This work was part of the PneuCarriage project, funded by the Bill and Melinda Gates Foundation with contribution by the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Program.

1. Herstellung der in-house Latexreagenzien <ol><li> Herstellung von Glycin-gepufferter Kochsalzlösung (GBS) <ol><li> Fügen 1,5 g Glycin, 11,7 g Natriumchlorid und 100 ml destilliertem Wasser in einen 200-ml-Becherglas. </li><li> Mischen aufzulösen unter Verwendung eines Magnetrührers. </li><li> Übertragen Mischung in einen 500 ml Messzylinder geben und mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 200 ml zu machen. </li><li> Übertragen Sie die Lösung zurück in die 200-ml-Becher, den pH-Wert und passen auf 8,2 mit 5 M Natriumhydroxid. HINWEIS: Natriumhydroxid ist ätzend, persönliche Schutzausrüstung tragen. </li><li> Filter sterilisiert die Lösung unter Verwendung von 0,22 um Filter und mehrere 60 ml-Spritzen in einen 250 ml preautoclaved Schraube verschlossenen Glasflasche. </li><li> Speichern bei RT. </li></ol></li><li> Herstellung von GBS mit 0,2% Rinderserumalbumin <ol><li> Mit 0,2 g Rinderserumalbumin (BSA)-Pulver und 100 ml GBS zu einem 200 ml Becherglas und Mischen zur Auflösung unter Verwendung eines Magnetrührers. </li><li> FilterSterilisieren der Lösung durch 0,22 um-Filter mit mehreren 60 ml-Spritzen in einen 250 ml preautoclaved Schraube verschlossenen Glasflasche. </li><li> Lagerung bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Latex-Reagenz Vorbereitung <ol><li> Beschriften Sie eine 2 ml-Rundmikrozentrifugenröhrchen. HINWEIS: Rundbodenröhrchen werden verwendet, um das Absetzen der Teilchen, die Antikörper Anlage beeinflussen können, zu minimieren. </li><li> Mit Hilfe eines P1000 Pipette mit steriler Tipps hinzufügen 975 ul von GBS in den Mikrozentrifugenröhrchen, dann fügen Sie 25 ul geeigneter Pneumokokken-Antiserum für die Latex-Reagenz vorbereitet (dh, Pool, Gruppe, Typ oder Faktor). Kehren Sie fünf Mal, um zu mischen. </li><li> Verdünnte Polystyrollatex-Teilchen 1:10 Zugabe von 120 ul Latex-Teilchen zu 1.080 ul steriler physiologischer Kochsalzlösung. Hinweis: Dies kann in größeren Mengen hergestellt werden, sollte aber jedes Mal frisch die Latex-Reagenzien hergestellt werden, hergestellt werden. </li><li> Hinzufügen 1.000 ul der 01.10 Latex-Suspension (in Schritt 1.3.3 vorbereitet) an die 1,000 ul 01.40 Antiserum Suspension (in Schritt 1.3.2) hergestellt. Kehren Sie fünf Mal, um zu mischen. </li><li> Bei 37 ° C auf einem langsam drehenden Rad (zB 4 rpm für ein Rad von 38,5 cm Durchmesser) für 2 h. </li><li> Zentrifuge für 15 min bei 1.100 x g. Überstand verwerfen und sanft das Pellet in 2 ml steriler Kochsalzlösung. </li><li> Zentrifuge für 15 min bei 1.100 x g. Überstand verwerfen und 1 ml GBS und sanft das Pellet. </li><li> Pipettieren der Latex-Suspension in einem markierten 5 ml Schraubdeckel-Röhrchen. Fügen Sie eine weitere 1 ml GBS. </li><li> 2 ml GBS, die 0,2% BSA (w / v) (pH 8,2) (im Schritt 1.2) hergestellt. Dann werden 40 ul 10% (w / v) Lösung von Natriumazid als Konservierungsmittel. HINWEIS: Natriumazid ist gefährlich, wenn eingeatmet, und ist ein Haut-und Augenreizstoff. Es ist wünschenswert, eine vorbereitete Lösung von 10% nicht zu kaufen, als die Pulverform, da die Inhalationsexposition minimiert. Persönliche Schutzausrüstung (einschließlich Handschuhen einesd Brille) sollten beim Umgang mit diesem Reagenz getragen werden. Weitere Informationen sind dem Sicherheitsdatenblatt für Details. </li><li> Speicher Latex-Reagenzien bei 4 ° C ist. </li></ol></li><li> Vorbereitung der Negativkontrolle Latexreagenz <ol><li> Beschriften Sie eine 2 ml-Rundmikrozentrifugenröhrchen. HINWEIS: Rundbodenröhrchen werden verwendet, um das Absetzen der Teilchen, die Antikörper Anlage beeinflussen können, zu minimieren. </li><li> Mit Hilfe eines P1000 Pipette mit steriler Tipps hinzufügen 975 ul von GBS in den Mikrozentrifugenröhrchen, dann fügen Sie 25 ul normalen Kaninchen-Antiserum. Kehren Sie fünf Mal, um zu mischen. </li><li> Gehen Sie wie in den Schritten 1.3.3 bis 1.3.10 oben </li></ol></li></ol> 2. Qualitätskontrolle (QC) von Latex Reagenzien <ol><li> Bringen Latex-Reagenz auf RT. Unmittelbar vor der Verwendung vorsichtig mischen die Latex-Reagenz durch Umdrehen des Röhrchens mehrmals. </li><li> Überprüfen Reagenz für Autoagglutination durch Pipettieren von 15 ul auf einen Glasobjektträger und gehen Sie wie in den Schritten 4.7 und 4.8 unten. Es sollte keine sein eingglutination der Latexteilchen. Das Reagenz sollte erscheinen weiß und glatt. </li><li> Testen Sie das Reagenz gegen eine Reihe von niedrigen Durchgang Pneumokokken-Isolate. Verwenden Sie frisch gewachsenen Kulturen hergestellt, wie in Schritt 3 Das Panel der Isolate sollte Isolate der &quot;Ziel&quot;-Serotyp (der serotypspezifische für das Reagenz getestet) und &quot;Nicht-Ziel&quot;-Serotypen (Isolate von anderen Serotypen, die normalerweise nicht überschreiten sollte auch reagiert mit dem Reagenz). Mindestens ein Isolat von jeder Ziel und Nichtziel-Serotyp für jeden Latex-Reagenz unterzogen QC. Wenn es nur ein Ziel oder Nicht-Ziel-Serotyp Test zwei verschiedene Isolate des speziellen Serotyp. HINWEIS: Die Testplatte sollte mehrere Isolate von jedem Serotyp, von denen einige selten in invasive Erkrankungen und / oder Art Kultursammlungen sind, umfassen. Es ist bevorzugt, umfassen einige Wagen trennt, da sie oft anspruchsvollen Serotyp (Daten nicht