1. Antikörper-Capture auf High Capacity Magnetic Protein A oder Protein G Magnetic Beads <ol><li> Einheitlich resuspendieren magnetische Kügelchen durch leichtes Schütteln. Halten Sie die Suspension gleichmäßig, wenn Aliquotierung Perlen. </li><li> Je 50 ul Kügelchenaufschlämmung in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Legen Sie in dem magnetischen Ständer für 10 Sekunden. Sie vorsichtig den Speicherpuffer zu entfernen. </li><li> In 250 ul Antikörper-Bindungspuffer. </li><li> Mischen Sie und legen Sie in dem magnetischen Ständer für 10 Sekunden. Sie vorsichtig den Bindungspuffer zu entfernen. </li><li> 1,0 ml der Probe, die 50-100 ug Antikörper an die Kügelchen. Die Proben können Antikörper oder Antikörper in Zellmedien gereinigt werden. </li><li> Mix Probe für 60 min bei RT mit einem Vortex-Mischer oder End-Over-End-Mixer. </li><li> Das Röhrchen in den magnetischen Ständer für 10 Sekunden und entfernen Sie den Überstand. </li><li> In 250 ul Antikörper-Bindungs ​​/ Waschpuffer und mischen. Legen Sie in dem magnetischen Ständer für 10 Sekunden und entfernen Bindung / Waschpuffer. Wiederholen Sie diesen Vorgang step für insgesamt zwei Waschungen. </li><li> Fahren Sie mit Abschnitt 2 Etikett unter Verwendung von Antikörpern Aminchemie oder in Abschnitt 3 zur Kennzeichnung von Antikörpern Thiolchemie. </li></ol> 2. Antikörpermarkierung Mit Amine Chemie <ol><li> Konjugatantikörper <ol><li> 100 l Amin Konjugationspuffer an die Kügelchen. </li><li> Lösen die aminreaktive Fluoreszenzfarbstoffe (AlexaFluor 532-SE) bei 10 mg / ml durch Zugabe von 100 &amp; mgr; l Dimethylsulfoxid (DMSO) bis 1,0 mg Farbstoff. Mix von Verwirbelung. Machen Sie diese Lösung kurz vor dem Gebrauch. </li><li> Hinzufügen, 2,5 ul aminreaktiven Farbstoff für 100 ug Antikörper. Anmerkung: In der Regel eine 5-20 molarer Überschuß an Reaktivfarbstoff empfohlen. Jedoch zugegebene Menge an Reaktivfarbstoff auf die Reaktions empirisch optimiert werden muss, je nach gewünschten Farbstoff-Antikörper-Verhältnis und intrinsische Antikörpereigenschaften. </li><li> Mix Probe für 60 min bei RT mit einem Vortex-Mischer oder End-Over-End-Mixer. Stellen Sie sicher, dass die Perlen in suspensio bleibenn. </li><li> Das Röhrchen in den magnetischen Ständer für 10 Sekunden und entfernen Sie den Überstand. </li><li> In 250 ul Antikörper-Bindungs ​​/ Waschpuffer und mischen. Legen Sie in dem magnetischen Ständer für 10 Sekunden. Entfernen und entsorgen Bindung / Waschpuffer. Wiederholen Sie diesen Schritt für insgesamt zwei Wäschen. </li></ol></li><li> Antikörper Rettung <ol><li> In 50 ul Elutionspuffer an die Kügelchen. </li><li> Mischen Sie für 5 min bei RT mit einem Vortex-Mischer oder End-Over-End-Mixer. Stellen Sie sicher, dass die Perlen in Suspension bleiben. </li><li> Das Röhrchen in den magnetischen Ständer für 10 Sekunden. Entfernen eluierten Probe und Transfer in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen, die 5 &amp; mgr; l Neutralisationspuffer. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang noch einmal und bündeln die eluierten Proben. </li><li> Quantifizieren der Antikörperkonzentration und Farbstoff-zu-Antikörper-Verhältnis, wie in Abschnitt 4 beschrieben. </li></ol></li></ol> 3. Antikörpermarkierung Mit Thiolchemie <ol><li> Antikörper Reduction <ol><li> In 250 ulvon Thiolkonjugation Puffer und Mix. Das Röhrchen wird in dem magnetischen Ständer für 10 Sekunden. Entfernen Sie den Puffer zu verwerfen. Zweimal wiederholen Sie diesen Schritt. </li><li> 100 l Thiolkonjugation Puffer. </li><li> Hinzufügen, Dithiothreitol (DTT) auf eine Endkonzentration von 2,5 mM. </li><li> Mix Probe für 60 min bei RT mit einem Vortex-Mischer oder End-Over-End-Mixer. Stellen Sie sicher, dass die Perlen in Suspension bleiben. </li><li> Das Röhrchen wird in dem magnetischen Ständer für 10 Sekunden und den Puffer zu verwerfen. </li><li> In 250 ul Thiolkonjugation Puffer und mischen. Das Röhrchen wird in dem magnetischen Ständer für 10 Sekunden. Entfernen Sie den Puffer zu verwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt für insgesamt zwei Wäschen. </li><li> 100 l Thiolkonjugation Puffer. </li></ol></li><li> Konjugatantikörper <ol><li> Man löst den Thiol-reaktiven Farbstoff bei 10 mg / ml durch Zugabe von 100 &amp; mgr; l DMSO zu 1,0 mg Farbstoff. Mix von Verwirbelung. Machen Sie diese Lösung kurz vor dem Gebrauch. </li><li> Hinzufügen, 2,5 ul thiol-Reaktivfarbstoff für 100 ug antiKörper. Anmerkung: In der Regel eine 5-20 molarer Überschuß an Reaktivfarbstoff empfohlen. Jedoch zugegebene Menge an Reaktivfarbstoff auf die Reaktions empirisch optimiert werden muss, je nach gewünschten Farbstoff-Antikörper-Verhältnis und intrinsische Antikörpereigenschaften. </li><li> Mix Probe für 60 min bei RT mit einem Vortex-Mischer oder End-Over-End-Mixer. Stellen Sie sicher, dass die Perlen in Suspension bleiben. </li><li> Das Röhrchen wird in dem magnetischen Ständer für 10 Sekunden und entfernen Sie den Überstand. </li><li> In 250 ul Thiolkonjugation Puffer und mischen. Legen Sie in dem magnetischen Ständer für 10 Sekunden und den Puffer zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt für insgesamt zwei Wäschen. </li></ol></li><li> Eluieren Antikörper <ol><li> In 50 ul Elutionspuffer an die Kügelchen. </li><li> Mischen Sie für 5 min bei RT mit einem Vortex-Mischer oder End-Over-End-Mixer. Stellen Sie sicher, dass die Perlen in Suspension bleiben. </li><li> Das Röhrchen in den magnetischen Ständer für 10 Sekunden. Entfernen Sie eluierten Probe und in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen, das 5 ul neutralization Puffer. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang noch einmal und bündeln die eluierten Proben. </li><li> Quantifizieren der Antikörperkonzentration und Farbstoff-zu-Antikörper-Verhältnis, wie in Abschnitt 4 beschrieben. </li></ol></li></ol> 4. Berechnen Dye-zu-Antikörper-Verhältnis <ol><li> Messen der Extinktion des Antikörper-Farbstoff-Konjugat bei 280 nm (A280) und an der &amp; lambda; max für den Farbstoff (Amax). </li><li> Berechnen Sie die Antikörperkonzentration: Antikörper - Konzentration (mg / ml) = A280 - (A max × CF) / 1,4 wo CF = Korrekturfaktor des Farbstoffes (vom Hersteller zur Verfügung gestellt). </li><li> Berechnen Sie den Farbstoff-zu-Antikörper-Verhältnis: Farbstoff-zu-Antikörper - Verhältnis (DAR) = (a max × 150.000) / Ab - Konzentration (mg / ml) × ε Farbstoff wobei ε = Farbstoff der Extinktionskoeffizient des Farbstoffs an seinem Absorptionsmaximum und das Molekulargewicht des Antikörpers = 150000 Da. </li></ol>

