Wir danken Dr. U. Ashery für das Geschenk des NPY-mRFP cDNA. Wir danken Drs. MJ Kofron, L. Mittleman, M. Shaharbani und Y. Zilberstein für wertvolle Unterstützung mit Mikroskopie und Bildanalyse. Wir danken auch Dr. Joseph Orly für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss von der Israel Science Foundation, durch die Israel Akademie der Wissenschaften gegründet, unterstützt (1139-1112 zu RS-E.).

1. Vorbereitung der RBL Zellkulturmedien <ol><li> Mischungs 500 ml niedrigen Glucose Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 56 ml fötalem Rinderserum (dies macht 10% FBS), und fügen 5.5 ml Penicillin Streptomycin (dies macht ~ 1% PEST). </li><li> Filtern Sie die Medien mit 500-1000 ml Bottle-Top Vakuumfilter mit 0,22 um Porengröße und bei 4 ° C. </li></ol> 2. Kultur der RBL-Zellen <ol><li> Wachsen RBL-Zellen in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 bei 37 ° C entweder in Platten oder Flaschen. RBL-Zellen, die in 10 cm-Platten wachsen, sollte mit 10 ml Medium, ergänzt werden und bilden konfluente Monoschicht von ~ 10 7 Zellen / Platte. </li><li> Wenn die Zellschicht nähert Fluss, Ausstrich der Kultur bei einer geringeren Dichte. <ol><li> Entfernen Sie das Kulturmedium von der Platte / Kolben mit einer sterilen Pasteur-Pipette, um Vakuum verbunden. </li><li> Spülen Sie die Zellschicht mit vorgewärmten (37° C) 0,25% Trypsin / EDTA, die die gesamte Monoschicht (das Volumen ist abhängig von der Größe der Kulturplatte / Kolben erstreckt; 2 ml für 10-cm-Platte). Dadurch werden die Zellen abzulösen. </li><li> Alternativ spülen die Zellschicht mit Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), entfernen Sie die PBS und fügen vorgewärmten (37 ° C) Trypsin / EDTA. Dieser Schritt löst die Zellen schneller. </li><li> Legen Sie die Platte / Kolben in einem Brutschrank bei 37 ° C (nicht mehr als 10 min). </li><li> Überprüfen Sie die Zellen unter dem Lichtmikroskop zu überprüfen, ob sie gelöst haben. Wenn die Zellen nicht nach 10 Minuten zu lösen, klopfen Sie leicht auf der Platte / Kolben. </li><li> Hinzufügen Medium zur Kulturplatte / Kolben, um die Zellen zu suspendieren (das Volumen des Mediums sollte mindestens 2-fach größer ist als das Volumen der Trypsinlösung). </li><li> Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation für 3 Minuten bei 200 g bei 25 ° C. </li><li> Die Zellen in Medium. Verdünnen Sie die Zellen durch 1.10 und Samen in einem neuen Kulturschale. Inkubieren Sie die Zellen für 48-72 Stunden, bis sie REACh ca. 90% Konfluenz. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang (Abschnitt 2.2.1-2.2.8) für bis zu 3 Monate (30 Stellen). </li></ol></li></ol> 3. Herstellung der Transfektion Medien. <ol><li> Vorbereiten einer 100 mM Lösung von K-Pipes pH 7, 1 mM Lösung von Ca 2+ Acetat und 100 mM Lösung von Mg 2+ Acetat. </li><li> Verdünne das 100 mM Lösung von K-Pipes pH 7 in 20 mM mit DMEM-Medium, fügen die 1 mM Lösung von Ca 2+ Acetat zu einer Endkonzentration von 10 uM und 100 mM Lösung von Mg 2+ Acetat zu einer Endkonzentration von 2 mM. </li><li> Wiegen Kaliumglutamat und zu der Lösung bis zu einer Endkonzentration von 128 mM, gut mischen und halten bei 4 ° C bis zur Verwendung. Halten Sie die weiteren Lösungswege (dh., K-Rohre, die Ca 2+ Acetat, Mg 2+ Acetat) bei -20 ° C. </li></ol> 4. Transfektion von RBL-Zellen <ol><li> Entfernen Sie das Kulturmedium von der Platte / Kolben mit einsterilen Pasteur-Pipette, um Unterdruck verbunden ist. </li><li> Spülen der Zellschicht mit vorgewärmten (37 ° C) Trypsin / EDTA, die die gesamte Monoschicht abdecken sollte. Legen Sie die Platte / Kolben in einem Brutschrank bei 37 ° C (nicht mehr als 10 min). Überprüfen Sie, ob die Zellen gelöst mit dem Lichtmikroskop. </li><li> Hinzufügen Medium zur Kulturplatte / Kolben, um die Zellen zu suspendieren (das Volumen des Mediums sollte mindestens 2 größer mehr als das Volumen der Trypsinlösung sein). </li><li> Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit Zählkammer. </li><li> Pelle 1,5 × 10 7 Zellen wurden durch Zentrifugation für 3 Minuten bei 200 × g bei 25 ° C. Die Überstände verwerfen und fügen Sie 280 ul von Transfektionsmedium. Übertragen Sie die Reaktionsmischung in 4 mm Küvette. </li><li> In 20 ug NPY-mRFP Plasmid und entweder 30 ug der Steuer leeren Plasmid oder einem Plasmid getestet. Das Endvolumen der Reaktionsmischung sollte 300 &amp; mgr; l sein. </li><li> Unmittelbar danach auf Eis für 10 min. Reinigen Sie die Küvette von Restwasser und p9 ms roceed der Elektroporation