einige Studien mit riesigen Protoplasten wurden mit unterschiedlichem Erfolg durchgeführt worden zurückzuführen 8,9. Wie die Arbeit mit diesen riesigen Protoplasten ist keine ideale oder sogar praktische Methode für die meisten Bakterienarten, da es Menschen erfordertipulated Bakterien in einer unnatürlichen und abiotischen Zustand die begrenzte Studien der Bakterienmembran Polarität, die durchgeführt wurden in erster Linie verwendet Durchflusszytometrie und die Verwendung von Cyanin-und Oxonol-Farbstoffe fluoreszierende 10-16. Statt der Durchflusszytometrie, welche einzelnen Fluoreszenzmesswerte zu einem einzigen Zeitpunkt Punkt sammelt von einem Bakterium, entschieden wir uns, eine Fluoreszenzdetektion Plattenlesegerät verwenden, um Fluoreszenzintensität der Bakteriensuspensionen in einer 96-Well-Plattenformat im Laufe der Zeit zu erkennen. Dies ermöglichte es uns, eine Population von Bakterien zu verschiedenen Zeitpunkten mit viel größerer Einfachheit und Leichtigkeit zu behandeln und überwachen kontinuierlich die Fluoreszenz-Kinetik der gesamten Bevölkerung für längere Zeit, die nur schwer mittels Durchflusszytometrie zu erreichen ist. Nach dem Testen eine Vielzahl der potentialsensitive Fluoreszenzfarbstoffe (einschließlich der oben zur Verwendung mit der genannten Mitochondrien) erzielten wir die besten technischen und praktischen Erfolg mit derBis-Oxonol-Farbstoff genannt DiBAC 4 (3) (Bis-(1,3-dibutylbarbituric Säure) Trimethinoxonol) auf Änderungen in der Polarität zu überwachen. Wir fanden es auch wertvoll, um gleichzeitig Störungen in der Unversehrtheit der Membran unter Verwendung von Propidiumiodid (PI) zu überwachen. Dieser Farbstoff fluoresziert bei der Bindung an Nukleinsäure, ist aber nur in der Lage, dies zu tun, wenn die Integrität der Bakterienmembran beeinträchtigt wird, so dass es die beliebte Komponente verwendet, um tote Zellen zu erkennen im Live-tot-Färbung-Assays. Zusätzlich zu PI, SYTOX grün und TO-PRO-1 sind Fluoreszenzfarbstoffe, die eine ähnliche Wirkung besitzen und wurden zuvor für Bakterien in einigen Studien unter Verwendung der Durchflusszytometrie Nachweisverfahren 17 verwendet. Wir entschieden uns, PI wegen seiner Anregungswellenlänge, die uns zu seiner Fluoreszenz gleichzeitig mit DiBAC in einer gegebenen Probe zu überwachen erlaubt zu verwenden. In unseren Studien haben wir, dass HAMLET, sowie ein weiteres verwandtes Protein-Lipid-Komplex mit der bakteriziden Aktivität beobachtetals Eloa induzierte Depolarisation und Bruch der Bakterienmembran bekannt, wie durch Zunahme der Fluoreszenz der beiden Farbstoffe bei der Behandlung der Pneumokokken 3,18,26 angegeben. Für beide Komplexe beobachteten wir, dass die Fluoreszenzintensität der DiBAC 4 (3) vor der Erhöhung der Intensität des PI erhöht, was anzeigt, daß die Depolarisation stattgefunden vor Bruch und ist daher ein bestimmtes Ereignis durch unsere bakterizide Protein-Lipid-Komplexen von induzierten Interesse. Diese Unterscheidung ist wichtig zu machen, als Bruch der Membran selbst verursachen unspezifische Depolarisation. Messung und Analyse sowohl DiBAC 4 (3) und PI-Fluoreszenz-Kinetik gleichzeitig erlaubt es uns, diese Beziehung zwischen den beiden Membran Ereignisse, die ein zusätzlicher Vorteil der Verwendung Fluorometrie statt Durchflusszytometrie ist zu prüfen. Um bakterielle Ionenfluss zu überwachen, hat es einige bisherigen Erfolge mit der Verwendung von Radioisotopen, einschließlich der Aufnahme von Mess45 Ca 2 + in der Pneumokokken 19,20, die wir auch in unseren bisherigen Untersuchungen 18, 21 verwendet. , Die Arbeit mit diesen radioaktiven Ionen hat jedoch mehrere Nachteile. Sie können teuer, zeitaufwendig und schwierig, und auch die einzelnen aussetzen Durchführung des Experiments zu schaden, abhängig von der Isotopen von Interesse. Zusätzlich ist es schwierig, schnelle Änderungen im Laufe der Zeit zu überwachen. Somit Richtung einer alternativen Methode der Messung, die Acetoxymethyl-(AM)-ester Versionen von ionensensitiven Fluoreszenzindikatorfarbstoffe verwendet wandten wir. An sich ist der Indikatorfarbstoff gegeben und nicht durch die Membran leicht, aber mit der Zugabe des lipophilen Estergruppe kann die jetzt ungeladenes Molekül durch die Membran des Bakteriums geben. Beim Eintritt in den Innenraum, die Bakterien Esterasen spalten die Estergruppe, so dass der Farbstoff in der Zelle frei und wieder aufgeladen, deutlich verlangsamt seine Fähigkeit, die Zelle zu verlassen und so der Farbstoff to reichern sich über die Zeit. Jedoch ist die Verwendung dieser Ester Farbstoffe nur in einigen Bakterienspezies beschrieben worden, um Veränderungen der intrazellulären Ca 2 + + H 22-24 und 16 zu erkennen, mit unterschiedlichen