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Authors are employees of Promega Corporation.

Das Ziel dieser Studie war es, ein Verfahren zu entwickeln, Antikörper, die in dem Zellmedium in geringen Konzentrationen, mit einer Vielzahl von kleinen Molekülen zu markieren. Ein derartiges Verfahren, eine große Anzahl von Antikörpern, während der frühen Phasen der Antikörper Entdeckung ermöglicht, mit kleinen Molekülen und gesiebt unter Verwendung eines biologisch relevanten Test gekennzeichnet werden. Ein solcher Assay ist der Rezeptor-vermittelten Internalisierung Antikörper Assay wo Internalisierung zwi...

Antikörper , markiert mit kleinen Molekülen sind vielleicht die am häufigsten verwendeten Reagenzien in der Biologie 1,2. Antikörper mit Fluoreszenzfarbstoffen markierte und Biotin werden in großem Umfang in der Bildgebung, Immunoassays, Durchflusszytometrie, Western - Blots und Immunpräzipitation unter anderen Anwendungen 3-6. Radioaktiv markierte Antikörper 3,7 finden umfangreiche Verwendung in der Bildgebung und Therapie, markierte Antikörper mit Zytostatika (ADCs) bieten neue Möglichkeiten für die Behandlung von Krebs und zwei ADCs wurden bereits für den therapeutischen Einsatz 8 genehmigt. Trotz einer umfassenden Nutzung haben sich die Verfahren zur Markierung von Antikörpern blieb überraschenderweise unverändert und beinhalten typischerweise mehrere Reaktionen und Entsalzung Schritte 9-12. Lösungsmethoden arbeiten sehr gut in Fällen, in denen nur wenige Antikörper müssen gekennzeichnet werden und in gereinigter Form zur Verfügung stehen hoch in hoher Konzentration und in ausreichender Menge. Jedoch für neuere Anwendungen wie ADCs gibt es einAntikörper müssen in der frühen Stufe Hybridom zu etikettieren , so dass sie für biologisch relevante Eigenschaften gescreent werden, beispielsweise rezeptorvermittelte Internalisierung Antikörper 13-16. Bei dem Hybridom Stadium sind Probenvolumina begrenzt, Antikörper werden in niedrigen Konzentrationen exprimiert und eine Anzahl von Proben sind groß, daher Lösung auf Basis Markierungsmethoden sind nicht geeignet. Zur Vereinfachung und den Durchsatz der traditionellen Antikörpermarkierung Methoden zu verbessern, einige alternative Ansätze wurden 17,18 vorgeschlagen. Ein Ansatz ist es nicht magnetischen Protein-A-Affinitätskügelchen in kleine Säulen gepackt zu verwenden, um Antikörper, gefolgt von der Markierungsreaktion und Elution von markiertem und gereinigtem Protein erfassen. Dieses Verfahren verwendet werden, die Antikörper direkt aus Zellmedien zu beschriften, jedoch kann die Verwendung von Säulen umständlich sein. Ein magnetisches bead basierte Methode wurde kürzlich berichtet worden , 19 daß die Verwendung von Spalten eliminiert und verbessert den Durchsatz , aber wegender begrenzten Antikörperkapazität der Beads Bindung nur Nanogramm bis niedrigen Mikrogramm-Mengen der Antikörper markiert werden. Wir haben vor kurzem entwickelt und verwendet hoher Kapazität magnetischen Protein A und Protein G - Kügelchen (&gt; 20 mg Human - IgG / ml des abgesetzten Kügelchen) 20 - Antikörpern in Zellmedien mit kleinen Molekülen zu markieren. Die hohe Kapazität der Kügelchen ermöglicht zehn bis hundert Mikrogramm Antikörper bequem gekennzeichnet werden und die schnelle magnetische Reaktion der Kügelchen vereinfacht die Handhabung und Verarbeitung einer großen Anzahl von Proben in parallel. Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen als Surrogate für kleine Moleküle zeigen wir, dass das Verfahren mit dem Amin und Thiol Markierungschemie kompatibel und bietet eine hohe Gewinnungsraten von markierten und sehr reine Antikörper. Dieses Protokoll und die zugehörigen Video beschreiben On-Bead-Kennzeichnung von Maus-Antikörper, die in den Zellmedien Magnetic Protein A und Protein G-Kügelchen verwendet wird. Das Protokoll istgliedert sich in vier Abschnitte: Abschnitt 1 beschreibt die Erfassung von Antikörpern auf den Wulst aus biologischen Proben. Nach Erfassung der Markierung von Antikörpern mit Fluoreszenzfarbstoff Aminchemie oder Thiolchemie verwendet, ist in den Abschnitten 2 und Abschnitt 3 beschrieben sind. Schließlich Abschnitt 4 beschreibt das Verfahren zur Berechnung der Antikörperkonzentration und der Farbstoff-Antikörper-Verhältnis.