bei 300 V. </li><li> Für Messungen der Exozytose, Ausstrich die Zellen sofort in 24-Well-Gewebekulturplatten mit 300 &amp; mgr; l Medium. Hinzufügen 8 ul des Reaktionsgemisches (4 × 10 5 Zellen) in jede Vertiefung. In 4 x 10 5 nicht transfizierten Zellen auf weitere Bohrungen zur Kontrolle. Bereiten Sie genügend Brunnen für den zumindest zwei Vertiefungen für jede Behandlung für jede Transfektion. </li><li> Für Zeitraffer-Mikroskopie, Ausstrich die Zellen sofort in einem 8-Well-Kammerdeckglas Borosilikat-System, das 80 &amp; mgr; l Medium. Hinzufügen von 1,5 ul der Reaktionsmischung (7,5 × 10 4 Zellen) zu jeder Kammer. (Versuchen Sie zu vermeiden, mit den Kammern am Rand des Deckglas, sind die Kammern in der Mitte des Deckglas leichter Bild). Hinweis: Es ist wichtig, nicht alle Zellen als Reaktion auf ein Trigger- und gelegentlich die Zeitraffermikroskopie wird durch den Verlust der Ausrichtung und Verschiebung der 8-Well-Kammer Boro aufgehobensilicat Deckglas-System. Daher werden mindestens 8 Kammern für jede Behandlung für jede Transfektion. </li><li> Zur Sensibilisierung der Zellen für FcsRI vermittelte Aktivierung wird mit 1 ug / ml Maus DNP spezifische monoklonale IgE an die Medien (Inkubieren der Zellen mit IgE für mindestens 2 h). </li><li> Nach 18 bis 24 Stunden mit einem Fluoreszenz-Mikroskop, um zu bestätigen, dass die Zellen zum Ausdruck bringen, die die Plasmide. Die Anregungs- und Emissionswellenlängen der Fluoreszenz mRFP sind: &amp; lambda; ex 584, &amp; lambda; em 607 nm. NPY-mRFP sollte in vesikuläre Strukturen, die den SGs entsprechen scheinen. Wenn das zweite Gen von Interesse an eine fluoreszierende Markierung fusioniert ist mit einem Fluoreszenzmikroskop, um die Co-Expression von beiden Plasmiden in derselben Zelle zu bestätigen. Wenn beispielsweise der geprüfte Gens mit GFP fusioniert ist, die Anregungs- und Emissionswellenlängen von GFP-Fluoreszenz sind: &amp; lambda; ex 488, &amp; lambda; em 507 nm. Die GFP-markierte Protein sollte an den gleichen Zellen, die NPY-mRFP Ausdruck erscheinen. </li><li> Für Exozytose Messungen gehen to Schritt 5 und für Zeitraffer-Mikroskopie, fahren Sie mit Schritt 6 fort. </li></ol> 5. Mess NPY-mRFP Exocytosis <ol><li> Vorbereitung der Tyrode-Puffer: <ol><li> Es wird eine Lösung von 54 mM KCl, 20 mM MgCl 2, 2,74 M NaCl und 8 mM NaH 2 PO 4 in DDW. Gut mischen und bei 4 ° C. Dieser Schritt ist für die Herstellung der 20x Tyrode Puffer. </li><li> Eine Lösung aus 20 mM Hepes pH 7, 1,8 mM CaCl 2, 1 mg / ml BSA, 5,6 mM Glucose und 1 bis 20 Verdünnung Tyrode 20x in DDW und gut mischen. Dieser Schritt ist für die Herstellung von 1x Tyrode Puffer. </li><li> Aliquot der 1x Tyrode Puffer und bei -20 ° C. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen. </li></ol></li><li> Entfernen Sie das Kulturmedium aus der 24-Well-Platte und 3 x waschen mit Tyrode-Puffer. Bereiten unstimulierten Zellen durch Zugabe von 200 ul Tyrode Puffer in Vertiefungen zu steuern. </li><li> Herstellung von 10 &amp; mgr; l / Vertiefung 20X konzentriert Aktivierungsreagenz [(zB 1.000 ng / ml DNP-BSA oder DNP-HSA (Ag), 200 &amp; mgr; M Ca 2+ Ionophor (zB 23187), und eine Kombination von 20 &amp; mgr; M Ca 2+ Ionophor und 1.000 nM 12-O- Tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA)]. Wenn die Reagenzien in DMSO aufbewahrt, verdünnt den Reagenzien in 20x Konzentration in Tyrode-Puffer, der 1% DMSO. Bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Entfernen Sie die Überstände der Vertiefungen sorgfältig auf eine Platte mit 96 Vertiefungen, setzen auf Eis und vor Licht zu vermeiden. (Die Überstände enthalten, die das chimäre Peptid NPY-mRFP, die von den Zellen freigesetzt wurde). </li><li> Gib 200 ul Tyrode-Puffer, der 0,5% Triton X-100 in jede Vertiefung und Inkubieren bei 37 ° C für 10 min. (Dieser Schritt ist wichtig für die Herstellung von Zelllysaten, die die restlichen von NPY-mRFP, die nicht aus den Zellen freigesetzt wurde, enthalten). Sammeln Sie die Zelllysate und Transfer zu einer Platte mit 96 Vertiefungen, setzen auf Eis und vor Licht zu vermeiden. </li><li> Messen der Fluoreszenz der Zellüberstände und Zelllysate unter Verwendung eines fluoreszierrenzPlattenLeseGerät, mit einem 590-, 20 nm Bandbreite Anregungsfilter und 635-, 35 nm Bandbreite Emissionsfilter. </li><li> Der prozentuale Anteil von NPY-mRFP Freigabe: HINWEIS: Der Fluoreszenzreader Maßnahme willkürlichen Fluoreszenzeinheiten (AFU). AFU Werte hängen von der Maschine und ihrer Empfindlichkeit und der