This work was part of the PneuCarriage project, funded by the Bill and Melinda Gates Foundation with contribution by the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Program.

1. Herstellung der in-house Latexreagenzien <ol><li> Herstellung von Glycin-gepufferter Kochsalzlösung (GBS) <ol><li> Fügen 1,5 g Glycin, 11,7 g Natriumchlorid und 100 ml destilliertem Wasser in einen 200-ml-Becherglas. </li><li> Mischen aufzulösen unter Verwendung eines Magnetrührers. </li><li> Übertragen Mischung in einen 500 ml Messzylinder geben und mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 200 ml zu machen. </li><li> Übertragen Sie die Lösung zurück in die 200-ml-Becher, den pH-Wert und passen auf 8,2 mit 5 M Natriumhydroxid. HINWEIS: Natriumhydroxid ist ätzend, persönliche Schutzausrüstung tragen. </li><li> Filter sterilisiert die Lösung unter Verwendung von 0,22 um Filter und mehrere 60 ml-Spritzen in einen 250 ml preautoclaved Schraube verschlossenen Glasflasche. </li><li> Speichern bei RT. </li></ol></li><li> Herstellung von GBS mit 0,2% Rinderserumalbumin <ol><li> Mit 0,2 g Rinderserumalbumin (BSA)-Pulver und 100 ml GBS zu einem 200 ml Becherglas und Mischen zur Auflösung unter Verwendung eines Magnetrührers. </li><li> FilterSterilisieren der Lösung durch 0,22 um-Filter mit mehreren 60 ml-Spritzen in einen 250 ml preautoclaved Schraube verschlossenen Glasflasche. </li><li> Lagerung bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Latex-Reagenz Vorbereitung <ol><li> Beschriften Sie eine 2 ml-Rundmikrozentrifugenröhrchen. HINWEIS: Rundbodenröhrchen werden verwendet, um das Absetzen der Teilchen, die Antikörper Anlage beeinflussen können, zu minimieren. </li><li> Mit Hilfe eines P1000 Pipette mit steriler Tipps hinzufügen 975 ul von GBS in den Mikrozentrifugenröhrchen, dann fügen Sie 25 ul geeigneter Pneumokokken-Antiserum für die Latex-Reagenz vorbereitet (dh, Pool, Gruppe, Typ oder Faktor). Kehren Sie fünf Mal, um zu mischen. </li><li> Verdünnte Polystyrollatex-Teilchen 1:10 Zugabe von 120 ul Latex-Teilchen zu 1.080 ul steriler physiologischer Kochsalzlösung. Hinweis: Dies kann in größeren Mengen hergestellt werden, sollte aber jedes Mal frisch die Latex-Reagenzien hergestellt werden, hergestellt werden. </li><li> Hinzufügen 1.000 ul der 01.10 Latex-Suspension (in Schritt 1.3.3 vorbereitet) an die 1,000 ul 01.40 Antiserum Suspension (in Schritt 1.3.2) hergestellt. Kehren Sie fünf Mal, um zu mischen. </li><li> Bei 37 ° C auf einem langsam drehenden Rad (zB 4 rpm für ein Rad von 38,5 cm Durchmesser) für 2 h. </li><li> Zentrifuge für 15 min bei 1.100 x g. Überstand verwerfen und sanft das Pellet in 2 ml steriler Kochsalzlösung. </li><li> Zentrifuge für 15 min bei 1.100 x g. Überstand verwerfen und 1 ml GBS und sanft das Pellet. </li><li> Pipettieren der Latex-Suspension in einem markierten 5 ml Schraubdeckel-Röhrchen. Fügen Sie eine weitere 1 ml GBS. </li><li> 2 ml GBS, die 0,2% BSA (w / v) (pH 8,2) (im Schritt 1.2) hergestellt. Dann werden 40 ul 10% (w / v) Lösung von Natriumazid als Konservierungsmittel. HINWEIS: Natriumazid ist gefährlich, wenn eingeatmet, und ist ein Haut-und Augenreizstoff. Es ist wünschenswert, eine vorbereitete Lösung von 10% nicht zu kaufen, als die Pulverform, da die Inhalationsexposition minimiert. Persönliche Schutzausrüstung (einschließlich Handschuhen einesd Brille) sollten beim Umgang mit diesem Reagenz getragen werden. Weitere Informationen sind dem Sicherheitsdatenblatt für Details. </li><li> Speicher Latex-Reagenzien bei 4 ° C ist. </li></ol></li><li> Vorbereitung der Negativkontrolle Latexreagenz <ol><li> Beschriften Sie eine 2 ml-Rundmikrozentrifugenröhrchen. HINWEIS: Rundbodenröhrchen werden verwendet, um das Absetzen der Teilchen, die Antikörper Anlage beeinflussen können, zu