<table><tbody><tr><td>Magne Protein A Beads</td><td>Promega Corporation</td><td>&amp;nbsp;G8781</td><td></td></tr><tr><td>Magne Protein G Beads</td><td>Promega Corporation&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;G7471</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester)</td><td>Life Technologies</td><td>A20001</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 532-ME (Malemide)</td><td>Life Technologies</td><td>A10255</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647-ME (Maleimide)</td><td>Life Technologies</td><td>A20347</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein-ME (Maleimide)</td><td>Life Technologies</td><td>F-150</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Stand</td><td>Promega</td><td>Z5332</td><td></td></tr></tbody></table>

antibody labeling with fluorescent dyes using magnetic protein a and protein g beads

Antikörper, markiert mit kleinen Molekülen, wie fluoreszierende Farbstoffe, Zytostatika, und radioaktive Tracer sind wesentliche Instrumente in der biomedizinischen Forschung, der Immundiagnostik und in jüngerer Zeit als therapeutische Wirkstoffe. Herkömmliche Verfahren zur Markierung von Antikörpern mit kleinen Molekülen erfordern Antikörper in relativ hoher Konzentration, beinhalten mehrere Dialyseschritte gereinigt und haben eine begrenzte Durchsatz. Jedoch mehrere Anwendungen, einschließlich dem Gebiet der Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs), werden von den neuen Methoden profitieren, die Markierung von Antikörpern direkt von Zellmedien ermöglicht. in biologisch relevanten Assays gescreent werden, beispielsweise der Rezeptor-vermittelten Internalisierung Antikörper-Assay im Falle von ADCs Solche Verfahren können Antikörper ermöglichen. Hier beschreiben wir ein Verfahren (on-bead-Methode), die Etikettierung von kleinen Mengen von Antikörpern direkt aus Zellmedien ermöglicht. Dieser Ansatz nutzt hohe Kapazität magnetischen Protein A und Protein G Affinitätsbeads Antikörper zu erfassenaus den Zellmedien durch Markierung mit kleinen Molekülen, gefolgt entweder Amin- oder Thiol-Chemie und anschließende Elution der markierten Antikörper verwendet. Unter Fluoreszenzfarbstoffe als Surrogate für kleine Moleküle, zeigen wir die On-Bead-Kennzeichnung von drei verschiedenen Maus-Antikörper direkt aus Zellmedien sowohl Amin und Thiol Markierungschemie verwendet wird. Die hohe Bindungsaffinität von Antikörpern an Protein A und Protein G sorgt für eine hohe Wiederfindungsraten sowie hoher Reinheit der markierten Antikörper. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von magnetischen Kügelchen mehrere Proben manuell, wodurch deutlich Kennzeichnungs Durchsatz verbessert behandelt werden.