Transfektionseffizienz. <ol><li> Stellen Sie die Autofluoreszenz der nichttransfizierten RBL-Zellen als leer. Teilen Sie die AFU jedes Überstands auf die Gesamtfluoreszenz (AFU der Überstände + AFU des entsprechenden Lysat) und mit 100 multipliziert. </li></ol></li></ol> 6. Zeitraffer-Mikroskopie der Exozytose <ol><li> Saatgut, 7,5 × 10 4 der transfizierten Zellen / Kammer in einem 8-Well-Kammerdeckgläser Borosilikat Systems. Nach 18 bis 24 Stunden, entfernen Sie das Kulturmedium aus den Kammern und wäscht 3 mal mit Tyrode-Puffer </li><li> In 72 ul Tyrode Puffer zu jeder Kammer. Verdünnen Sie die Aktivierungsreagenzien in Tyrode-Puffer zu 10x Konzentration. </li> &lt;li&gt; Verwenden Sie einen konfokalen Fluoreszenzmikroskop mit einer beheizten Kammer (37 ° C) und CO 2-Controller (4,8%) und einem 40X oder 63X Ziel ausgestattet. Schalten Sie den Mikroskopsysteme: Quecksilberlampe, Computer und Laser. Stellen Sie sicher, dass die beheizte Kammer ist mit der richtigen Temperatur vor Beginn des Experiments. </li><li> Legen Sie die Kammer in der beheizten Kammer und stellen Sie sicher, dass die Kammer richtig und stabil installiert ist. </li><li> Schalten Sie das Fluoreszenzlicht nach dem jeweiligen Fluorophor und visualisieren transfizierten Zellen. Schalten Fluoreszenz sobald eine Zelle von Interesse ist auf dem Gebiet, um das Bleichen und Zytotoxizität zu minimieren. Es ist wichtig, dass dieser Bereich ungefähr 2-3 transfizierte Zellen enthalten. Die transfizierten Zellen sollten gut verteilt werden, jedoch nicht gegenseitig berühren. </li><li> Stellen Sie die Laserleistung (abhängig von dem Mikroskop), um Rauschen und Übersättigung sowie Toxizität zu minimieren, und stellen Sie die Verstärkung und Offset, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu ändern. Schnell einscannen oderder die Dauer der Laserexposition (Durchschnitt 2) zu minimieren. </li><li> Stellen Sie die Lochblendengröße zu einem Maximum, dies ermöglicht die Verringerung der Laserleistung und die Bilder für einen langen Zeitraum ausgerichtet zu halten. Wenn gewünscht, stellen Sie die Parameter für die Z-Stack, um das Bild im dreidimensionalen, stellen Sie die Lochgröße auf 1 luftigen Einheit (AU), die das beste Signal-Rausch-Verhältnis zu erwerben gibt und sukzessive Abtasten der zweidimensionalen konfokalen optischen Scheiben in die Rekonstruktion die z-Achse mit optischen Scheiben ≤0.7 um. </li><li> Stellen Sie das Zeitintervall zwischen jedem Erwerb nach 15-30 sec und die Dauer der gesamten Anschaffungs bis 15 Minuten und starten Sie die Erfassung von Bildern. Nach 5 Minuten des Erwerbs halten Sie den Zeitreihen. In 8 ul der 10-fach Trigger und weiter die Übernahme sofort. </li><li> Speichern Sie die Bilder, führen Entfaltung mit einem Entfaltungs Software und rekonstruieren die Stapel, um dreidimensionale Bilder und zu einem Film mit Imaris Software. </li></ol><ol><li> Importieren Sie die Daten aus den entfalteten Zeitreihe Bilder, die von der konfokalen Fluoreszenzmikroskop zu Imaris Software erhalten. Diese Software liest über 40 Mikroskopie-Dateien. Wenn die Software die Dateien nicht lesen; die Dateien zu konvertieren, um TIF-Dateien und Import. </li><li> Zur Zeit zeigt auf das Ende eines offenen Datensatzes drücken bearbeiten hinzufügen -&gt; Add Zeitpunkte und importieren Sie die neuen Datensatzes. </li><li> Erstelle Oberfläche des mRFP Kanal mit Option Oberfläche Assistenten. Wählen Sie den Standard-Algorithmus. Wählen Sie den Kanal von NPY-mRFP. Markieren Sie die Option Glätten um Lärm zu reduzieren. Um einen Datenverlust zu vermeiden, von kleinen Details reduzieren den Bereich Detailebene bis 0,05 um. </li><li> Stellen Sie die Intensitätsschwelle. New graue Fläche angezeigt. Gehen Sie auf &quot;Einstellungen&quot; und schalten Sie den Stil von &quot;Mittelpunkt&quot; auf &quot;Surface&quot;. </li><li> Gehen Sie zur Registerkarte Statistik in den Eigenschaften des ausgewählten Objekts, wählen Sie die Registerkarte Detail und den spezifischen Wert such als Fluoreszenz-Intensität, Volumen usw. </li><li> Überprüfen Sie die Daten und bestätigen Sie, dass die Werte mit den Bildern kompatibel sind. Beispielsweise könnten zwei oder mehr benachbarten Körnchen als eine größere Granulat gemessen werden. Zur Quantifizierung der durchschnittlichen Korngröße zu teilen, die Größe der zusammengeführten Granulate auf die tatsächliche Anzahl der Körnchen. </li><li> Exportieren Sie die gewünschten Datensätze in Excel-Dateien und die Daten analysieren. </li></ol> f