minimieren. </li><li> Mit Hilfe eines P1000 Pipette mit steriler Tipps hinzufügen 975 ul von GBS in den Mikrozentrifugenröhrchen, dann fügen Sie 25 ul normalen Kaninchen-Antiserum. Kehren Sie fünf Mal, um zu mischen. </li><li> Gehen Sie wie in den Schritten 1.3.3 bis 1.3.10 oben </li></ol></li></ol> 2. Qualitätskontrolle (QC) von Latex Reagenzien <ol><li> Bringen Latex-Reagenz auf RT. Unmittelbar vor der Verwendung vorsichtig mischen die Latex-Reagenz durch Umdrehen des Röhrchens mehrmals. </li><li> Überprüfen Reagenz für Autoagglutination durch Pipettieren von 15 ul auf einen Glasobjektträger und gehen Sie wie in den Schritten 4.7 und 4.8 unten. Es sollte keine sein eingglutination der Latexteilchen. Das Reagenz sollte erscheinen weiß und glatt. </li><li> Testen Sie das Reagenz gegen eine Reihe von niedrigen Durchgang Pneumokokken-Isolate. Verwenden Sie frisch gewachsenen Kulturen hergestellt, wie in Schritt 3 Das Panel der Isolate sollte Isolate der &quot;Ziel&quot;-Serotyp (der serotypspezifische für das Reagenz getestet) und &quot;Nicht-Ziel&quot;-Serotypen (Isolate von anderen Serotypen, die normalerweise nicht überschreiten sollte auch reagiert mit dem Reagenz). Mindestens ein Isolat von jeder Ziel und Nichtziel-Serotyp für jeden Latex-Reagenz unterzogen QC. Wenn es nur ein Ziel oder Nicht-Ziel-Serotyp Test zwei verschiedene Isolate des speziellen Serotyp. HINWEIS: Die Testplatte sollte mehrere Isolate von jedem Serotyp, von denen einige selten in invasive Erkrankungen und / oder Art Kultursammlungen sind, umfassen. Es ist bevorzugt, umfassen einige Wagen trennt, da sie oft anspruchsvollen Serotyp (Daten nicht gezeigt), wodurch eine weitere Testung des of der Reagenzien und sicherzustellen, dass die Reagenzien wahrscheinlich in der Lage, sowohl invasive Serotypisierung und Wagen isoliert sind. </li><li> Fahren Sie mit dem Testen von Latex-Reagenzien mit Ziel und Nicht-Ziel-Pneumokokken-Isolate nach dem in Schritt 3 und 4 unten beschriebenen Verfahren. </li><li> Qualitätskontrolle Reagenzien bei der Produktion und dann danach mindestens einmal jährlich. HINWEIS: Wenn ein Reagens nicht passieren, QC, muss der Ansatz verworfen und eine neue Vorbereitung gemacht. Im Falle von Wiederholungs QC Ausfall empfehlen wir die Reagenzien mit den in Ortika et al., 2013 8 und in der folgenden Diskussion beschrieben alternativen Verfahren hergestellt werden. </li></ol> 3. Vorbereitung der Pneumokokken-Kulturen für die Serotypisierung <ol><li> Mit einer sterilen Schleife wählen Sie eine Einzelkolonie des Pneumokokken- isolieren und streifen dieses heraus auf eine feste nichtselektiven Blut-Agar, so dass die primäre Inokulum umfasst etwa ein Drittel der Plattenoberfläche. Streak für einzelne Kolonien. HINWEIS: Die Teller aus defibriniertes Pferdeblut hergestellt oder Schafe sind geeignet; aber Blut-Platten mit menschlichem Blut oder Citrat-Tierblut hergestellt sind es nicht. </li><li> Inkubieren Platte O / N bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 5% CO 2. </li><li> Beachten Sie, das Wachstum auf der Platte für Reinheit und beurteilen, dass es ein ausreichendes Wachstum für die Serotypisierung. HINWEIS: Eine Reinkultur des Pneumokokken-Isolat wird für die Serotypisierung erforderlich. Nach unserer Erfahrung konfluent, oder in der Nähe von konfluenten Wachstum rund ein Drittel der Plattenoberfläche ist in der Regel ausreichend, um die Serotypisierung abzuschließen. Wie Pneumokokken-Kulturen können anfällig für Autolyse sein, sollten die Kulturen für die Serotypisierung vorbereitet innerhalb von 24 Stunden von Subkultur getestet werden. Der Kulturplatte Nehmen Sie nicht aus dem Inkubator mehr als 15 bis 20 Minuten, bevor die Serotypisierung beginnt. </li></ol> 4. Durchführung Latexagglutination Serotypisierung <ol><li> Entfernen Sie alle Latex-Reagenzien aus dem Kühlschrank und lassen Sie sie für ca. RTrungsweise 30 min. Unmittelbar vor Gebrauch vorsichtig umdrehen die Rohre, um die Reagenzien zu mischen. </li><li> Beschriften Sie eine Mikroskop-Objektträger. </li><li> Zeigen 15 ul Negativkontrolle Latex-Reagenz auf den Objektträger. </li><li> Mit einer sterilen Einweg-1 ul-Schleife einen Schwung des Pneumokokken-Kultur, so dass die Schleife ist etwa halb voll. </li><li> Schmieren Sie vorsichtig das Inokulum auf die Oberfläche der Folie in der Nähe der Tropfen Negativkontrolle Latex-Reagenz. Das Inokulum ist auf dem Glasträger sichtbar. </li><li> Schnell und gründlich mischen den Impfstoff in die Negativkontrolle Latex-Reagenz mit der Schleife. Stellen Sie sicher, dass der Rückgang nicht weiter zu verbreiten als die Anfangsgröße. </li><li> Nehmen Sie den Schieber, halten sie an beiden Enden. Rock the slide und zurück für 1 min. Achten Sie darauf, um die Flüssigkeit in Bewegung zu halten langsam, und sicherzustellen, dass die Größe der Tropfen nicht zu. HINWEIS: Alternativ können Sie eine Platte Rocker. </li><li> Beachten makroskopischen Agglutination (dh durchbloßem Auge) und das Clearing der Suspension gegen einen schwarzen Hintergrund. </li><li> Wenn die negative Kontrolle Latex-Reagenz zeigt keine Agglutination oder Clearing weiterhin die Prüfung der Kultur, Austausch der Test Latex-Reagenzien für die Negativkontrolle Latex-Reagenz in Schritten von 4,1 bis 4,8 oben. Eine frische Schleife muss jedes Mal verwendet werden. Fahren Sie mit dem Testen der Latex-Reagenzien, beginnend mit den Pools. </li><li> Testen Sie jede der &quot;Pool&quot; Latex-Reagenzien in Folge, bis ein positiver Test erhalten wird. HINWEIS:. Die Reihenfolge der Prüfung der Pools kann in &quot;Runden&quot; durchgeführt werden, um die lokale Auftreten von bestimmten Serotypen (zB durch die Prüfung für die drei am ehesten Pools auf der ersten Folie zu reflektieren Wenn eine positive Reaktion nicht erhalten wird, dann testen die nächsten drei wahrscheinlichsten der verbleibenden Pools auf dem zweiten Schlitten und so weiter, bis eine positive Reaktion erhalten wird). Dies stellt sicher, dass die häufigsten Serotypen zuerst getestet, minimiert die Zeit und die benötigten Reagenzien. </li><li>Mit den Antiseren Herstellerschlüssel bestimmen, welche einzelnen Antiseren in der positiven Pool vertreten sind. </li><li> Testen Sie jede der in der positiven Pool enthalten individuell an die &quot;Gruppe&quot; oder &quot;Typ&quot; bestimmen Gruppen oder Typen wie in den Schritten 4,1 bis 4,8 oben. </li><li> Bestimmen Sie das Ergebnis anhand der Antiseren Herstellers Taste. Wenn ein &quot;Typ&quot; bestimmt (zB Serotyp 5), so ist keine weitere Prüfung erforderlich ist und dieses Ergebnis wird aufgezeichnet. </li><li> Wenn eine &quot;Gruppe&quot; bestimmt (zB Gruppe 19), dann finden Sie in der wichtigsten Hersteller, um die Faktoren zu bestimmen, getestet werden. Weiterhin Tests mit den einzelnen &#39;Faktor&#39; Latex-Reagenzien und bestimmen die endgültige Serotyp (zB Serotyp 19B). </li></ol>

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	<li>Rudan, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+etiology+of+childhood+pneumonia+in+2010:+estimates+of+incidence,+severe+morbidity,+mortality,+underlying+risk+factors+and+causative+pathogens+for+192+countries.">Epidemiology and etiology of childhood pneumonia in 2010: estimates of incidence, severe morbidity, mortality, underlying risk factors and causative pathogens for 192 countries.</a> J Glob Health. 3 (10401), (2013).</li><li>O'Brien, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+disease+caused+by+Streptococcus+pneumoniae+in+children+younger+than+5+years:+global+estimates.">Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates.</a> Lancet. 374, 893-902 (2009).</li><li>Henrichsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six+newly+recognized+types+of+Streptococcus+pneumoniae.">Six newly recognized types of Streptococcus pneumoniae.</a> J Clin Microbiol. 33, 2759-2762 (1995).</li><li>Hausdorff, W. P., Bryant, J., Paradiso, P. R., Siber, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Which+pneumococcal+serogroups+cause+the+most+invasive+disease:+implications+for+conjugate+vaccine+formulation+and+use,+part+I.">Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I.</a> Clin Infect Dis. 30, 100-121 (2000).</li><li>Mulholland, K., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+replacement+after+pneumococcal+vaccination.">Serotype replacement after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 379, 1388-1389 (2012).</li><li>Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+replacement+in+disease+after+pneumococcal+vaccination.">Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 378, 1962-1973 (2011).</li><li>Satzke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+method+for+detecting+upper+respiratory+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae:+Updated+recommendations+from+the+World+Health+Organization+Pneumococcal+Carriage+Working+Group.">Standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae: Updated recommendations from the World Health Organization Pneumococcal Carriage Working Group.</a> Vaccine. , (2013).</li><li>Ortika, B. D., Habib, M., Dunne, E. M., Porter, B. D., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+latex+agglutination+reagents+for+pneumococcal+serotyping.">Production of latex agglutination reagents for pneumococcal serotyping.</a> BMC Res Notes. 6 (49), (2013).</li><li>Adegbola, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+and+antimicrobial+susceptibility+patterns+of+isolates+of+Streptococcus+pneumoniae+causing+invasive+disease+in+The+Gambia+1996-2003.">Serotype and antimicrobial susceptibility patterns of isolates of Streptococcus pneumoniae causing invasive disease in The Gambia 1996-2003.</a> Trop Med Int Health. 11, 1128-1135 (2006).</li><li>Slotved, H. C., Kaltoft, M., Skovsted, I. C., Kerrn, M. B., Espersen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple,+rapid+latex+agglutination+test+for+serotyping+of+pneumococci+(Pneumotest-Latex).">Simple, rapid latex agglutination test for serotyping of pneumococci (Pneumotest-Latex).</a> J Clin Microbiol. 42, 2518-2522 (2004).</li><li>Turner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+detection+of+nasopharyngeal+cocolonization+by+multiple+pneumococcal+serotypes+by+use+of+latex+agglutination+or+molecular+serotyping+by+microarray.">Improved detection of nasopharyngeal cocolonization by multiple pneumococcal serotypes by use of latex agglutination or molecular serotyping by microarray.</a> J Clin Microbiol. 49, 1784-1789 (2011).</li><li>Mudany, M. A., Kikuchi, K., Totsuka, K., Uchiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+new+serotyping+kit+for+Streptococcus+pneumoniae.">Evaluation of a new serotyping kit for Streptococcus pneumoniae.</a> J Med Microbiol. 52, 975-980 (2003).</li><li>Lalitha, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotyping+of+Streptococcus+pneumoniae+by+agglutination+assays:+a+cost-effective+technique+for+developing+countries.">Serotyping of Streptococcus pneumoniae by agglutination assays: a cost-effective technique for developing countries.</a> Bull World Health Organ. 74, 387-390 (1996).</li><li>Shutt, C. K., Samore, M., Carroll, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+Denka+Seiken+slide+agglutination+method+to+the+quellung+test+for+serogrouping+of+Streptococcus+pneumoniae+isolates.">Comparison of the Denka Seiken slide agglutination method to the quellung test for serogrouping of Streptococcus pneumoniae isolates.