Eine schematische für Antikörper mit kleinen Molekülen unter Verwendung von hoher Kapazität magnetischen Protein A und Protein G - Kügelchen Kennzeichnung ist in Abbildung 1 dargestellt. Antibodies auf dem magnetischen Protein G - Kügelchen eingefangen kann mit kleinen Molekülen markiert werden, beispielsweise Fluoreszenzfarbstoffe, entweder Aminchemie , die Etiketten primäre Amine der Lysin Aminosäuren oder unter Verwendung von Thiol-Chemie, die bei den reduzie...

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Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads

Die on-bead-Verfahren zum Nachweis von Antikörpern mit kleinen Molekülen Kennzeichnung ermöglicht die Kennzeichnung von einer geringen Menge an Antikörper direkt aus Zellmedien. Dieses Verfahren ist kompatibel mit Amin und Thiolchemie und kann mehrere Proben parallel, manuell oder mit automatisierten Systemen verarbeiten.

Antikörpermarkierung mit Fluoreszenzfarbstoffen unter Verwendung von magnetischen Protein A und Protein G-Kügelchen

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, ...

antibody-labeling-with-fluorescent-dyes-using-magnetic-protein

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.8K Aufrufe.  Promega Corporation.  Die on-bead-Verfahren zum Nachweis von Antikörpern mit kleinen Molekülen Kennzeichnung ermöglicht die Kennzeichnung von einer geringen Menge an Antikörper direkt aus Zellmedien. Dieses Verfahren ist kompatibel mit Amin und Thiolchemie und kann mehrere Proben parallel, manuell oder mit automatisierten Systemen verarbeiten. 

Serie: Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has relevant health and economic consequences. Many cyanobacterial strains are toxin producers, and only a few cells are necessary to induce irreparable damage to the environment. Therefore, water-body authorities and administrations require rapid and efficient early-warning systems providing reliable data to support their preventive or curative decisions. This manuscript reports an experimental protocol for the in-field detection of toxin-producing cyanobacterial strains by using an antibody microarray chip with 17 antibodies (Abs) with taxonomic resolution (CYANOCHIP). Here, a multiplex fluorescent sandwich microarray immunoassay (FSMI) for the simultaneous monitoring of 17 cyanobacterial strains frequently found blooming in freshwater ecosystems, some of them toxin producers, is described. A microarray with multiple identical replicates (up to 24) of the CYANOCHIP was printed onto a single microscope slide to simultaneously test a similar number of samples. Liquid samples can be tested either by direct incubation with the antibodies (Abs) or after cell concentration by filtration through a 1- to 3-&#956;m filter. Solid samples, such as sediments and ground rocks, are first homogenized and dispersed by a hand-held ultrasonicator in an incubation buffer. They are then filtered (5 - 20 &#956;m) to remove the coarse material, and the filtrate is incubated with Abs. Immunoreactions are revealed by a final incubation with a mixture of the 17 fluorescence-labeled Abs and are read by a portable fluorescence detector. The whole process takes around 3 h, most of it corresponding to two 1-h periods of incubation. The output is an image, where bright spots correspond to the positive detection of cyanobacterial markers.

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

The presence of cyanobacterial toxins in fresh water reservoirs for human consumption is a major concern for water management authorities. To evaluate the risk of water contamination, this article describes an protocol for the in-field detection of cyanobacterial strains in liquid and solid samples by using an antibody microarray chip.

Experimentelles Protokoll zum Nachweis<em&gt; Cyanobakterien</em&gt; In flüssigen und festen Proben mit einem Antikörper Microarray-Chip

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has ...