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The authors have no financial conflicts of interest.

Wir beschreiben eine innovative Strategie, die Quantifizierung von MCs Exozytose und vier (x, y, z, t) Dimension Quantifizierungen kombiniert mit zeitversetzt dreidimensionale Abbildung der SGs in lebenden Zellen mit einem Reportergen zur Exozytose. Diese Technik ermöglicht Screening von Proteinfamilien auf ihre Auswirkungen auf MC-Funktion wie die Überwachung SGs bereits ab ihrem Austritt aus dem Golgi durch ihre Reifung, Erwerb von Exozytose Kompetenz und Degranulation. Die Kombination von Messungen der Exozytose mi...

Mastzellen (MC) sind Immunzellen, die am besten für ihre Beteiligung an allergischen und entzündlichen Reaktionen wie Arthritis, Asthma, eosinophile Ösophagitis, chronische Hautentzündung und anaphylaktischer Schock 1,2 sowie andere Erkrankungen, einschließlich koronarer Herzkrankheit 3,5 und bekannt sind, Krebs 3,4. Darüber hinaus spielen MCs eine wichtige Rolle bei angeborenen und erworbenen Immunität, die beide in der Wirtsabwehr gegen Bakterien und Parasiten und durch Unterdrückung von Immunreaktionen, zum Beispiel induziert Transplantattoleranz 5,6. MCs stammen aus dem Knochenmark, die Entwicklung von CD34 + / CD117 + pluripotenten Vorläuferzellen 7. Engagierte Knochenmarksvorläuferzellen MC sind in die Blutbahn und wandern in den peripheren Geweben zu lokalisieren überwiegend im Bindegewebe und Epithel-Oberflächen 8. Reifung und terminale Differenzierung werden schließlich unter dem Einfluss o erreichtf Zytokine innerhalb der umgebenden Milieu 8,9. MCs kann durch ein Allergen (Antigen, Ag), deren Zusammentreffen führte zur Erzeugung von Immunglobulin E (IgE) Antikörper vom Typ aktiviert werden. Die Bindung eines solchen IgE an den MC FcsRI Rezeptoren, gefolgt von Vernetzen des zellgebundenen IgE bei erneutem Kontakt zu derselben Ag, Ergebnis in FcsRI Aggregation und Einleitung einer Signalkaskade, die in Mastzelldegranulation gipfelt [in 10,11 Bewertung] . MCs werden ebenfalls aktiviert, unabhängig von IgE durch Neuropeptide 5,12, Toxine 13, bakterielle und virale Antigene, 14,15, eine Reihe von positiv geladenen Peptide kollektiv als Grund Sekretagoga, Immunzellen und Zytokinen 5,13,12,16 bezeichnet , 17. MCs werden auch von vielen ihrer eigenen freigesetzten Mediatoren, die weiter verstärken die entzündliche Reaktion aktiviert. MCs mit sekretorischen Granula (DMS), die Immun enthalten verpacktRegelungsmediatoren einschließlich vasoaktive Amine, wie Histamin und Serotonin (bei ​​Nagern), Proteoglykane, Proteasen, wie Chymosin und Tryptase, vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor und verschiedene Zytokine und Chemokine 8,9. Diese Mediatoren sind &quot;ready to go&quot; und einmal MCs werden durch einen geeigneten Stimulus aktiviert werden diese Mediatoren aus den Zellen durch Exozytose (Degranulation) in einer Angelegenheit von Sekunden bis Minuten 18,19 freigegeben. Diese erste Veranstaltung wird von der De-novo-Synthese und Freisetzung von einer großen Auswahl an biologisch wirksamer Stoffe, einschließlich Arachidonsäure-Metaboliten, mehrere Zytokine und Chemokine 20,21,22 gefolgt. Freisetzung von neu synthetisierten Produkte erfolgt unabhängig von SG-Release. Zusammengenommen sind diese Mediatoren initiieren frühen und späten Phase entzündliche und allergische Reaktionen. Daher Verständnis der Mechanismen Anteil von MC-Aktivierung und Degranulation sind beide von theoretischen und klinischen importance. Die Schwierigkeit genetisch zu manipulieren primären und kultiviert MCs hat die Versuche, die Mechanismen MC Degranulation zugrunde, die schlecht aufgelöste blieb Aufklärung behindert. Um dieses Problem zu überwinden, haben wir ein Reporter basierten Assay durch Co-Transfizieren des Schleimhaut-Mastzelllinie, Ratte Basophilenleukämie entwickelt (RBL) -2H3 (hierin als RBL bezeichnet) oder Knochenmark-abgeleitete (MCS BMMCs) 30 mit einem Gen von Interesse und Neuropeptid Y (NPY), fusioniert an monomeren RFP (mRFP) als SG Reporter. NPY wurde zuvor gezeigt, daß das Verhalten des endogenen SG Marker in anderen Systemen zu rekapitulieren. Da außerdem mRFP Fluoreszenz pH unempfindlich Expression von NPY-mRFP ermöglicht die Visualisierung der sauren SGs sowie quantitative Beurteilung der Exozytose durch Verwendung von 96-Well-Platten und einem Fluoreszenz-Plattenlesegerät. Wir haben gezeigt, dass NPY-mRFP ist mit den sauren SGs von RBL-Zellen und BMMCs geliefert und wird aus den Zellen freigesetztin einer regulierten Weise neben dem endogenen SG Ladung (dh β-Hexosaminidase und Serotonin) 30, 32. Dieses Protokoll bietet eine hochauflösende Bildgebung basierende Methodik, die Screening Gene von Interesse für ihre phänotypische und funktionelle Auswirkungen auf SG Eigenschaften und