Methoden der Beladung, Detektion und Erfolg. Mit dem Wunsch, Änderungen der intrazellulären Ca 2 + zu überwachen und K + und H +-Konzentrationen in S. pneumoniae bei Behandlung mit HAMLET und andere Verbindungen, die wir erfolgreich erstellt Protokolle, um fluoreszierende Indikatorfarbstoffe in Bakterienzellen effizient zu laden. Effektive Laden in Bakterien erforderlich, die sowohl Probenecid Farbstoffretention erhöht durch die Blockierung Anionen-Transporter und Antriebsladung, eine proprietäre Verbindung von Life Technologies, die Beladungseffizienz erhöht. Fura-2/AM (Erfassungs Ca 2 +), PBFI / AM (Erfassungs K +) und BCECF / AM (Erfassungs H +) wurden erfolgreich in sowohl nicht eingekapselte und eingekapselt Pneumokokken st geladenRegen eine Messung der resultierenden Fluoreszenz-Muster nach der Zugabe von Ionophoren, wie Ionomycin (Ca 2 + Entkoppler) Valinomycin (K + Entkoppler) und CCCP (H + Entkoppler) unter Verwendung eines Fluoreszenz-Plattenleseerfassungs 18, 21.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="864">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Todd Hewitt</td>
			<td style="width:139px;">Bacto, BD Diagnostics</td>
			<td style="width:143px;">249240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:139px;">Bacto, BD Diagnostics</td>
			<td style="width:143px;">212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Phosphate Buffered Saline (PBS; pH 7.2)</td>
			<td style="width:139px;">Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">D5879</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:359px;">DiBAC4(3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol)</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">B-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P4170</td>
			<td>Make up in deionized water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PowerLoad</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">P10020</td>
			<td>100X concentrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Probenecid</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">P36400</td>
			<td>Make 100X stock by adding 1 ml of PBS to one 77 mg vial</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Fura-2/AM</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">F1221</td>
			<td>Special packaging (50 &#181;g aliquots)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PBFI/AM</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">P1267</td>
			<td>Special packaging (50 &#181;g aliquots)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Nigericin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">N7143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:139px;">JT Baker</td>
			<td style="width:143px;">3246-01</td>
			<td>monobasic</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">K2HPO4</td>
			<td style="width:139px;">JT Baker</td>
			<td style="width:143px;">4012-01</td>
			<td>dibasic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">NaOH</td>
			<td style="width:139px;">JT Baker</td>
			<td style="width:143px;">5565-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">BCECF/AM</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">B1170</td>
			<td>Special packaging (50 &#181;g aliquots)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:359px;">CCCP</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>Protonophore that causes an influx of H+ into the cytoplasm,</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;dissipating the electrical potential and the H+ gradient.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Culture tube&#160;</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">53283-802</td>
			<td>Fits the Spectronic spectrophotometer; borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>Spectronic 20D+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">15 ml plastic conical tube</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:143px;">430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Clear 96-well polystyrene microtiter plate</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">12-565-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Plate reader</td>
			<td style="width:139px;">BioTek</td>
			<td style="width:143px;">Synergy 2 Multi-Mode&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:143px;">Microplate Reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:359px;">Gen5 software</td>
			<td style="width:139px;">BioTek</td>
			<td style="width:143px;">Gen5&#8482; Software</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring changes in membrane polarity, membrane integrity, and intracellular ion concentrations in streptococcus pneumoniae using fluorescent dyes