gezeigt), wodurch eine weitere Testung des of der Reagenzien und sicherzustellen, dass die Reagenzien wahrscheinlich in der Lage, sowohl invasive Serotypisierung und Wagen isoliert sind. </li><li> Fahren Sie mit dem Testen von Latex-Reagenzien mit Ziel und Nicht-Ziel-Pneumokokken-Isolate nach dem in Schritt 3 und 4 unten beschriebenen Verfahren. </li><li> Qualitätskontrolle Reagenzien bei der Produktion und dann danach mindestens einmal jährlich. HINWEIS: Wenn ein Reagens nicht passieren, QC, muss der Ansatz verworfen und eine neue Vorbereitung gemacht. Im Falle von Wiederholungs QC Ausfall empfehlen wir die Reagenzien mit den in Ortika et al., 2013 8 und in der folgenden Diskussion beschrieben alternativen Verfahren hergestellt werden. </li></ol> 3. Vorbereitung der Pneumokokken-Kulturen für die Serotypisierung <ol><li> Mit einer sterilen Schleife wählen Sie eine Einzelkolonie des Pneumokokken- isolieren und streifen dieses heraus auf eine feste nichtselektiven Blut-Agar, so dass die primäre Inokulum umfasst etwa ein Drittel der Plattenoberfläche. Streak für einzelne Kolonien. HINWEIS: Die Teller aus defibriniertes Pferdeblut hergestellt oder Schafe sind geeignet; aber Blut-Platten mit menschlichem Blut oder Citrat-Tierblut hergestellt sind es nicht. </li><li> Inkubieren Platte O / N bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 5% CO 2. </li><li> Beachten Sie, das Wachstum auf der Platte für Reinheit und beurteilen, dass es ein ausreichendes Wachstum für die Serotypisierung. HINWEIS: Eine Reinkultur des Pneumokokken-Isolat wird für die Serotypisierung erforderlich. Nach unserer Erfahrung konfluent, oder in der Nähe von konfluenten Wachstum rund ein Drittel der Plattenoberfläche ist in der Regel ausreichend, um die Serotypisierung abzuschließen. Wie Pneumokokken-Kulturen können anfällig für Autolyse sein, sollten die Kulturen für die Serotypisierung vorbereitet innerhalb von 24 Stunden von Subkultur getestet werden. Der Kulturplatte Nehmen Sie nicht aus dem Inkubator mehr als 15 bis 20 Minuten, bevor die Serotypisierung beginnt. </li></ol> 4. Durchführung Latexagglutination Serotypisierung <ol><li> Entfernen Sie alle Latex-Reagenzien aus dem Kühlschrank und lassen Sie sie für ca. RTrungsweise 30 min. Unmittelbar vor Gebrauch vorsichtig umdrehen die Rohre, um die Reagenzien zu mischen. </li><li> Beschriften Sie eine Mikroskop-Objektträger. </li><li> Zeigen 15 ul Negativkontrolle Latex-Reagenz auf den Objektträger. </li><li> Mit einer sterilen Einweg-1 ul-Schleife einen Schwung des Pneumokokken-Kultur, so dass die Schleife ist etwa halb voll. </li><li> Schmieren Sie vorsichtig das Inokulum auf die Oberfläche der Folie in der Nähe der Tropfen Negativkontrolle Latex-Reagenz. Das Inokulum ist auf dem Glasträger sichtbar. </li><li> Schnell und gründlich mischen den Impfstoff in die Negativkontrolle Latex-Reagenz mit der Schleife. Stellen Sie sicher, dass der Rückgang nicht weiter zu verbreiten als die Anfangsgröße. </li><li> Nehmen Sie den Schieber, halten sie an beiden Enden. Rock the slide und zurück für 1 min. Achten Sie darauf, um die Flüssigkeit in Bewegung zu halten langsam, und sicherzustellen, dass die Größe der Tropfen nicht zu. HINWEIS: Alternativ können Sie eine Platte Rocker. </li><li> Beachten makroskopischen Agglutination (dh durchbloßem Auge) und das Clearing der Suspension gegen einen schwarzen Hintergrund. </li><li> Wenn die negative Kontrolle Latex-Reagenz zeigt keine Agglutination oder Clearing weiterhin die Prüfung der Kultur, Austausch der Test Latex-Reagenzien für die Negativkontrolle Latex-Reagenz in Schritten von 4,1 bis 4,8 oben. Eine frische Schleife muss jedes Mal verwendet werden. Fahren Sie mit dem Testen der Latex-Reagenzien, beginnend mit den Pools. </li><li> Testen Sie jede der &quot;Pool&quot; Latex-Reagenzien in Folge, bis ein positiver Test erhalten wird. HINWEIS:. Die Reihenfolge der Prüfung der Pools kann in &quot;Runden&quot; durchgeführt werden, um die lokale Auftreten von bestimmten Serotypen (zB durch die Prüfung für die drei am ehesten Pools auf der ersten Folie zu reflektieren Wenn eine positive Reaktion nicht erhalten wird, dann testen die nächsten drei wahrscheinlichsten der verbleibenden Pools auf dem zweiten Schlitten und so weiter, bis eine positive Reaktion erhalten wird). Dies stellt sicher, dass die häufigsten Serotypen zuerst getestet, minimiert die Zeit und die benötigten Reagenzien. </li><li>Mit den Antiseren Herstellerschlüssel bestimmen, welche einzelnen Antiseren in der positiven Pool vertreten sind. </li><li> Testen Sie jede der in der positiven Pool enthalten individuell an die &quot;Gruppe&quot; oder &quot;Typ&quot; bestimmen Gruppen oder Typen wie in den Schritten 4,1 bis 4,8 oben. </li><li> Bestimmen Sie das Ergebnis anhand der Antiseren Herstellers Taste. Wenn ein &quot;Typ&quot; bestimmt (zB Serotyp 5), so ist keine weitere Prüfung erforderlich ist und dieses Ergebnis wird aufgezeichnet. </li><li> Wenn eine &quot;Gruppe&quot; bestimmt (zB Gruppe 19), dann finden Sie in der wichtigsten Hersteller, um die Faktoren zu bestimmen, getestet werden. Weiterhin Tests mit den einzelnen &#39;Faktor&#39; Latex-Reagenzien und bestimmen die endgültige Serotyp (zB Serotyp 19B). </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Latexagglutination ist eine einfache, schnelle und kostengünstige Methode zur Pneumokokken-Serotyp. Handels Pneumokokken Latexagglutination Reagenzien sind verfügbar, aber sie derzeit nicht zu differenzieren alle bekannten Serotypen 10,12. Allerdings Latexagglutination Reagenzien können leicht in-house mit gekauft Antiseren gegen spezifische Antigene Pneumokokken-Kapsel angehoben hergestellt werden. In dem hier beschriebenen Verfahren werden Antikörper passiv an Latexteilchen gebunden, um einen Satz von Latex-Agglutinations-Reagenzien zu machen. Eine positive Reaktion tritt auf, wenn Latex-spezifische Antikörper an die Latexpartikel gebunden zu befestigen, um Antigene auf den Polysaccharid-Kapsel der Pneumokokken isolieren 18,19. Die Latex-Teilchen an die Antikörper gebunden erlauben die spezifische Antikörper-Antigen-Reaktion ohne Vergrößerung sichtbar gemacht werden. Latexagglutination ist eine geeignete Methode für die Hochdurchsatzlabor eind auch für ressourcenarmen Umfeld. Hauptvorteile des Verfahrens sind Latex-Agglutination, dass keine Spezialausrüstung erforderlich ist, um den Test durchzuführen, wurden die Reagenzien eine Haltbarkeit von mindestens 2 Jahren bei 4 ° C 8 gespeichert, und daß es kostengünstig, einfach und schnell durchführen soll. Serotypisierung eine Pneumokokken-Isolat von Latex-Agglutination dauert etwa 10 min und bis zu vier Latexreagenzien können parallel auf einer Folie getestet werden. Außerdem, wenn die Häufigkeit der Serotypen für die entsprechende Einstellung epidemiologischen bekannten Tests können in Runden beginnend mit den Pools, die die meisten gemeinsamen Serotypen ähnlich der Quellung Test 17 ​​durchgeführt werden. Dieser Ansatz minimiert die Anzahl von Tests erforderlich, um den Serotyp bestimmen. Das Verfahren ist auch sehr gut reproduzierbar zwischen verschiedenen Betreibern (Daten nicht gezeigt). Ein Nachteil der Latex-Agglutination Serotypisierung ist, dass die Herstellung der Reagenzien ist zeitaufwendig, wobei ca. 4 h; obwohl mehrere reagents leicht parallel hergestellt werden. Darüber hinaus sind einige Antigene über verschiedene Pneumokokken-Serotypen gemeinsamen, was in Kreuzreaktionen mit einigen Antiseren (zB Serotyp 29, 42 und Gruppe 35). Allerdings sind diese Kreuzreaktionen gut charakterisiert, wenn mit kommerziellen Antisera (die in der Regel präabsorbiert ist es, die problematischer kreuzreagierenden Antikörper zu entfernen) und zusätzliche Reaktions Tabellen werden durch den Hersteller, um zu unterscheiden, welche Serotyp vorhanden ist. Latex-Reagenzien können auch überqueren reagieren, wenn die Antikörper nicht richtig auf der Latexpartikel ausgerichtet; diese werden als QC Defekt erkannt. Nach unserer Erfahrung ist streng QC für den Erfolg dieser Methode, auch wenn im Handel erhältlichen Antiseren werden für die Produktion verwendet. QC dauert etwa 15 min pro Reagenz und beruht auf einem Satz von geeigneten QC-Isolate wie oben beschrieben. Die hier beschriebene Methode führt zu Reagenzien, die eine positive Reaktion gut wi gebendünn die Testphase. Nach unserer Erfahrung sind False Positives in der Praxis selten (Daten nicht gezeigt). Gelegentlich falsch negative Reaktionen werden beobachtet; in der Regel handelt es sich dabei um bekannte Probleme mit einem bestimmten Antiserum (zB kann der Serogruppe 6 Isolate nicht mit Pool B-Antiserum reagieren) oder Down-Regulation der Expression durch die Kapsel-Isolat. Verwendung der Serotypisierung algrorithm des Herstellers ist auch wichtig, da in den meisten Fällen eine falsche positive oder negative Reaktion auf einen &quot;blinden Ende&quot; Ergebnis führen. In diesen Fällen und wenn die Reaktionen sind schwer zu interpretieren, empfehlen wir wiederholen-Prüfung und / oder Prüfung durch eine alternative Methode, wie die Quellung Reaktion. Einige Fehlersuche wird gelegentlich benötigt, um zufrieden stellende Latex-Reagenzien zu machen. In dem hier beschriebenen Verfahren wird der Antikörper an Latexteilchen durch passive Adsorption 15,19 befestigt, so dass eine kritische Variable ist die Konzentration des Antikörpers verwendet, der bestimmt, wie gutdie Oberfläche der Latexpartikel bedeckt und die anschließende Ausrichtung der Antikörper aktiven Stellen 15,20. Folglich wird, wenn unzureichende oder überschüssige Antikörper an Latexteilchen gebunden, die Antikörper-Antigen-Reaktionen nicht optimal, und unbefriedigende Reagenzien hergestellt 15,20,21 werden. Als Antikörpertiter variieren zwischen verschiedenen Chargen von Antiseren, kann ein Standard-Set von Verdünnungen Reagenzien, die gut 8 durchführen nicht produzieren. Ein guter Ausgangspunkt ist, um eine Verdünnung von 1:40 von Antiserum zu verwenden, und wenn dies nicht erfolgreich ist, verdünnen das Antiserum weiter. Nach unserer Erfahrung in der Regel löst das Problem 8. In einer kleinen Anzahl von Fällen können Reagenzien schwache Agglutination, die nicht von Clearing der Suspension begleitet wird, wenn getestet mit Ziel isoliert zu zeigen. In diesen Fällen wird die Antiserum verdünnt nicht die Qualität des Reagens verbessern, aber zufriedenstellende Reagenzien üblicherweise durch Auslassen der Zentrifugation hergestellt und Waschschritte 8,22 </sup&gt;. Antikörper beschichtet Latexpartikel werden häufig in der diagnostischen Mikrobiologie zur Erkennung, Identifizierung oder Serotypisierung von vielen verschiedenen Mikroben 15,20 eingesetzt. Als solches kann das hier beschriebene Verfahren eignet sich zur Herstellung Latex-Reagenzien für andere Zwecke, vorausgesetzt, dass geeignete Antiseren und ausreichend QC-Verfahren übernommen.

Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) ist eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität bei Kindern im Alter von unter fünf Jahren weltweit, vor allem in einem ressourcenarmen Umfeld 1,2. Pneumokokken-Erkrankungen reicht von lokalisierten Infektionen zu lebensbedrohlichen Erkrankungen wie Lungenentzündung, Sepsis und Meningitis 1,2. Mehr als 90 Serotypen von Pneumokokken wurden identifiziert, basierend auf Unterschieden in ihren Kapselpolysaccharid 3. Aktuelle Impfstoffe zielen auf den Kapsel-Polysaccharid und bieten Schutz vor den wichtigsten Serotypen invasive Erkrankungen verursachen 4. Serotypisierung Pneumokokken-Isolate ist wichtig für die Beurteilung der Auswirkungen der Impfung auf Wagen und Krankheit sowie die Bereitstellung umfassendere epidemiologische Informationen 5,6. Die aktuelle &quot;Goldstandard&quot;-Methode für Pneumokokken-Serotypisierung ist die Quellung Test, aber es ist zeitaufwendig und erfordert etwas Geschick, um perform 7. Latexagglutination ist eine Alternative Serotypisierung Verfahren von der Weltgesundheitsorganisation 7 empfohlen. Latexagglutination ist schnell und einfach durchzuführen, und wird weltweit in vielen Labors 8-11 eingesetzt. Wichtig ist, dass Latexagglutination vergleichbarer Genauigkeit auf die Quellung Test für Pneumokokken-Serotypisierung 10,12-14 gezeigt. Insgesamt ist diese Methode ideal für ressourcenarmen Umfeld sowie hohe Durchsatzlabors. Latex-Agglutinations-Reagenzien (&quot;Latex-Reagenzien &#39;) durch die Befestigung der Antikörper an Latexteilchen 15 angelegt. In einer positiven Reaktion agglutinieren diese markierten Teilchen in Gegenwart eines spezifischen Antigens. Kommerziellen Latex-Reagenzien sind für eine begrenzte Anzahl von Serotypen zur Verfügung. Latex-Reagenzien können auch in-house mit kommerziell erhältlichen Antiseren 10 hergestellt werden. Gemische von Antisera (&quot;Pools&quot;) sowie spezifische Antiseren gegen Pneumokokken-serogroups (zB Gruppe 19), einzelnen Serotypen (beispielsweise Serotyp 5) und an spezifische Antigene (&quot;Faktoren&quot;, zB., Faktor 19c erkennen Serotyp 19A) zum weiteren Definieren Serotypen innerhalb der Gruppen sind 16. Diese Handschrift beschreibt die Hauptschritte bei der Herstellung von Latexreagenzien mit passiven Befestigung von im Handel erhältlichen Antiseren gegen Latexpartikel. Die Qualitätskontrolle (QC) Aspekte dieses Verfahrens beschrieben, und ein Protokoll für die Verwendung von Latexreagenzien zur Serotypisierung Pneumokokken enthalten.

<table><tbody><tr><td>Microparticles based on polystyrene, 800 nm</td><td>Sigma</td><td>65984-10 ml-F</td><td>Or other volumes as required</td></tr><tr><td>Normal rabbit serum</td><td>Antibodies Australia&amp;nbsp;</td><td>NRS-1ml</td><td>Or other volumes as required, bring to RT before use</td></tr><tr><td>Pneumococcus (Neufeld) antisera</td><td>SSI Diagnostica</td><td>Various</td><td>Bring to RT before use&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&quot;&gt;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Sterile Bovine Albumin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A-4503</td><td>Bring to rRT before use</td></tr><tr><td>Sodium azide 10% (v/v) solution&amp;nbsp;</td><td>VWR International</td><td>ROAC3902/100ml</td><td>Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.094</td><td>Round bottom</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Merck</td><td>10241.AP</td><td></td></tr><tr><td>Calibrated disposable inoculating loops 1 &amp;micro;l</td><td>Copan</td><td>CD175SO1</td><td></td></tr><tr><td>Glass microscope slides 76 mm x 26 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LBS 2950RC</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaOH</td><td>BDH</td><td>10252</td><td>Caution: highly corrosive</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Merck</td><td>10119.05</td><td></td></tr><tr><td>Horse Blood Agar (HBA) plates</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PP2001</td><td>Bring to RT before use&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.thermofisher.com.au/&quot;&gt;http://www.thermofisher.com.au&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Rotating wheel</td><td>Wyble Engineering Development Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml</td><td>Technoplas</td><td>S5016SU</td><td></td></tr><tr><td>60 ml syringes without needles</td><td>Terumo</td><td>SS-60L</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP syringe filter unit, 0.22 &amp;micro;m</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Brochure on Neufeld antisera</td><td>Statens Serum Institut</td><td></td><td>Key to determining serotypes&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&quot;&gt;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Key to pneumococcal factor serum</td><td>Statens Serum Institut</td><td>18058</td><td>For determining serotype within Groups&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&quot;&gt;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>*alternative sources are available for most materials</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