</a> J Clin Microbiol. 42, 1274-1276 (2004).</li><li>Gella, F., Serra, J., Gener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latex+agglutination+procedures+in+immunodiagnosis.">Latex agglutination procedures in immunodiagnosis.</a> Pure Appl Chem. 63, 1131-1134 (1991).</li><li>Habib, M., Porter, B. D., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsular+serotyping+of+Streptococcus+pneumoniae+using+the+Quellung+reaction.">Capsular serotyping of Streptococcus pneumoniae using the Quellung reaction.</a> J. Vis. Exp. (84), (2014).</li><li>Arai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+antiserum-coated+latex+particles+for+serotyping+Streptococcus+pneumoniae.">Use of antiserum-coated latex particles for serotyping Streptococcus pneumoniae.</a> Microbiol Immunol. 45, 159-162 (2001).</li><li>Lafong, A. C., Crothers, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+latex+agglutination+method+for+typing+pneumococci.">Simple latex agglutination method for typing pneumococci.</a> J Clin Pathol. 41, 230-231 (1988).</li><li>Ortega-Vinuesa, J. L., Bastos-Gonzalez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+factors+affecting+the+performances+of+latex+agglutination+tests.">A review of factors affecting the performances of latex agglutination tests.</a> J Biomater Sci Polym Ed. 12, 379-408 (2001).</li><li>Yap, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+slide+latex+agglutination+test+for+rotavirus+antigen+detection.">Development of a slide latex agglutination test for rotavirus antigen detection.</a> Malays J Pathol. 16, 49-56 (1994).</li><li>Severin, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latex+agglutination+in+the+diagnosis+of+meningococcal+meningitis.">Latex agglutination in the diagnosis of meningococcal meningitis.</a> J Clin Pathol. 25, 1079-1082 (1972).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Latexagglutination ist eine einfache, schnelle und kostengünstige Methode zur Pneumokokken-Serotyp. Handels Pneumokokken Latexagglutination Reagenzien sind verfügbar, aber sie derzeit nicht zu differenzieren alle bekannten Serotypen 10,12. Allerdings Latexagglutination Reagenzien können leicht in-house mit gekauft Antiseren gegen spezifische Antigene Pneumokokken-Kapsel angehoben hergestellt werden. In dem hier beschriebenen Verfahren werden Antikörper passiv an Latexteilchen gebunden, um einen Satz von Latex-Agglutinations-Reagenzien zu machen. Eine positive Reaktion tritt auf, wenn Latex-spezifische Antikörper an die Latexpartikel gebunden zu befestigen, um Antigene auf den Polysaccharid-Kapsel der Pneumokokken isolieren 18,19. Die Latex-Teilchen an die Antikörper gebunden erlauben die spezifische Antikörper-Antigen-Reaktion ohne Vergrößerung sichtbar gemacht werden. Latexagglutination ist eine geeignete Methode für die Hochdurchsatzlabor eind auch für ressourcenarmen Umfeld. Hauptvorteile des Verfahrens sind Latex-Agglutination, dass keine Spezialausrüstung erforderlich ist, um den Test durchzuführen, wurden die Reagenzien eine Haltbarkeit von mindestens 2 Jahren bei 4 ° C 8 gespeichert, und daß es kostengünstig, einfach und schnell durchführen soll. Serotypisierung eine Pneumokokken-Isolat von Latex-Agglutination dauert etwa 10 min und bis zu vier Latexreagenzien können parallel auf einer Folie getestet werden. Außerdem, wenn die Häufigkeit der Serotypen für die entsprechende Einstellung epidemiologischen bekannten Tests können in Runden beginnend mit den Pools, die die meisten gemeinsamen Serotypen ähnlich der Quellung Test 17 ​​durchgeführt werden. Dieser Ansatz minimiert die Anzahl von Tests erforderlich, um den Serotyp bestimmen. Das Verfahren ist auch sehr gut reproduzierbar zwischen verschiedenen Betreibern (Daten nicht gezeigt). Ein Nachteil der Latex-Agglutination Serotypisierung ist, dass die Herstellung der Reagenzien ist zeitaufwendig, wobei ca. 4 h; obwohl mehrere reagents leicht parallel hergestellt werden. Darüber hinaus sind einige Antigene über verschiedene Pneumokokken-Serotypen gemeinsamen, was in Kreuzreaktionen mit einigen Antiseren (zB Serotyp 29, 42 und Gruppe 35). Allerdings sind diese Kreuzreaktionen gut charakterisiert, wenn mit kommerziellen Antisera (die in der Regel präabsorbiert ist es, die problematischer kreuzreagierenden Antikörper zu entfernen) und zusätzliche Reaktions Tabellen werden durch den Hersteller, um zu unterscheiden, welche Serotyp vorhanden ist. Latex-Reagenzien können auch überqueren reagieren, wenn die Antikörper nicht richtig auf der Latexpartikel ausgerichtet; diese werden als QC Defekt erkannt. Nach unserer Erfahrung ist streng QC für den Erfolg dieser Methode, auch wenn im Handel erhältlichen Antiseren werden für die Produktion verwendet. QC dauert etwa 15 min pro Reagenz und beruht auf einem Satz von geeigneten QC-Isolate wie oben beschrieben. Die hier beschriebene Methode führt zu Reagenzien, die eine positive Reaktion gut wi gebendünn die Testphase. Nach unserer Erfahrung sind False Positives in der Praxis selten (Daten nicht gezeigt). Gelegentlich falsch negative Reaktionen werden beobachtet; in der Regel handelt es sich dabei um bekannte Probleme mit einem bestimmten Antiserum (zB kann der Serogruppe 6 Isolate nicht mit Pool B-Antiserum reagieren) oder Down-Regulation der Expression durch die Kapsel-Isolat. Verwendung der Serotypisierung algrorithm des Herstellers ist auch wichtig, da in den meisten Fällen eine falsche positive oder negative Reaktion auf einen &quot;blinden Ende&quot; Ergebnis führen. In diesen Fällen und wenn die Reaktionen sind schwer zu interpretieren, empfehlen wir wiederholen-Prüfung und / oder Prüfung durch eine alternative Methode, wie die Quellung Reaktion. Einige Fehlersuche wird gelegentlich benötigt, um zufrieden stellende Latex-Reagenzien zu machen. In dem hier beschriebenen Verfahren wird der Antikörper an Latexteilchen durch passive Adsorption 15,19 befestigt, so dass eine kritische Variable ist die Konzentration des Antikörpers verwendet, der bestimmt, wie gutdie Oberfläche der Latexpartikel bedeckt und die anschließende Ausrichtung der Antikörper aktiven Stellen 15,20. Folglich wird, wenn unzureichende oder überschüssige Antikörper an Latexteilchen gebunden, die Antikörper-Antigen-Reaktionen nicht optimal, und unbefriedigende Reagenzien hergestellt 15,20,21 werden. Als Antikörpertiter variieren zwischen verschiedenen Chargen von Antiseren, kann ein Standard-Set von Verdünnungen Reagenzien, die gut 8 durchführen nicht produzieren. Ein guter Ausgangspunkt ist, um eine Verdünnung von 1:40 von Antiserum zu verwenden, und wenn dies nicht erfolgreich ist, verdünnen das Antiserum weiter. Nach unserer Erfahrung in der Regel löst das Problem 8. In einer kleinen Anzahl von Fällen können Reagenzien schwache Agglutination, die nicht von Clearing der Suspension begleitet wird, wenn getestet mit Ziel isoliert zu zeigen. In diesen Fällen wird die Antiserum verdünnt nicht die Qualität des Reagens verbessern, aber zufriedenstellende Reagenzien üblicherweise durch Auslassen der Zentrifugation hergestellt und Waschschritte 8,22 </sup&gt;. Antikörper beschichtet Latexpartikel werden häufig in der diagnostischen Mikrobiologie zur Erkennung, Identifizierung oder Serotypisierung von vielen verschiedenen Mikroben 15,20 eingesetzt. Als solches kann das hier beschriebene Verfahren eignet sich zur Herstellung Latex-Reagenzien für andere Zwecke, vorausgesetzt, dass geeignete Antiseren und ausreichend QC-Verfahren übernommen.

Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) ist eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität bei Kindern im Alter von unter fünf Jahren weltweit, vor allem in einem ressourcenarmen Umfeld 1,2. Pneumokokken-Erkrankungen reicht von lokalisierten Infektionen zu lebensbedrohlichen Erkrankungen wie Lungenentzündung, Sepsis und Meningitis 1,2. Mehr als 90 Serotypen von Pneumokokken wurden identifiziert, basierend auf Unterschieden in ihren Kapselpolysaccharid 3. Aktuelle Impfstoffe zielen auf den Kapsel-Polysaccharid und bieten Schutz vor den wichtigsten Serotypen invasive Erkrankungen verursachen 4. Serotypisierung Pneumokokken-Isolate ist wichtig für die Beurteilung der Auswirkungen der Impfung auf Wagen und Krankheit sowie die Bereitstellung umfassendere epidemiologische Informationen 5,6. Die aktuelle &quot;Goldstandard&quot;-Methode für Pneumokokken-Serotypisierung ist die Quellung Test, aber es ist zeitaufwendig und erfordert etwas Geschick, um perform 7. Latexagglutination ist eine Alternative Serotypisierung Verfahren von der Weltgesundheitsorganisation 7 empfohlen. Latexagglutination ist schnell und einfach durchzuführen, und wird weltweit in vielen Labors 8-11 eingesetzt. Wichtig ist, dass Latexagglutination vergleichbarer Genauigkeit auf die Quellung Test für Pneumokokken-Serotypisierung 10,12-14 gezeigt. Insgesamt ist diese Methode ideal für ressourcenarmen Umfeld sowie hohe Durchsatzlabors. Latex-Agglutinations-Reagenzien (&quot;Latex-Reagenzien &#39;) durch die Befestigung der Antikörper an Latexteilchen 15 angelegt. In einer positiven Reaktion agglutinieren diese markierten Teilchen in Gegenwart eines spezifischen Antigens. Kommerziellen Latex-Reagenzien sind für eine begrenzte Anzahl von Serotypen zur Verfügung. Latex-Reagenzien können auch in-house mit kommerziell erhältlichen Antiseren 10 hergestellt werden. Gemische von Antisera (&quot;Pools&quot;) sowie spezifische Antiseren gegen Pneumokokken-serogroups (zB Gruppe 19), einzelnen Serotypen (beispielsweise Serotyp 5) und an spezifische Antigene (&quot;Faktoren&quot;, zB., Faktor 19c erkennen Serotyp 19A) zum weiteren Definieren Serotypen innerhalb der Gruppen sind 16. Diese Handschrift beschreibt die Hauptschritte bei der Herstellung von Latexreagenzien mit passiven Befestigung von im Handel erhältlichen Antiseren gegen Latexpartikel. Die Qualitätskontrolle (QC) Aspekte dieses Verfahrens beschrieben, und ein Protokoll für die Verwendung von Latexreagenzien zur Serotypisierung Pneumokokken enthalten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1085">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:180px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:263px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:299px;">Microparticles based on polystyrene, 800 nm</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">65984-10 ml-F</td>
			<td style="width:263px;">Or other volumes as required</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:299px;">Normal rabbit serum</td>
			<td style="width:180px;">Antibodies Australia&#160;</td>
			<td style="width:127px;">NRS-1ml</td>
			<td style="width:263px;">Or other volumes as required, bring to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:299px;">Pneumococcus (Neufeld) antisera</td>
			<td style="width:180px;">SSI Diagnostica</td>
			<td style="width:127px;">Various</td>
			<td style="width:263px;">Bring to room temperature before use 
			<a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:299px;">Sterile Bovine Albumin&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">A-4503</td>
			<td style="width:263px;">Bring to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:299px;">Sodium azide 10% (v/v) solution&#160;</td>
			<td style="width:180px;">VWR International</td>
			<td style="width:127px;">ROAC3902/100ml</td>
			<td style="width:263px;">Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml</td>
			<td style="width:180px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:127px;">0030 120.094</td>
			<td style="width:263px;">Round bottom</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:180px;">Merck</td>
			<td style="width:127px;">10241.AP</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:299px;">Calibrated disposable inoculating loops 1 &#181;l</td>
			<td style="width:180px;">Copan</td>
			<td style="width:127px;">CD175SO1</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:299px;">Glass microscope slides 76 mm x 26 mm</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">LBS 2950RC</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:299px;">5 M NaOH</td>
			<td style="width:180px;">BDH</td>
			<td style="width:127px;">10252</td>
			<td style="width:263px;">Caution: highly corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Glycine</td>
			<td style="width:180px;">Merck</td>
			<td style="width:127px;">10119.05</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Horse Blood Agar (HBA) plates</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">PP2001</td>
			<td>Bring to room temperature before use 
			<a href="http://www.thermofisher.com.au/">http://www.thermofisher.com.au</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Rotating wheel</td>
			<td style="width:180px;">Wyble Engineering Development Corporation</td>
			<td style="width:127px;">Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:299px;">Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml</td>
			<td style="width:180px;">Technoplas</td>
			<td style="width:127px;">S5016SU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">60 ml syringes without needles</td>
			<td style="width:180px;">Terumo</td>
			<td style="width:127px;">SS-60L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Millex-GP syringe filter unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td style="width:180px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:127px;">SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Brochure on Neufeld antisera</td>
			<td style="width:180px;">Statens Serum Institut</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td>Key to determining serotypes 
			<a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Key to pneumococcal factor serum</td>
			<td style="width:180px;">Statens Serum Institut</td>
			<td align="right" style="width:127px;">18058</td>
			<td style="width:263px;">For determining serotype within Groups 
			<a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">*alternative sources are available for most materials</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capsular serotyping of streptococcus pneumoniae by latex agglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the &#8216;gold standard&#8217; Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective. 
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.

Eine positive Reaktion tritt auf, wenn Latex-Typ-spezifischen Antikörpers an die Latexpartikel gebunden bindet an die Kapsel des Pneumokokkus, und die Agglutination der Partikel erfolgt Antikörper markiert 15. 1A zeigt eine positive Reaktion, die durch Agglutination und Löschen des Hinter gekennzeichnet Aufhängung. Eine negative Reaktion wird durch die verbleibenden glatt und weiß (1B) Latex-Agglutinations-Reagens-Suspension ist. Die Reagenzien werden so optimiert, dass eine positive Reaktion vor Ende des einen min-Zeitintervall (in der Regel in ca. 20 sec nachweisbar) beobachtet werden. Wir empfehlen nicht, liest Reaktionen nach der 1 min Zeitintervall. Sehr selten, zeigen Reaktionen schwache Agglutination um den Rand des Tropfens, die nicht durch das Löschen des Hinter Suspension begleitet wird, oder erscheint &quot;faserig&quot; ohne Hintergrund Clearing (Daten nicht gezeigt). Dies sind die meisten wie<html> ly negative Reaktionen. In solchen Fällen empfehlen wir die Wiederholung der Prüfung und / oder eine weitere Untersuchung mit einem anderen Serotyp Verfahren (zum Beispiel der Quellung Reaktion 17). <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51747/51747fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Positive und negative Reaktionen Latexagglutination. Zubereitungen von der Pneumokokken-Isolat mit Latex Agglutinationsreagenz zeigt eine positive Reaktion (A) oder eine negative Reaktion (B) gemischt. Agglutination begleitet von Räumung der Hintergrund ist in der positiven Reaktion (A) gesehen .There keine sichtbare Agglutination mit der Negativkontrolle Latexreagenz oder in einem negativen Testreaktion (B). Fotos 8 mit Genehmigung verwendet.&quot;Target =&quot; _blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Latex-Agglutinations-Test ist eine einfache, schnelle und kostengünstige Methode zur Serotypisierung Streptococcus pneumoniae, und auch weit verbreitet in diagnostischen Mikrobiologie aufgebracht. Dieses Manuskript beschreibt die in-house Produktion von Latexagglutination Reagenzien, Qualitätskontrollverfahren und die Anwendung dieser Technik auf den Pneumokokken-Serotyp.

Kapsel Serotypisierung<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Durch Latexagglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

21.6K Aufrufe.  Murdoch Childrens Research Institute.  Latex-Agglutinations-Test ist eine einfache, schnelle und kostengünstige Methode zur Serotypisierung Streptococcus pneumoniae, und auch weit verbreitet in diagnostischen Mikrobiologie aufgebracht. Dieses Manuskript beschreibt die in-house Produktion von Latexagglutination Reagenzien, Qualitätskontrollverfahren und die Anwendung dieser Technik auf den Pneumokokken-Serotyp. 