Degranulation in RBL-Zellen 32 erlaubt. Insbesondere ermöglicht dieses Protokoll in Echtzeit-Verfolgung von MC SGs und Quantifizierung von deren Fläche oder Volumen Größe, ihrer Zahl, Kinetik der Montage, ihre Bewegung entlang der Zelle Zytoskeletts und ihre endgültige Fusion mit der Plasmamembran unter verschiedenen Bedingungen. Beispielsweise Sensibilisierung der Zellen mit DNP-spezifische IgE und Triggerung der Zellen mit einer multivalenten Ag (DNP konjugiert Serumalbumin) unter verschiedenen Störungen (dh Knockdown von Genen von Interesse, über die Expression von wt oder mutierten Genen oder pharmakologischen Manipulationen) und im Vergleich zu Kontrollzellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="844">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:139px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:156px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:421px;">DMEM</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6046-500ML</td>
			<td style="width:156px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:128px;">GE health care Life sciences</td>
			<td>SH30071.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:128px;">Life technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Cellulose acetate membrane, pore size 0.22&#160;&#956;m</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS430769-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Corning tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Trypsin/EDTA Solution (TE)</td>
			<td style="width:128px;">Life technologies</td>
			<td>R001100</td>
			<td style="width:156px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">PIPES dipotassium salt</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">108321-27-3&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Calcium acetate hydrate</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>114460-21-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Magnesium acetate tetrahydrate</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">M5661&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate)</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4 mm electroporation cuvettes</td>
			<td style="width:128px;">cell projects</td>
			<td style="width:139px;">EP-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER &#38; CAPACITANCE</td>
			<td style="width:128px;">Bio rad</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chambered coverglass</td>
			<td style="width:128px;">Thermo scientific</td>
			<td align="right" style="width:139px;">155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">24 well, flat bottom</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Corning 96 well plates</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS3367 or CLS390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 well plate fluorescence reader- Infinite 200</td>
			<td style="width:128px;">Tecan</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium ionophore A23187</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">C7522</td>
			<td>Avoid from direct light exposure</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">P3766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-DNP monoclonal IgE</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8406&#160;</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNP-BSA/ DNP-HAS</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">A6661</td>
			<td>Avoid from direct light exposure</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Triton-x-100</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Confocal fluorescent microscope:</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Zeiss LSM 510</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Leica</td>
			<td style="width:128px;">SP5</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nikon A1 inverted</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Imaris software</td>
			<td style="width:128px;">BITLANE</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Microsoft exel or Prism or other analyses software</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Other reagent:</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">5833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Calcium chloride&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">2382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Glucose</td>
			<td style="width:128px;">BDH Laboratories</td>
			<td style="width:139px;">284515V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Monosodium phosphate&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">5345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Sterile water</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating mast cell secretory granules; from biosynthesis to exocytosis