Membran-Depolarisation und Ionenflüsse sind Ereignisse, die ausgiebig in biologischen Systemen aufgrund ihrer Fähigkeit, tiefgreifend beeinträchtigen Zellfunktionen, einschließlich Energetik und Signaltransduktion untersucht worden sind. Während beide Fluoreszenz-und elektrophysiologischen Methoden, einschließlich Elektrodenverbrauch und Patch-Clamp, sind gut für die Messung dieser Ereignisse in eukaryotischen Zellen entwickelt haben Methodik zur Messung von ähnlichen Veranstaltungen in Mikroorganismen schwieriger zu entwickeln, bewährt aufgrund ihrer geringen Größe in Kombination mit der immer komplexer äußeren Oberfläche von Bakterien Abschirmen der Membran. Während unserer Studien des Todes-Einweihung in Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken), wollten wir die Rolle der Membran Ereignisse, einschließlich der Änderungen in der Polarität, Integrität und intrazellulären Ionenkonzentrationen aufzuklären. Suche in der Literatur fanden wir, dass nur sehr wenige Studien existieren. Andere Forscher hatten Radioisotop-Aufnahme oder Ionen-Gleichgewicht Grippe messen überwachtxes und Membranpotential und eine begrenzte Anzahl von Studien, vor allem in Gram-negative Organismen, hatte einige Erfolge gesehen mit Carbocyanin oder oxonol fluoreszierenden Farbstoffen Membranpotential zu messen, oder Laden Bakterien mit Zell-permeant acetoxymethyl (AM)-Ester-Versionen von ionensensitiven fluoreszierende Indikatorfarbstoffe. Wir haben deshalb festgelegt und optimierte Protokolle für die Messung Membranpotential, Bruch, und Ionentransport in der Gram-positiven Organismus S. pneumoniae. Wir entwickelten Protokollen unter Verwendung des Bis-Oxonol-Farbstoff DiBAC 4 (3) und der Zell-impermeante Farbstoff Propidiumiodid zu Membrandepolarisation und Bruch zu messen, die jeweils, ebenso wie Verfahren, um optimal die Pneumokokken mit den AM-Ester der ratiometrische Farbstoffe laden Fura-2, PBFI und BCECF um Veränderungen der intrazellulären Konzentration von Ca 2 +, K + und H +, jeweils zu erfassen, unter Verwendung eines Fluoreszenz-Plattenleseerfassungs. Diese Protokolle sind die ersten ihrer Art für die Pneumokokkenund die meisten dieser Farbstoffe nicht in andere Bakterienspezies verwendet wurde. Obwohl unsere Protokolle für S. optimiert pneumoniae, glauben wir, diese Ansätze sollten einen hervorragenden Ausgangspunkt für ähnliche Studien in anderen Bakterienarten bilden.

Bei allen Experimenten, gibt es eine Reihe von Proben und in jeder Vertiefung vorhanden Bedingungen. Somit wird jedes Verfolgung stellt die Fluoreszenzintensität einer gesamten Bakterienpopulation im Laufe der Zeit. Die Ergebnisse sollten leicht zu interpretieren sein, mit einer klaren Unterscheidung zwischen der Fluoreszenz der behandelten Proben und die der unbehandelten Kontrollen. Die Kinetik und der Grad eines beobachteten Fluoreszenzänderung kann Informationen über die möglichen Mechanismus und das Au...

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Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Anders als bei Eukaryonten zu sehen, gibt es nur wenig Untersuchungen, die detailliert Membrandepolarisation und Ionenkonzentrationsänderungen in Bakterien, in erster Linie ihrer geringen Größe macht herkömmliche Messverfahren schwierig. Hier haben wir ausführlich Protokolle zur Überwachung solcher Veranstaltungen in der deutlichen Gram-positive Erreger Streptococcus pneumoniae Verwendung Fluoreszenztechniken.

Überwachen von Änderungen in Membran-Polarity, Membrane Integrity und intrazelluläre Ionenkonzentrationen in<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Verwenden von Fluoreszenzfarbstoffen

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

13.5K Aufrufe.  University at Buffalo, State University of New York.  Anders als bei Eukaryonten zu sehen, gibt es nur wenig Untersuchungen, die detailliert Membrandepolarisation und Ionenkonzentrationsänderungen in Bakterien, in erster Linie ihrer geringen Größe macht herkömmliche Messverfahren schwierig. Hier haben wir ausführlich Protokolle zur Überwachung solcher Veranstaltungen in der deutlichen Gram-positive Erreger Streptococcus pneumoniae Verwendung Fluoreszenztechniken. 

Serie: Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Mit Bioluminescent Imaging, um Synergie von Untersuchen Streptococcus pneumoniae Und Influenza A Virus in Infant Mäuse

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Live Cell Imaging von Bacillus subtilis Und Streptococcus pneumoniae Verwendung von Automated Zeitraffer-Mikroskopie

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

Charakterisierung von Entzündungsreaktionen während der intranasalen Kolonisation mit Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

Verwendung Fluoreszierende Proteine, zu visualisieren und zu quantifizieren<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vakuole Wachstumsdynamik in lebenden Zellen

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal epidemiology, capsular serotyping can provide useful information for vaccine efficacy and impact studies.&#160;The Quellung reaction is the gold standard method for pneumococcal capsular serotyping. The method involves testing a pneumococcal cell suspension with pooled and specific antisera directed against the capsular polysaccharide. The antigen-antibody reactions are observed microscopically. The protocol has three main steps: 1) preparation of a bacterial cell suspension, 2) mixing of cells and antisera on a glass slide, and 3) reading the Quellung reaction using a microscope. The Quellung reaction is reasonably simple to perform and can be applied wherever a suitable microscope and antisera are available.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

The Quellung reaction is the gold standard technique for serotyping Streptococcus pneumoniae. This technique utilizes a microscope and specific pneumococcal antisera and is commonly used in reference and research laboratories worldwide.

Kapsel Serotypisierung von<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Verwenden der Quellung Reaktion

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the &#8216;gold standard&#8217; Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective. 
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Latex agglutination testing is a simple, rapid and inexpensive method for serotyping Streptococcus pneumoniae, and has also been widely applied in diagnostic microbiology. This manuscript describes the in-house production of latex agglutination reagents, quality control procedures and the application of this technique to pneumococcal serotyping.