Forschung

Umwelt

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of live neurons with a specific primary antibody raised against an extracellular portion of the protein. Given that receptors are trafficked to and from the surface, if cells are permeabilized after fixation then both cell-surface and internal protein will be detected by the same labeled secondary antibody. Here, we adapted a method used to study protein trafficking (&#8220;antibody feeding&#8221;) to differentially label protein that had been internalized by endocytosis during the antibody incubation step and protein that either remained on the cell surface or was trafficked to the surface during this period. The ability to distinguish these two pools of protein was made possible through the incorporation of an overnight blocking step with highly-concentrated unlabeled secondary antibody after an initial incubation of unpermeabilized neurons with a fluorescently-labeled secondary antibody. After the blocking step, permeabilization of the neurons allowed detection of the internalized pool with a fluorescent secondary antibody labeled with a different fluorophore. Using this technique we were able to obtain important information about the subcellular location of this putative receptor, revealing that it was, indeed, trafficked to the cell-surface in neurons. This technique is broadly applicable to a range of cell types and cell-surface proteins, providing a suitable antibody to an extracellular epitope is available.

We describe a method to label protein on the surface of living neurons using a specific polyclonal antibody to extracellular epitopes. Protein bound by the antibody on the cell surface and subsequently internalized via endocytosis can be distinguished from protein remaining on, or trafficked to, the surface during the incubation.

Differential Markierung von Zelloberflächen und internalisierten Proteine ​​Antikörper nach Fütterung der Live-kultivierten Neuronen

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Neurowissenschaften

Magnetic Tweezers in a Microplate Format

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these approaches are limited single-molecule methods, which restricts their availability. To address this need, a microplate assay was developed that enables mechanical manipulation while performing standard biochemical assays. This is achieved using magnets incorporated into a microplate lid to create multiple magnetic tweezers. In this format, force is exerted across biomolecules connected to paramagnetic beads, equivalent to a typical magnetic tweezer. The study demonstrates the application of this tool with FRET-based assays to monitor protein conformations. However, this approach is widely applicable to different biological systems ranging from measuring enzymatic activity through to the activation of signaling pathways in live cells.

Here, we describe the use of a novel microplate assay to enable mechanical manipulation of biomolecules while performing ensemble biochemical assays. This is achieved using a microplate lid modified with magnets to create multiple static magnetic tweezers across the microplate.

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these ...

Biochemie

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR-Clip - Ein Verfahren zur Transkriptom-weiten die Bindungsstellen des RNA-bindende Proteine ​​Identifizieren

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Biologie

Characterization of Neuronal Lysosome Interactome with Proximity Labeling Proteomics

Lysosomes frequently communicate with a variety of biomolecules to achieve the degradation and other diverse cellular functions. Lysosomes are critical to human brain function, as neurons are postmitotic and rely heavily on the autophagy-lysosome pathway to maintain cellular homeostasis. Despite advancements in the understanding of various lysosomal functions, capturing the highly dynamic communications between lysosomes and other cellular components is technically challenging, particularly in a high-throughput fashion. Here, a detailed protocol is provided for the recently published endogenous (knock-in) lysosome proximity labeling proteomic method in human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived neurons. 
Both lysosomal membrane proteins and proteins surrounding lysosomes within a 10-20 nm radius can be confidently identified and accurately quantified in live human neurons. Each step of the protocol is described in detail, i.e., hiPSC-neuron culture, proximity labeling, neuron harvest, fluorescence microscopy, biotinylated protein enrichment, protein digestion, LC-MS analysis, and data analysis. In summary, this unique endogenous lysosomal proximity labeling proteomics method provides a high-throughput and robust analytical tool to study the highly dynamic lysosomal activities in live human neurons.

A neuronal lysosome proximity labeling proteomics protocol is described here to characterize the dynamic lysosomal microenvironment in human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Lysosomal membrane proteins and proteins that interact with lysosomes (stably or transiently) can be accurately quantified in this method with excellent intracellular spatial resolution in live human neurons.

Charakterisierung des neuronalen Lysosomen-Interaktoms mit Proximity-Markierungsproteomik

Lysosomes frequently communicate with a variety of biomolecules to achieve the degradation and other diverse cellular functions. Lysosomes are critical to ...

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in cell biology. Many phenomena cannot be explained by in vitro analysis in simplified systems and need additional structural information in situ, particularly in the range between 1 nm and 0.1 &#181;m, in order to be fully understood. Here, electron spectroscopic imaging, a transmission electron microscopy technique that allows simultaneous mapping of the distribution of proteins and nucleic acids, and an expression tag, miniSOG, are combined to study the structure and organization of DNA double-strand break repair foci.

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Visualisierung von miniSOG Tagged DNA Reparaturproteine ​​in Kombination mit Electron spektroskopischen Bildgebung (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A deeper understanding of the changes in gene expression that occur during repopulation could help identify therapeutic targets to promote the restoration of liver function in the setting of injuries. Nonetheless, methods to isolate specifically the repopulating hepatocytes are inhibited by a lack of cell markers, limited cell numbers, and the fragility of these cells. The development of translating ribosome affinity purification (TRAP) technology in conjunction with the Fah-/- mouse model to recapitulate repopulation in the setting of liver injury allows gene expression profiling of the repopulating hepatocytes. With TRAP, cell type-specific translating mRNA is rapidly and efficiently isolated. We developed a method that utilizes TRAP with affinity-based isolation of translating mRNA from hepatocytes that selectively express the green fluorescent protein (GFP)-tagged ribosomal protein (RP), GFP:RPL10A. TRAP circumvents the long time period required for fluorescence-activated cell sorting that could change the gene expression profile. Furthermore, since only the repopulating hepatocytes express the GFP:RPL10A fusion protein, the isolated mRNA is devoid of contamination from the surrounding injured hepatocytes and other cell types in the liver. The affinity-purified mRNA is of high quality and allows downstream PCR- or high-throughput sequencing-based analysis of gene expression.

Translating ribosome affinity purification (TRAP) enables rapid and efficient isolation of cell type-specific translating mRNA. Here, we demonstrate a method that combines hydrodynamic tail-vein injection in a mouse model of liver repopulation and TRAP to examine the expression profile of repopulating hepatocytes.

Zelltypspezifische Gene Expression Profiling in der Mausleber

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's disease (PD), Huntington's disease (HD), and so on. To detect and analyze soluble or diffuse protein oligomers or aggregates, fluorescence correlation spectroscopy (FCS), which can detect the diffusion speed and brightness of a single particle with a single molecule sensitivity, has been used. However, the proper procedure and know-how for protein aggregation detection have not been widely shared. Here, we show a standard procedure of FCS measurement for diffusion properties of aggregation-prone proteins in cell lysate and live cells: ALS-associated 25 kDa carboxyl-terminal fragment of TAR DNA/RNA-binding protein 43 kDa (TDP25) and superoxide dismutase 1 (SOD1). The representative results show that a part of aggregates of green fluorescent protein (GFP)-tagged TDP25 was slightly included in the soluble fraction of murine neuroblastoma Neuro2a cell lysate. Moreover, GFP-tagged SOD1 carrying ALS-associated mutation shows a slower diffusion in live cells. Accordingly, we here introduce the procedure to detect the protein aggregation via its diffusion property using FCS.

We here introduce a procedure to measure protein oligomers and aggregation in cell lysate and live cells using fluorescence correlation spectroscopy.

Nachweis der Proteinaggregation mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...