capsular serotyping of streptococcus pneumoniae by latex agglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the &#8216;gold standard&#8217; Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective. 
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.

Eine positive Reaktion tritt auf, wenn Latex-Typ-spezifischen Antikörpers an die Latexpartikel gebunden bindet an die Kapsel des Pneumokokkus, und die Agglutination der Partikel erfolgt Antikörper markiert 15. 1A zeigt eine positive Reaktion, die durch Agglutination und Löschen des Hinter gekennzeichnet Aufhängung. Eine negative Reaktion wird durch die verbleibenden glatt und weiß (1B) Latex-Agglutinations-Reagens-Suspension ist. Die Reagenzien werden so optimiert, dass eine positive Reaktion vor Ende des einen min-Zeitintervall (in der Regel in ca. 20 sec nachweisbar) beobachtet werden. Wir empfehlen nicht, liest Reaktionen nach der 1 min Zeitintervall. Sehr selten, zeigen Reaktionen schwache Agglutination um den Rand des Tropfens, die nicht durch das Löschen des Hinter Suspension begleitet wird, oder erscheint &quot;faserig&quot; ohne Hintergrund Clearing (Daten nicht gezeigt). Dies sind die meisten wie<html> ly negative Reaktionen. In solchen Fällen empfehlen wir die Wiederholung der Prüfung und / oder eine weitere Untersuchung mit einem anderen Serotyp Verfahren (zum Beispiel der Quellung Reaktion 17). <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51747/51747fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Positive und negative Reaktionen Latexagglutination. Zubereitungen von der Pneumokokken-Isolat mit Latex Agglutinationsreagenz zeigt eine positive Reaktion (A) oder eine negative Reaktion (B) gemischt. Agglutination begleitet von Räumung der Hintergrund ist in der positiven Reaktion (A) gesehen .There keine sichtbare Agglutination mit der Negativkontrolle Latexreagenz oder in einem negativen Testreaktion (B). Fotos 8 mit Genehmigung verwendet.&quot;Target =&quot; _blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Latex-Agglutinations-Test ist eine einfache, schnelle und kostengünstige Methode zur Serotypisierung Streptococcus pneumoniae, und auch weit verbreitet in diagnostischen Mikrobiologie aufgebracht. Dieses Manuskript beschreibt die in-house Produktion von Latexagglutination Reagenzien, Qualitätskontrollverfahren und die Anwendung dieser Technik auf den Pneumokokken-Serotyp.

Kapsel Serotypisierung<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Durch Latexagglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

capsular-serotyping-of-streptococcus-pneumoniae-by-latex-agglutination

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

21.8K Aufrufe.  Murdoch Childrens Research Institute.  Latex-Agglutinations-Test ist eine einfache, schnelle und kostengünstige Methode zur Serotypisierung Streptococcus pneumoniae, und auch weit verbreitet in diagnostischen Mikrobiologie aufgebracht. Dieses Manuskript beschreibt die in-house Produktion von Latexagglutination Reagenzien, Qualitätskontrollverfahren und die Anwendung dieser Technik auf den Pneumokokken-Serotyp. 

Serie: Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute flaccid paralysis (AFP) cases. In the World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolation and identification are currently being performed by using cell culture system and real-time RT-PCR, respectively. In the post-eradication era of PV, simple and rapid identification procedures would be helpful for rapid confirmation of polio cases at the national laboratories. In the present study, we will show the procedure of novel PA assay developed for PV identification. This PA assay utilizes interaction of PV receptor (PVR) molecule and virion that is specific and uniform affinity to all the serotypes of PV. The procedure is simple (one step procedure in reaction plates) and rapid (results can be obtained within 2 h of reaction), and the result is visually observed (observation of agglutination of gelatin particles).

A recently developed novel particle agglutination (PA) assay utilizing virus receptor molecule allowed a rapid and easy identification of poliovirus (PV). In this article, we will show the procedure for the PA assay for PV identification.

Partikelagglutinations Methode für Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant strains. Carbohydrate substrate binding proteins (SBPs) represent viable targets for the development of protein-based vaccines and new antimicrobials because of their extracellular localization and the centrality of carbohydrate import for pneumococcal metabolism, respectively. Described here is a rationalized integrated protocol to carry out a comprehensive characterization of SP0092, which can be extended to other carbohydrate SBPs from the pneumococcus and other bacteria. This procedure can aid the structure-based design of inhibitors for this class of proteins. Presented in the first part of this manuscript are protocols for biochemical analysis by thermal shift assay, multi angle light scattering (MALS), and size exclusion chromatography (SEC), which optimize the stability and homogeneity of the sample directed to crystallization trials and so enhance the probability of success. The second part of this procedure describes the characterization of the SBP crystals using a tunable wavelength anomalous diffraction synchrotron beamline, and data collection protocols for measuring data that can be used to resolve the crystallized protein structure.