Mastzellen (MC) sind sekretorische Zellen des Immunsystems, die den physiologischen und pathologischen Funktionen durch Lösen vorgeformt und neu synthetisierten allergischen, entzündlichen und immunMediaToren erreichen. MCs &quot;Mediatoren beeinflussen mehrere Gewebe und Organe ihren Höhepunkt in Allergien und Immunreaktionen. Die Synthese, Speicherung und Freisetzung der MC Mediatoren sind stark reguliert. Die vorgeformten Mediatoren in zytoplasmatischen sekretorischen Granula (SG), die mit der Plasmamembran verschmelzen und ihr Inhalt durch regulierte Exozytose verpackt. Wir stellen ein Protokoll, bezogen auf die Co-Expression eines Gens von Interesse mit einem Reportergen, das auf das SGs richtet ist und in einer geregelten Art und Weise entlang der endogenen Mediatoren freigesetzt SG. Das Protokoll ermöglicht hochauflösende vierdimensionalen konfokalen Analysen des MC SGs und Überwachung der Zeitleiste aus Biogenese ausgelöst Exozytose. Somit kann unter Verwendung dieses Protokolls zum Screenen Genen interest für ihre phänotypische und funktionelle Auswirkungen ermöglicht die Entschlüsselung der molekularen Mechanismen, die Biogenese und Exozytose des MC SGs zu regieren und die Ermittlung der Regulierungsbehörden beteiligt. Dabei sollten weitere Einblicke in die zellulären Mechanismen, die für die MCs Funktion in Gesundheit und Krankheit Konto zur Verfügung gestellt werden.

Wegen der geringen Transfektionseffizienz von MCs sind genetische Manipulationen kaum einen Einfluss auf die Messwerte von durchschnittlich Sekretion von endogenen Mediatoren gemessen SGs verlassen. Dennoch indem vollständige Co-Expression des Reportergens NPY-mRFP und der co-transfizierten Plasmid in die gleichen Zellen, die Überwachung der NPY-mRFP Ergebnisse der Überwachung ausschließlich der Zellpopulation, die das Gen von Interesse exprimiert. Daher ist der Vorteil dieses Assays im Vergleich zu herkömmlichen V...

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Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Das Ziel des vorliegenden Protokolls war es, eine Methode, die funktionelle Genomanalysen von Mastzellen Sekretion ermöglichen entwickeln wird. Das Protokoll basiert auf einer quantitativen Beurteilung der Freisetzung eines fluoreszierenden Reporter-Gen mit dem Gen von Interesse und den Echtzeit cotrasfected Analysen der sekretorischen Granula Morphologie.

Untersuchung Mast Cell Sekretgranula; von Biosynthese zu Exocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

investigating-mast-cell-secretory-granules-from-biosynthesis-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.0K Aufrufe.  Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University.  Das Ziel des vorliegenden Protokolls war es, eine Methode, die funktionelle Genomanalysen von Mastzellen Sekretion ermöglichen entwickeln wird. Das Protokoll basiert auf einer quantitativen Beurteilung der Freisetzung eines fluoreszierenden Reporter-Gen mit dem Gen von Interesse und den Echtzeit cotrasfected Analysen der sekretorischen Granula Morphologie. 