Kapsel Serotypisierung<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Durch Latexagglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, immunodiagnostics and more recently as therapeutic agents. Traditional methods for labeling antibodies with small molecules require purified antibodies at relatively high concentration, involve multiple dialysis steps and have limited throughput. However, several applications, including the field of Antibody Drug Conjugates (ADCs), will benefit from new methods that will allow labeling of antibodies directly from cell media. Such methods may allow antibodies to be screened in biologically relevant assays, for example, the receptor-mediated antibody internalization assay in the case of ADCs. Here, we describe a method (on-bead method) that enables labeling of small amounts of antibodies directly from cell media. This approach utilizes high capacity magnetic Protein A and Protein G affinity beads to capture antibodies from the cell media followed by labeling with small molecules using either amine or thiol chemistry and subsequent elution of the labeled antibodies. Taking fluorescent dyes as surrogates for small molecules, we demonstrate the on-bead labeling of three different mouse antibodies directly from cell media using both amine and thiol labeling chemistry. The high binding affinity of antibodies to Protein A and Protein G ensures high recoveries as well as high purity of the labeled antibodies. In addition, use of magnetic beads allows multiple samples to be handled manually, thereby significantly improving labeling throughput.

The on-bead method for labeling antibodies with small molecules enables labeling of a small amount of antibodies directly from cell media. This method is compatible with amine and thiol chemistry, and can handle multiple samples in parallel, manually or using automated platforms.

Antikörpermarkierung mit Fluoreszenzfarbstoffen unter Verwendung von magnetischen Protein A und Protein G-Kügelchen

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, ...

Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I molecules also known as cross-presentation (CP). CP plays an important role not only in the stimulation of na&#239;ve CD8+ T cells and memory CD8+ T cells for infectious and tumor immunity but also in the inactivation of self-acting na&#239;ve T cells by T cell anergy or T cell deletion. Although the critical molecular mechanism of CP remains to be elucidated, accumulating evidence indicates that exogenous antigens are processed through endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) after export from non-classical endocytic compartments. Until recently, characterizations of these endocytic compartments were limited because there were no specific molecular markers other than exogenous antigens. The method described here is a new vesicle isolation protocol, which allows for the purification of these endocytic compartments. Using this purified microsome, we reconstituted the ERAD-like transport, ubiquitination, and processing of the exogenous antigen in vitro, suggesting that the ubiquitin-proteasome system processed the exogenous antigen after export from this cellular compartment. This protocol can be further applied to other cell types to clarify the molecular mechanism of CP.

The method described here is a new vesicle isolation protocol, which allows for the purification of the cellular compartments where exogenous antigens are processed by endoplasmic reticulum-associated degradation in cross-presentation.

Reinigung der Membran-Fach für endoplasmatische Retikulum-assoziierten Abbau von exogenen Antigenen in Kreuz-Präsentation

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can result in disease. Understanding the underlying molecular mechanisms surrounding cell membrane repair is, therefore, an important objective to the development of novel therapeutic strategies for diseases associated with dysfunctional cell membrane dynamics. Many in vitro and in vivo studies aimed at understanding cell membrane resealing in various disease contexts utilize two-photon laser ablation as a standard for determining functional outcomes following experimental treatments. In this assay, cell membranes are subjected to wounding with a two-photon laser, which causes the cell membrane to rupture and fluorescent dye to infiltrate the cell. The intensity of fluorescence within the cell can then be monitored to quantify the cell's ability to reseal itself. There are several alternative methods for assessing cell membrane response to injury, as well as great variation in the two-photon laser wounding approach itself, therefore, a single, unified model of cell wounding would beneficially serve to decrease the variation between these methodologies. In this article, we outline a simple two-photon laser wounding protocol for assessing cell membrane repair in vitro in both healthy and dysferlinopathy patient fibroblast cells transfected with or without a full-length dysferlin plasmid.

Cell membrane wounding via two-photon laser is a widely used method for assessing membrane resealing ability and can be applied to multiple cell types. Here, we describe a protocol for in vitro live-imaging of membrane resealing in dysferlinopathy patient cells following two-photon laser ablation.

Zellmembran Reparatur Assays mit einem zwei-Photonen-Laser-Mikroskop

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

Hochdurchsatz-Messung der Plasmamembran Wiederverschließen Effizienz in Säugerzellen

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...