A streamlined protocol for performing an extensive biochemical and structural characterization of a carbohydrate substrate binding protein from Streptococcus pneumoniae is presented.

Biochemische und strukturelle Charakterisierung von Kohlenhydrat Transport Substrat-Bindeprotein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Biochemie

Experimental Human Pneumococcal Carriage

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major source of transmission and the prerequisite of invasive disease. A model of carriage will allow accurate determination of the immunological correlates of protection, the immunizing effect of carriage and the effect of host pressure on the pathogen in the nasopharyngeal niche. Further, methods of carriage detection useful in epidemiologic studies, including vaccine studies, can be compared.
Aim
We aim to develop an EHPC platform that is a safe and useful reproducible method that could be used to down-select candidate novel pneumococcal vaccines with prevention of carriage as a surrogate of vaccine induced immunity. It will work towards testing of candidate vaccines and descriptions of the mechanisms underlying EHPC and vaccine protection from carriage1. Current conjugate vaccines against pneumococcus protect children from invasive disease although new vaccines are urgently needed as the current vaccine does not confer optimal protection against non-bacteraemic pneumonia and there has been evidence of serotype replacement with non-vaccine serotypes2-4.
Method
We inoculate with S. pneumoniae suspended in 100 &mu;l of saline. Safety is a major factor in the development of the EHPC model and is achieved through intensive volunteer screening and monitoring. A safety committee consisting of clinicians and scientists that are independent from the study provides objective feedback on a weekly basis.
The bacterial inoculum is standardized and requires that no animal products are inoculated into volunteers (vegetable-based media and saline). The doses required for colonization (104-105) are much lower than those used in animal models (107)5. Detecting pneumococcal carriage is enhanced by a high volume (ideally &gt;10 ml) nasal wash that is relatively mucus free. This protocol will deal with the most important parts of the protocol in turn. These are (a) volunteer selection, (b) pneumococcal inoculum preparation, (c) inoculation, (d) follow-up and (e) carriage detection.
Results
Our current protocol has been safe in over 100 volunteers at a range of doses using two different bacterial serotypes6. A dose ranging study using S. pneumoniae 6B and 23F is currently being conducted to determine the optimal inoculation dose for 50% carriage. A predicted 50% rate of carriage will allow the EHPC model to have high sensitivity for vaccine efficacy with small study numbers.

Experimental human pneumococcal carriage offers a natural model of carriage and a potential model for use in vaccine development. This technique is valuable yet complex and involves clinical risk by introducing a pathogen into a human. We have developed a detailed protocol.

Experimentelle Menschliche Pneumokokken Carriage

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Medizin

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

Charakterisierung von Entzündungsreaktionen während der intranasalen Kolonisation mit Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal epidemiology, capsular serotyping can provide useful information for vaccine efficacy and impact studies.&#160;The Quellung reaction is the gold standard method for pneumococcal capsular serotyping. The method involves testing a pneumococcal cell suspension with pooled and specific antisera directed against the capsular polysaccharide. The antigen-antibody reactions are observed microscopically. The protocol has three main steps: 1) preparation of a bacterial cell suspension, 2) mixing of cells and antisera on a glass slide, and 3) reading the Quellung reaction using a microscope. The Quellung reaction is reasonably simple to perform and can be applied wherever a suitable microscope and antisera are available.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

The Quellung reaction is the gold standard technique for serotyping Streptococcus pneumoniae. This technique utilizes a microscope and specific pneumococcal antisera and is commonly used in reference and research laboratories worldwide.

Kapsel Serotypisierung von<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Verwenden der Quellung Reaktion

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled microscopic lesions (microlesions) that are remarkable due to the absence of infiltrating immune cells. Due to their release of cardiotoxic products, S. pneumoniae within microlesions are thought to contribute to the heart failure that is frequently observed during fulminate invasive pneumococcal disease in adults. Herein is demonstrated a protocol for experimental mouse infection that leads to reproducible cardiac microlesion formation within 30 hr. Instruction is provided on microlesion identification in hematoxylin &#38; eosin stained heart sections and the morphological distinctions between early and late microlesions are highlighted. Instruction is provided on a protocol for verification of S. pneumoniae within microlesions using antibodies against pneumococcal capsular polysaccharide and immunofluorescent microscopy. Last, a protocol for antibiotic intervention that rescues infected mice and for the detection and assessment of scar formation in the hearts of convalescent mice is provided. Together, these protocols will facilitate the investigation of the molecular mechanisms underlying pneumococcal cardiac invasion, cardiomyocyte death, cardiac remodeling as a result of exposure to S. pneumoniae, and the immune response to the pneumococci in the heart.

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Streptococcus pneumoniae forms discrete non-purulent microscopic lesions in the heart. Outlined is the protocol for a murine model of cardiac microlesion formation. Instruction is provided on microlesion visualization using microscopy, discrimination between early and late microlesions, and methods to detect cardiac remodeling in hearts of convalescent animals.

Visualisierung<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Innerhalb Cardiac Mikroläsionen und anschließende Herz Remodeling

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes

Genetic code expansion is a powerful tool to introduce unnatural amino acids (UAAs) into proteins to modify their characteristics, to study or create new protein functions or to have access to protein conjugates. Stop codon suppression, in particular amber codon suppression, has emerged as the most popular method to genetically introduce UAAs at defined positions. This methodology is herein applied to the preparation of a carrier protein containing an UAA harboring a bioorthogonal functional group. This reactive handle can next be used to specifically and efficiently graft a synthetic oligosaccharide hapten to provide a homogeneous glycoconjugate vaccine. The protocol is limited to the synthesis of glycoconjugates in a 1:1 carbohydrate hapten/carrier protein ratio but amenable to numerous pairs of biorthogonal functional groups. Glycococonjugate vaccine homogeneity is an important criterion to ensure complete physico-chemical characterization, thereby, satisfying more and more demanding drug regulatory agency recommendations, a criterion which is unmet by classical conjugation strategies. Moreover, this protocol makes it possible to finely tune the structure of the actual conjugate vaccine, giving rise to tools to address structure-immunogenicity relationships.

Genetic code expansion is applied for the introduction of an unnatural amino acid bearing a biorthogonal functional group on a carrier protein at a defined site. The biorthogonal function is further used for the site-selective coupling of a carbohydrate antigen to provide a homogeneous glycoconjugate vaccine.

Homogenes Glycoconjugate hergestellt durch kombinierte unnatürliche Aminosäure-Inkorporation und Click-Chemie für Impfstoffzwecke

Genetic code expansion is a powerful tool to introduce unnatural amino acids (UAAs) into proteins to modify their characteristics, to study or create new ...

Biotechnik

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonophagocytic Tötung Assay Immunreaktionen gegen bakterielle Krankheitserreger zu bewerten

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is requisite to phagocytosis and killing, the assay is an alternative method to&#160;opsono-phagocytic killing assays. An advantage of the opsono-adherence&#160;assay is the option of using inactivated pathogens and mammalian cell lines, which allows standardization across multiple experiments. The use of an inactivated pathogen in the assay also facilitates work with biosafety level 3 infectious agents and other virulent pathogens. In our work, the opsono-adherence assay was used to assess the functional ability of antibodies, from sera of animals immunized with an anthrax capsule-based vaccine, to induce adherence of fixed Bacillus anthracis to a mouse macrophage cell line, RAW 264.7. Automated fluorescence microscopy was used to capture images of bacilli adhering to macrophages. Increased adherence was correlated with the presence of anti-capsule antibodies in the serum. Non-human primates that exhibited high serum anti-capsule antibody concentrations were protected from anthrax challenge. Thus, the opsono-adherence assay can be used to elucidate the biological functions of antigen specific antibodies in sera, to evaluate the efficacy of vaccine candidates and other therapeutics, and to serve as a possible correlate of immunity.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

The opsono-adherence assay is an alternative method to the opsono-phagocytic killing assay to evaluate the opsonic functions of antibodies in vaccine development.

Opsono-Adherence Assay zur Bewertung funktioneller Antikörper in der Impfstoffentwicklung gegen Bacillus anthracis und andere verkapselte Pathogene

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is ...

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, studies in this serotype have been hindered by the lack of genetic tools to modify it. In this study, we describe a method to genetically modify a serotype 1 clinical isolate (strain 519/43). Interestingly, this was achieved by exploiting the Pneumococcus&#8217; ability to naturally acquire DNA. However, unlike most pneumococci, the use of linear DNA was not successful; to mutate this important strain, a suicide plasmid had to be used. This methodology has provided the means for a deeper understanding of this elusive serotype, both in terms of its biology and pathogenicity. To validate the method, the major known pneumococcal toxin, pneumolysin, was mutated because it has a well-known and easy to follow phenotype. We showed that the mutant, as expected, lost its ability to lyse red blood cells. By being able to mutate an important gene in the serotype of interest, we were able to observe different phenotypes for loss of function mutants upon intraperitoneal and intranasal infections from the ones observed for other serotypes. In summary, this study proves that strain 519/43 (serotype 1) can be genetically modified.

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Here, we describe a S. pneumoniae serotype 1 strain 519/43 that can be genetically modified by using its ability to naturally acquire DNA and a suicide-plasmid. As proof of principle, an isogenic mutant in the pneumolysin (ply) gene was made.

Konstruktion von Mutanten im Serotyp 1 Streptococcus pneumoniae Stamm 519/43

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, ...

Kapsel Serotypisierung

Zusammenfassung

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