Serie: Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Klinische Anwendung der<em&gt; Dornröschen</em&gt; Und künstliche Antigen präsentierenden Zellen genetisch zu verändern T Zellen aus dem peripheren und Nabelschnurblut

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

Isolierung von Precursor B-Zell-Subsets aus Nabelschnurblut

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a process that results in the exocytosis of allergic mediators. Modulation of mast cell degranulation by drugs and toxicants may have positive or adverse effects on human health. Mast cell function has been dissected in detail with the use of rat basophilic leukemia mast cells (RBL-2H3), a widely accepted model of human mucosal mast cells3-5. Mast cell granule component and the allergic mediator &#946;-hexosaminidase, which is released linearly in tandem with histamine from mast cells6, can easily and reliably be measured through reaction with a fluorogenic substrate, yielding measurable fluorescence intensity in a microplate assay that is amenable to high-throughput studies1. Originally published by Naal et al.1, we have adapted this degranulation assay for the screening of drugs and toxicants and demonstrate its use here.
Triclosan is a broad-spectrum antibacterial agent that is present in many consumer products and has been found to be a therapeutic aid in human allergic skin disease7-11, although the mechanism for this effect is unknown. Here we demonstrate an assay for the effect of triclosan on mast cell degranulation. We recently showed that triclosan strongly affects mast cell function2. In an effort to avoid use of an organic solvent, triclosan is dissolved directly into aqueous buffer with heat and stirring, and resultant concentration is confirmed using UV-Vis spectrophotometry (using &#949;280 = 4,200 L/M/cm)12. This protocol has the potential to be used with a variety of chemicals to determine their effects on mast cell degranulation, and more broadly, their allergic potential.

Mast cell degranulation, the release of allergic mediators, is important in allergy, asthma, and parasite defense. Here we demonstrate techniques1 for assessing effects of drugs and toxicants on degranulation, methodology recently utilized to exhibit the powerful inhibitory effect of antibacterial agent triclosan2.

Ein Mikroplatten Assay Chemical Auswirkungen auf die RBL-2H3 Mastzelldegranulation bewerten: Effekte von Triclosan ohne Verwendung eines organischen Lösungsmittels

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

Visualisierung nichtlytischen Exozytose<em&gt; Cryptococcus neoformans</em&gt; Von Makrophagen mit digitalen Lichtmikroskopie

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such as skin, airways and gastrointestinal tract. Best known for their detrimental role in IgE-dependent allergic reactions, MCs have also emerged as important players in host defense against venom and invading bacteria and parasites. MC phenotype and function can be influenced by microenvironmental factors that may differ according to anatomic location and/or based on the type or stage of development of immune responses. For this reason, we and others have favored in vivo approaches over in vitro methods to gain insight into MC functions. Here, we describe methods for the generation of mouse bone marrow-derived cultured MCs (BMCMCs), their adoptive transfer into genetically MC-deficient mice, and the analysis of the numbers and distribution of adoptively transferred MCs at different anatomical sites. This method, named the &#8216;mast cell knock-in&#8217; approach, has been extensively used over the past 30 years to assess the functions of MCs and MC-derived products in vivo. We discuss the advantages and limitations of this method, in light of alternative approaches that have been developed in recent years.

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using &#039;Mast Cell Knock-in&#039; Mice

We describe a method for the generation of in vitro derived mast cells, their engraftment into mast cell-deficient mice, and the analysis of the phenotype, numbers and distribution of engrafted mast cells at different anatomical sites. This protocol can be used to assess the functions of mast cells in vivo.

Analysieren der Funktionen von Mastzellen in Vivo mit ' MastCell Knock-in' Mäuse

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Überexpression und Reinigung des Menschen<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase in<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic immune response. The activation of MCs via the cross-linking of surface IgE bound to high affinity IgE receptor (Fc&#949;RI), as well as through the stimulation of several other receptors, initiates the rise of the free intracellular Ca2+ level ([Ca2+]i) that promotes the release of inflammatory and allergic mediators. The identification of molecular constituents involved in these signaling pathways is crucial for understanding the regulation of MC function. In this article, we describe a protocol for the isolation of murine connective tissue type MCs by peritoneal lavage and cultivation of peritoneal MCs (PMCs). Cultures of MCs from various knockout mouse models by this methodology represent a useful approach to the identification of proteins involved in MC signaling pathways. In addition, we also describe a protocol for single cell Fura-2 imaging as an important technique for the quantification of Ca2+ signaling in MCs. Fluorescence-based monitoring of [Ca2+]i is a reliable and commonly used approach to study Ca2+ signaling events, including store-operated calcium entry, which is of utmost importance for MC activation. For the analysis of MC degranulation, we describe a &#946;-hexosaminidase release assay. The amount of &#946;-hexosaminidase released into the culture medium is considered as a degranulation marker for all three different secretory subsets described in MCs. &#946;-hexosaminidase can easily be quantified by its reaction with a colorigenic substrate in a microtiter plate colorimetric assay. This highly reproducible technique is cost-effective and requires no specialized equipment. Overall, the provided protocol demonstrates a high yield of MCs expressing typical MC surface markers, displaying typical morphological and phenotypic features of MCs, and demonstrating highly reproducible responses to secretagogues in Ca2+-imaging and degranulation assays.