An Immunolabeling Technique to Visualize the Subcellular Localization of Proteins

Source: Aishwarya, R., et al. <a href="https://app.jove.com/v/64085">Visualizing Subcellular Localization of a Protein in the Heart Using Quantum Dots-Mediated Immuno-Labeling Followed by Transmission Electron Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (2022).
This video demonstrates a technique for the immunolabeling of sigma-1 receptors in a murine heart tissue section using quantum dots. The heart tissue is fixed, osmicated, stained, dehydrated, embedded in resin, and then sectioned. The sections are then treated with antibodies and labeled with quantum dots to demarcate the subcellular localization of Sigma-1 receptors using electron microscopy.

Eine Immunmarkierungstechnik zur Visualisierung der subzellulären Lokalisierung von Proteinen

1. Animal preparation

	Anesthetize the mice using 3% isoflurane. Open the chest by making a horizontal incision in the region above the middle abdomen ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Antibody-Based Technologies

Antibody-Based Imaging and Detection Methods

A Technique to Detect Cyanobacterial Strains Using an Antibody Microarray Chip

Source: Blanco, Y. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54994">Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates a method to detect the Cyanobacterial strains in an environmental sample using an antibody microarray chip. Samples carrying various bacteria interact with printed antibodies, and immunostaining with fluorophore-labeled anti-cyanobacterial-strain antibodies reveals the presence of specific cyanobacterial strains through fluorescence in distinct spots.

Antikörpermarkierung mit Fluoreszenzfarbstoffen unter Verwendung von magnetischen Protein A und Protein G-Kügelchen

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Experimentelles Protokoll zum Nachweis

Differential Markierung von Zelloberflächen und internalisierten Proteine Antikörper nach Fütterung der Live-kultivierten Neuronen

Magnetic Tweezers in a Microplate Format

PAR-Clip - Ein Verfahren zur Transkriptom-weiten die Bindungsstellen des RNA-bindende Proteine Identifizieren

Charakterisierung des neuronalen Lysosomen-Interaktoms mit Proximity-Markierungsproteomik

Visualisierung von miniSOG Tagged DNA Reparaturproteine in Kombination mit Electron spektroskopischen Bildgebung (ESI)

Zelltypspezifische Gene Expression Profiling in der Mausleber

Nachweis der Proteinaggregation mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie

Eine Immunmarkierungstechnik zur Visualisierung der subzellulären Lokalisierung von Proteinen

Eine Technik zum Nachweis cyanobakterieller Stämme mit Hilfe eines Antikörper-Microarray-Chips

Antikörpermarkierung mit Fluoreszenzfarbstoffen unter Verwendung von magnetischen Protein A und Protein G-Kügelchen

Zusammenfassung

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Experimentelles Protokoll zum Nachweis

Differential Markierung von Zelloberflächen und internalisierten Proteine ​​Antikörper nach Fütterung der Live-kultivierten Neuronen

Magnetic Tweezers in a Microplate Format

PAR-Clip - Ein Verfahren zur Transkriptom-weiten die Bindungsstellen des RNA-bindende Proteine ​​Identifizieren

Charakterisierung des neuronalen Lysosomen-Interaktoms mit Proximity-Markierungsproteomik

Visualisierung von miniSOG Tagged DNA Reparaturproteine ​​in Kombination mit Electron spektroskopischen Bildgebung (ESI)

Zelltypspezifische Gene Expression Profiling in der Mausleber

Nachweis der Proteinaggregation mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie

Eine Immunmarkierungstechnik zur Visualisierung der subzellulären Lokalisierung von Proteinen

Eine Technik zum Nachweis cyanobakterieller Stämme mit Hilfe eines Antikörper-Microarray-Chips

Differential Markierung von Zelloberflächen und internalisierten Proteine Antikörper nach Fütterung der Live-kultivierten Neuronen

PAR-Clip - Ein Verfahren zur Transkriptom-weiten die Bindungsstellen des RNA-bindende Proteine Identifizieren

Visualisierung von miniSOG Tagged DNA Reparaturproteine in Kombination mit Electron spektroskopischen Bildgebung (ESI)