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Here, we present a protocol to isolate and cultivate murine peritoneal mast cells. We also describe two protocols for their functional characterization: a fluorescent imaging of intracellular free Ca2+ concentration and a degranulation assay based on colorimetric quantification of the released &#946;-hexosaminidase.

Isolierung von Mastzellen Bauchfell abgeleitet und deren funktionelle Charakterisierung mit Ca2 +-imaging und Degranulation Assays

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high mortality, despite new therapeutic options such as transcatheter aortic valve replacement (TAVR). 
The complete pathways that start with valve calcification and lead to severe aortic stenosis remain only partly understood. By providing a close representation of the aortic valve cells in vivo, the assaying of T lymphocytes from stenotic valve tissue could be an efficient way to clarify their role in the development of calcification. After surgical excision, the fresh aortic valve sample is dissected in small pieces and the T lymphocytes are cultured, cloned then analyzed using fluorescence activated cell sorting (FACS).
The staining procedure is simple and the stained tubes can also be fixed using 0.5% of paraformaldehyde and analyzed up to 15 days later. The results generated from the staining panel can be used to track changes in T cell concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific T cell subtypes of interest. In this study, we show the isolation of T cells, performed on fresh calcified aortic valve samples and the steps of analyzing T cell clones using flow cytometry to further understand the role of adaptive immunity in CAVD pathophysiology.

In this study, we describe the process of T lymphocyte isolation from fresh samples of calcified aortic valves and the analytical steps of T cell-cloning for the characterization of the adaptive leukocyte subsets by using flow cytometry analysis.

Untersuchung der Aortenklappenverkalkung durch Isolierung und Kultur von T-Lymphozyten unter Verwendung von Feederzellen aus bestrahltem Buffy-Fell

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...

Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to obtain commercial monoclonal or polyclonal antibodies that recognize specific cell structures and proteins in parasites. Besides, there are few commercial antibodies available to label trypanosomatids. Usually, polyclonal antibodies against parasites are prepared in-house and could be more challenging to use in combination with other antibodies produced in the same species. Here, the protocol demonstrates how to use polyclonal and monoclonal antibodies raised in the same species to perform double labeling immunofluorescence to study host cell and pathogen interactions. To achieve the double labeling immunofluorescence, it is crucial to incubate first the mouse polyclonal antibody and then follow the incubation with the secondary mouse IgG antibody conjugated to any fluorochrome. After that, an additional blocking step is necessary to prevent any trace of the primary antibody from being recognized by the next secondary antibody. Then, a mouse monoclonal antibody and its specific IgG subclass secondary antibody conjugated to a different fluorochrome are added to the sample at the appropriate times. Additionally, it is possible to perform triple labeling immunofluorescence using a third antibody raised in a different species. Also, structures such as nuclei and actin can be stained subsequently with their specific compounds or labels. Thus, these approaches presented here can be adjusted for any cell whose sources of primary antibodies are limited.

Here, the protocol describes how to perform double labeling immunofluorescence using primary antibodies raised in the same species to study host-pathogen interactions. Also, it can include the third antibody from a different host in this protocol. This approach can be made in any cell type and pathogens.

Doppelmarkierung der Immunfluoreszenz unter Verwendung von Antikörpern derselben Spezies zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up Leishmania parasites by phagocytosis, consisting of recognizing ligands on parasite surfaces by multiple host cell receptors. Binding of Leishmania to macrophage membranes occurs through complement receptor type 1 (CR1) and complement receptor type 3 (CR3) and Pattern Recognition Receptors. Lipophosphoglycan (LPG) and 63 kDa glycoprotein (gp63) are the main ligands involved in macrophage-Leishmania interactions. Following the initial recognition of parasite ligands by host cell receptors, parasites become internalized, survive, and multiply within parasitophorous vacuoles. The maturation process of Leishmania-induced vacuoles involves the acquisition of molecules from intracellular vesicles, including monomeric G protein Rab 5 and Rab 7, lysosomal associated membrane protein 1 (LAMP-1), lysosomal associated membrane protein 2 (LAMP-2), and microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 (LC3).
Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells using confocal microscopy, including (i) binding (ii) internalization, and (iii) phagosome maturation. By adding to the body of knowledge surrounding these determinants of infection outcome, we hope to improve the understanding of the pathogenesis of Leishmania infection and support the eventual search for novel chemotherapeutic targets.

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

The mechanism associated with phagocytosis in Leishmania infection remains poorly understood. Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells.