The authors thank Mike Myles, Sam Saunders, and C.W. Elton at the ECU Multimedia &amp; Technology Services for providing assistance in video production. We acknowledge the grant support from North Carolina Biotechnology Center, Golfers against Cancer, Brody Brothers Endowment Fund, American Heart Association, and ECU/Vidant Cancer Research and Education Fund (L.V.Y. and M.J.R.).

1. Zellkultur Wundverschluss Assay <ol><li> Nehmen Zellen aus dem Gewebekulturplatte mit 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung. Pellet-Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen durch Zentrifugieren, Überstand absaugen und resuspendieren Zellen in Kulturmedien. Platte die entsprechende Anzahl von Zellen in einer 6-Well-Platte für 100% Konfluenz in 24 Stunden. Hinweis: Tests erforderlich sein, um die Zeit und die Anzahl der Zellen zu 100% Konfluenz durch den Zelltyp und der Größe der auch verwendet erzielen zu bestimmen (beispielsweise werden 1 x 10 6 B16F10-Melanomzellen in einer Vertiefung einer ausgesät 6-Well-Platte 24 Stunden vor der Wunde Generation). Alternativ kann 12-Well-oder 24-Well-Platten verwendet werden. Hinweis: Falls verfügbar, können Zellen in eine Kultur-Insert (von ibidi LLC) auf einer behandelten Gewebekulturplatte machen die Wunde vor, gegossen ausgesät werden. Ein Kultur-Einsatz kann die Oberfläche der Gewebekulturplatte vor Schäden zu schützen, indem der Pipettenspitze. Wenn eine Kultur-Insert weglassen Schritt verwendet1.2. </li><li> In einer sterilen Umgebung (typischerweise ein Biosicherheit Kapuze) verwenden einen 200 ul Pipettenspitze fest an der Spitze der Gewebekulturplatte drücken und schnell einen vertikalen Wunde durch die Zellschicht nach unten zu machen. Eine andere große Pipettenspitze verwendet werden, um die Wundgröße, die gewünscht wird zu machen. Verwenden Sie keine übermäßige Kraft auf die Gewebekulturplatte mit der Pipettenspitze, da sie die Oberfläche beschädigen. Wenn die Wunde vorgegossen, kann dieser Schritt weggelassen werden. </li><li> Vorsichtig absaugen Medien-und Zelltrümmer. Langsam genug, Kulturmedien gegen die Wand, um auch die Unterseite der gut decken und vermeiden Abnehmen zusätzliche Zellen. Nach der Erzeugung und Prüfung der Wunde ein Anfangsbild bestimmt werden können. Legen Sie die Gewebekulturplatte im Brutschrank bei der entsprechenden Temperatur und CO 2-Konzentration festgelegt (in der Regel 37 ° C und 5% CO 2). </li><li> Zu verschiedenen Zeitpunkten, z. B. alle 3 Stunden, entfernen Sie die Platte aus dem INCUBAToder und legen Sie es unter einem inversen Mikroskop, um eine Momentaufnahme zu nehmen und für den Wundverschluss zu überprüfen. Wenn Zeitraffer-Mikroskopie ist, nehmen Sie ein Foto jedes X Anzahl der Minuten (in der Regel beginnend mit je 5 Minuten) für jede Zeitdauer in einem Temperatur-und CO 2-gesteuerten Kammer. Je nach Zelltyp kann Wundverschlusszeit variieren. </li><li> Um die Ergebnisse des Snapshot-Bilder analysieren, messen Sie den Abstand von einer Seite der Wunde auf die andere mit einem Maßstab. Analysieren und eine klare Wundverschluss im Laufe der Zeit mit einem Streudiagramm oder ein Balkendiagramm zB Abbildung 1. </li><li> Um die Zeitrafferaufnahmen analysieren, importieren Sie die Bilder in der ImageJ Software (frei verfügbar http://rsb.info.nih.gov/ij/), um ein Video zu machen. Um diesen offenen ImageJ tun, klicken Sie auf Datei, Importieren und Bildsequenz. Suchen Sie die Datei mit Bildern; klicken Sie auf das erste Foto in der Datei. Sparen Sie Video, indem Sie Datei, Speichern unter, und AVI. Einzel wandernden Zellen kann beobachtet werden characterize gerichtete Bewegung. Ferner können morphologische Merkmale wie lamellipodia Bildung und Hinterkante sowie Rückzugssucht werden (Fig. 2 und zusätzlichen Video). </li></ol> 2. Transwell-Zellmigration und Invasion Assay <ol><li> In einer sterilen Umgebung (typischerweise ein Biosafety-Haube) lösen Zellen aus dem Gewebekulturplatte mit einer nicht-enzymatischen Zell Dissoziation Puffer oder 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung, Pellet-Zellen durch Zentrifugation, und saugen Sie die vorhandene Medien verlassen die pelletierten Zellen. Resuspendieren Zellen in serumfreiem Zellkulturmedium, enthaltend 0,1% BSA (Rinderserumalbumin). Hinweis: Je nach Zelllinie untersucht, 0,25% Trypsin-EDTA kann die Zellmigration und Invasion durch die Spaltung von verschiedenen Rezeptoren auf der Zelloberfläche 17 beeinträchtigen. Anmerkung: Die Anzahl der Zellen pro ml, hängt von der Größe der Zellen. Weitere Tests erforderlich sein, um eine Aussaatdichte, die pro findenVides die besten Ergebnisse. In der Regel 1 x 10 6 Zellen / ml ist ein guter Ausgangspunkt für die meisten Zelltypen bei der Verwendung der 24-Well-Transwell einfügen. Es gibt eine Reihe von Transwell Plattengrößen und dementsprechend sollte die Anzahl der Zellen zugegeben eingestellt werden. </li><li> Platte 100 ul Zelllösung auf der Filtermembran in einem Transwell-Einsatz und Inkubation für 10 Minuten bei 37 ° C und 5% CO 2, damit die Zellen, sich niederzulassen. Hinweis: Das bestimmte Porengröße der Transwell-Membran verwendet wird, hängt von der jeweiligen Größe der Zellen in der Probe. Zum Beispiel, wenn die Zellen zu klein sind, können sie durch die Poren, ohne die Notwendigkeit der Migration zu erleichtern oder übergeben, wenn sie zu groß sind, können sie nicht durch die Poren zu passen. Es gibt mehrere Transwell-Einsätzen mit Porengrößen zwischen 3 &amp;mgr; m reichen, 5 &amp;mgr; m und 8 &amp;mgr; m für die Zellmigrationsassays. Die Transwell-Einsätze sind von Firmen wie Corning im Handel erhältlich. Hinweis: Die Transwell migration Test kann leicht modifiziert, um die Zellinvasion Assay durchzuführen. Um dies zu tun, fügen extrazellulären Matrix (ECM)-Materialien auf der Oberseite des Transwell-Membran und fügen Zellen auf der ECM. Zum Beispiel wird Matrigel aufgetaut und auf Eis verflüssigt und dann 30-50 &amp;mgr; l Matrigel ist eine 24-Well Transwell zugegeben einfügen und verfestigt, in einem 37 ° C Inkubator für 15-30 Minuten, um eine dünne Gelschicht bilden. Zell-Lösung wird auf der Oberseite der Beschichtung zugegeben Matrigel Invasion durch die extrazelluläre Matrix zu simulieren. Hinweis: Es gibt deutliche Unterschiede zwischen dem Transwell-Zellmigration und Zellinvasion der Transwell-Assays. Die Transwell-Zellmigration Test misst die Fähigkeit von Zellen chemotaktisch zu einer Chemo-Lockstoff. Die Transwell-Zellinvasionstest, jedoch werden sowohl die Chemotaxis und die Invasion von Zellen durch die extrazelluläre Matrix, ein Verfahren, das häufig bei der Krebsmetastasierung oder der Embryonalentwicklung gefunden wird. </li><li> Mit einer Pipette sehr CAREFUlly hinzufügen 600 ul der gewünschten chemo-Lockstoff in den Boden der unteren Kammer in einer 24-Well-Platte. Fügen Sie die chemo-Lockstoff, ohne den Transwell-Einsatz und Erzeugen von Blasen zu vermeiden. Sicherstellen, dass der Chemo-Lockstoff Flüssigkeit am Boden und in Kontakt mit der Membran in dem oberen und einen chemotaktischen Gradienten bilden. Inkubationszeit hängt vom Zelltyp und der chemo Lockstoff verwendet werden. Hinweis: Weitere Tests erforderlich sein, um die Inkubationszeit zu bestimmen. Anmerkung: Für adhärente Zellen, werden die migrierten Zellen auf die andere Seite der Membran 1,8 befestigen. Die Quantifizierung der migrierten Zellen folgende Schritte 2,4 bis 2,8 (2,4-2,8 Schritte müssen nicht in einer sterilen Umgebung durchgeführt werden) durchgeführt werden. Für nicht-adhärente Zellen werden die gewanderten Zellen in das Medium in der unteren Kammer fallen. Die Anzahl der migrierten Zellen kann durch die Verwendung Hämozytometers oder gezählt werden Durchflusszytometer 5. </li><li> Entfernen Sie die Transwell-Einsatz von der Platte. Verwenden Sie ein Wattestäbchen so oft wie nötig, um vorsichtig die Medien und die übrigen Zellen, die nicht von der Spitze der Membran ohne es zu beschädigen migriert haben. </li><li> In 600-1.000 ul 70% Ethanol in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte. Platzieren Sie den Transwell-Einsatz in das 70% Ethanol für 10 Minuten, um Zellfixierung zu ermöglichen. Entfernen Transwell-Einsatz aus der 24-Well-Platte und mit einem Wattestäbchen, um die verbleibende Ethanol aus der Oberseite der Membran zu entfernen. Lassen Sie die Transwell-Membran (in der Regel 10-15 Minuten) trocknen. </li><li> In 600-1.000 ul von 0,2% Kristallviolett in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte und die Position der Membran in das für die Färbung. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5-10 Minuten. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Kristallviolett von der Oberseite der Membran mit einer Pipettenspitze oder Wattestäbchen. Ganz vorsichtig, um zu vermeiden, Abwaschen fixierten Zellen, tauchen die Membran in destilliertem Wasser so oft wie nötig, um das überschüssige Kristall viole entfernent. Damit die Transwell-Membran zu trocknen. </li><li> Ansicht unter einem Umkehrmikroskop und die Anzahl von Zellen in unterschiedlichen Sicht auf eine durchschnittliche Summe der Zellen, die durch die Membran in Richtung des chemo Lockstoff migriert und auf der Unterseite der Membran (Fig. 3) befestigt haben, zu erhalten. </li></ol>

<ol>
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The authors declare that they have no competing financial interests.

Zellmigration ist ein wichtiger Aspekt in der Krebsforschung untersuchen und es kann auch auf Entwicklungs-, immunologische und Wundheilungsstudien eingesetzt werden. Die Zellkultur-Assay Wundverschluss und die Transwell-Zellmigration und Invasion Assays zeigen detaillierte Informationen von Zellmigrationsverhalten und können verwendet werden, um die molekularen Mechanismen der Zellmigration 1,2,10,14 untersuchen. Unsere Studie verwendet diese Zellbeweglichkeit Tests, um die Migrationsgeschwindigkeit und Inv...

Beweglichkeit ist ein wesentliches Merkmal von lebenden Zellen. Die Zellmigration wird in der Konzeption des Lebens, Embryonalentwicklung, Immunantwort und vielen pathologischen Prozessen wie Krebsmetastasen und Entzündungen 9.1 beteiligt. Daher sind Verfahren zur Zellmigrationsverhalten zu studieren sind sehr nützlich, Forschungsinstrumente für ein breites Spektrum von Disziplinen in den biomedizinischen Wissenschaften, Biologie, Biotechnologie und verwandten Bereichen. Die Untersuchung der Zellmigration in der Krebsforschung von besonderem Interesse ist, wie die Hauptursache für Tod bei Krebspatienten ist metastasierendem Progression stehen. Um für Krebs zu verbreiten und im ganzen Körper verbreiten, müssen Krebszellen wandern und dringen durch die extrazelluläre Matrix (ECM), intravasate in den Blutkreislauf, bringen zu einem entfernten Ort, und schließlich extravasieren in ferne 1,10-12 Herde bilden. Verschiedene biologische Verfahren eingesetzt werden, um diese Ereignisse im Detail zu untersuchen. Die Zellkultur Wundverschluss eind. die Transwell Migration und Invasion Assays sind weit verbreitet in der wissenschaftlichen Gemeinschaft 1,10 verwendet. Diese Tests können die erforderlichen Daten, die für ein Verständnis dafür, wie gut ein bestimmter Zelltyp kann spontan migrieren oder reagieren auf eine Chemo-Lockstoff und gerichtet auf sie zu migrieren lassen können vorsehen. Mehrere wandernde Phänotypen wurden beschrieben. Zellen können in einer einzelnen Zelle Form, wie in mesenchymalen oder amöbenartige Bewegung oder mehrzelligen kollektive Bewegung oder Migration Zelle Streaming-13 markierten gesehen migrieren. Die Methode der Bewegung in bewegliche Zellen verwendet werden, können leicht beobachtet werden, mit Hilfe der Zellkultur Wundverschluss-Assay. Unter den vielen Möglichkeiten, um Zellmigration zu untersuchen, ist die Zelle Wundverschluss Assay eine der einfachsten. Dieses Verfahren ist nützlich, um die Migrationsfähigkeit der gesamten Zellmassen zu bestimmen. Wenn ein Schritt weiter kann es verwendet werden, um morphologische Merkmale einzelnen Zelle während der Migration 14 zu beobachten. Nach der Analyse der Wundverschluss viele Phänotypen offenbar werden. Die Messung des geschlossenen Abstand im Laufe der Zeit, wenn im Vergleich zu einer Kontrolle kann die spezifische Migration Änderungen oder eine gestörte Migrations Phänotyp, die bisher unbekannt war, zu offenbaren. Darüber hinaus können einzelne Zelle Lamellipodium Bildung, Schwanz Rückzug und gerichtete Bewegung Anhaltspunkte für das, was kann beeinträchtigt oder verstärkt werden in den Zellen von Interesse 14 zu geben. Die Transwell-Migration und Invasion Assays können verwendet werden, um die Fähigkeit von einzelnen Zellen gerichtet auf verschiedene Chemolockstoffe antworten, ob sie Chemokine, Wachstumsfaktoren, Lipide, Nukleotide oder 4,5,8,15,16 sind zu analysieren. Ferner kann es Differentialmigrationsfähigkeit aufgrund der Überexpression des Rezeptors 1,14. Diese Assays können auch zur Identifizierung und Charakterisierung der wichtigsten Regulatoren der Zellmigration, wie der Rho-Familie von GTPasen 2 werden. Nach dieser kurzen und leicht zugänglichlich Tests, der Art der Zellmigration und die Fähigkeit einer Zelle, die in ein 3-D-Matrix eindringen kann auch bestimmt werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="601">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:169px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td style="width:133px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">11995-073</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:169px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:133px;">Gemini</td>
			<td style="width:107px;">100106</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:169px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">A4503-50G</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:169px;">Trypsin EDTA 0.25%</td>
			<td style="width:133px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">25200-056</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:169px;">Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS)</td>
			<td style="width:133px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">14190-250</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:169px;">Crystal violet</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">C0775-100G</td>
			<td style="width:193px;">Dissolved in water at 0.2%</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:169px;">Cell disassociation buffer</td>
			<td style="width:133px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">13151-014</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:169px;">Cell culture incubator</td>
			<td style="width:133px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:193px;">Model # 3145</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:169px;">SterilGARD biosafety hood</td>
			<td style="width:133px;">The Baker Company, Inc.&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:193px;">Model # VBM-600</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:169px;">EVOS Fl inverted microscope</td>
			<td style="width:133px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:193px;">Model # AMF-4302-US</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:169px;">Tissue culture plate</td>
			<td style="width:133px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:107px;">353046</td>
			<td style="width:193px;">Catalog number varies depending on the type of culture plate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="63" rowspan="2" style="height:63px;width:169px;">Corning Transwell insert</td>
			<td rowspan="2" style="width:133px;">Fisher</td>
			<td rowspan="2" style="width:107px;">07-200-150</td>
			<td rowspan="2" style="width:193px;">Catalog number varies depending on the pore size of the membrane</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro cell migration and invasion assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

Der Wundverschluss und die Transwell-Assay Zellmigrationsassay hier vorgestellt wurden mit Maus B16F10 Melanom-Zellen als Modellsystem. In der Wundverschluss Assay wurden B16F10-Zellen in einer 6-Well-Gewebekulturplatte ausgesät und bis 100% Konfluenz von 24 Stunden gezüchtet. Eine Wunde von etwa 700 um breit wurde mit einer Pipettenspitze und der Wundverschluss (Zellwanderung) wurde mit der Zeitraffer-Mikroskopie aufgenommen erzeugt. Alternativ kann auch durch Wundverschluss unter Snapshot-Bilder zu verschiedenen Zei...

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In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Häufig verwendet werden, sind sehr zugänglich Methoden zur Untersuchung der Zellmigration und Invasion in vitro beschrieben. Das erste Verfahren ist die Zelle Wundverschluss Assay misst die Zellbeweglichkeit. Die zweite Methode ist die Transwell-Migration und Invasion Assay, der die chemotaktische und invasive Kapazität der Zellen beurteilt.

In-vitro-Zellmigration und Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

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137.2K Aufrufe.  East Carolina University.  Häufig verwendet werden, sind sehr zugänglich Methoden zur Untersuchung der Zellmigration und Invasion in vitro beschrieben. Das erste Verfahren ist die Zelle Wundverschluss Assay misst die Zellbeweglichkeit. Die zweite Methode ist die Transwell-Migration und Invasion Assay, der die chemotaktische und invasive Kapazität der Zellen beurteilt. 

Serie: In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, biofilms can reduce industrial productivity, destroy structures, and threaten human life. 1-3 On the other hand, harnessing the power of biofilms can help clean the environment and generate sustainable energy. 4-8
The ability of S. cerevisiae to colonize surfaces and participate in complex biofilms was mostly ignored until the rediscovery of the differentiation programs triggered by various signaling pathways and environmental cues in this organism. 9, 10 The continuing interest in using S. cerevisiae as a model organism to understand the interaction and convergence of signaling pathways, such as the Ras-PKA, Kss1 MAPK, and Hog1 osmolarity pathways, quickly placed S. cerevisiae in the junction of biofilm biology and signal transduction research. 11-20 To this end, differentiation of yeast cells into long, adhesive, pseudohyphal filaments became a convenient readout for the activation of signal transduction pathways upon various environmental changes. However, filamentation is a complex collection of phenotypes, which makes assaying for it as if it were a simple phenotype misleading. In the past decade, several assays were successfully adopted from bacterial biofilm studies to yeast research, such as MAT formation assays to measure colony spread on soft agar and crystal violet staining to quantitatively measure cell-surface adherence. 12, 21 However, there has been some confusion in assays developed to qualitatively assess the adhesive and invasive phenotypes of yeast in agar.
Here, we present a simple and reliable method for assessing the adhesive and invasive quality of yeast strains with easy-to-understand steps to isolate the adhesion assessment from invasion assessment. Our method, adopted from previous studies, 10, 16 involves growing cells in liquid media and plating on differential nutrient conditions for growth of large spots, which we then wash with water to assess adhesion and rub cells completely off the agar surface to assess invasion into the agar. We eliminate the need for streaking cells onto agar, which affects the invasion of cells into the agar. In general, we observed that haploid strains that invade agar are always adhesive, yet not all adhesive strains can invade agar medium. Our approach can be used in conjunction with other assays to carefully dissect the differentiation steps and requirements of yeast signal transduction, differentiation, quorum sensing, and biofilm formation.

We describe a qualitative assay for yeast adhesion and agar invasion as a measure of invasive and pseudohyphal differentiation. This simple assay can be used to assess the invasive phenotype of various mutants as well as the effects environmental cues and signaling pathways on yeast differentiation.

Assay für Adhäsion und Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Forschung

Biologie

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

Neurocircuit Assays für Anfällen bei Epilepsie Mutanten Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to both secrete proteases that break down the basement membrane as well as migrate in order to be invasive. BD BioCoat Tumor Invasion System provides cells with conditions that allow assessment of their invasive property in vitro1,2. It consists of a BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert Plate with an 8.0 micron pore size PET membrane that has been uniformly coated with BD Matrigel Matrix. This uniform layer of BD Matrigel Matrix serves as a reconstituted basement membrane in vitro providing a true barrier to non-invasive cells while presenting an appropriate protein structure to study invasion. The coating process occludes the pores of the membrane, blocking non-invasive cells from migrating through the membrane. In contrast, invasive cells are able to detach themselves from and migrate through the coated membrane. Quantitation of cell invasion can be achieved by either pre- or post-cell invasion labeling with a fluorescent dye such as DiIC12(3) or calcein AM, respectively, and measuring the fluorescence of invading cells. Since the BD FluoroBlok membrane effectively blocks the passage of light from 490-700 nm at &gt;99% efficiency, fluorescently-labeled cells that have not invaded are not detected by a bottom-reading fluorescence plate reader. However, cells that have invaded to the underside of the membrane are no longer shielded from the light source and are detected with the respective plate reader. This video demonstrates an endpoint cell invasion assay, using calcein AM to detect invaded cells.

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

This video demonstrates how to measure cell invasion through cell culture inserts using a fluorescence-based methodology.

Ein In-vitro- FluoroBlok Tumor Invasion Assay

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Schnelle Homogene Detektion von biologischen Assays mit magnetischen Modulation Biosensorik-System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

Analyse von Schwann-Astrozyten Wechselwirkungen mit In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer's disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Unmodified and hyperphosphorylated tau proteins were used in two in vitro aggregation assays to reveal the hyperphosphorylation-dependent fast aggregation kinetics. These assays pave the way for future screens for compounds that can modulate the propensity of hyperphosphorylated tau to form fibrils that underlie the progression of Alzheimer&#8217;s disease.

In-vitro-Assays mit Aggregation hyperphosphoryliertem Tau Protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Verfahren zur Haut Verwundung und Assays für Wound Antworten in<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

Die Quantifizierung der Endothelial Cell Haftfähigkeit<em&gt; In-vitro-</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity greatly impacts cell behavior to regulate normal and pathologic processes including cell proliferation, differentiation, adhesion signaling and directional migration. In this regard, the innate ability of certain cell types to migrate towards a stiffer, or less compliant matrix substrate is referred to as durotaxis. This phenomenon plays an important role during embryonic development, wound repair and cancer cell invasion. Here, we describe a straightforward assay to study durotaxis, in vitro, using polydimethylsiloxane (PDMS) substrates. Preparation of the described durotaxis chambers creates a rigidity interface between the relatively soft PDMS gel and a rigid glass coverslip. In the example provided, we have used these durotaxis chambers to demonstrate a role for the cdc42/Rac1 GTPase activating protein, cdGAP, in mechanosensing and durotaxis regulation in human U2OS osteosarcoma cells. This assay is readily adaptable to other cell types and/or knockdown of other proteins of interests to explore their respective roles in mechanosignaling and durotaxis.

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.

Ein vereinfachtes System zur Bewertung der Zell Mechanosensing und Durotaxis<em&gt; In-vitro-</em

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity ...

A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between cells, the extracellular matrix, and soluble and non-soluble chemical factors (e.g., chemoattractants). Standard methods for measuring the migration of cells, such as the Boyden chamber assay, work by counting cells on either side of a divider. These techniques are easy to use; however, they offer little geometric modification for different applications. In contrast, microfluidic devices can be used to observe cell migration with customizable concentration gradients of soluble factors1,2. However, methods for making microfluidics based assays can be difficult to learn.
Here, we describe an easy method for creating cell culture chambers to measure cell migration in response to chemical concentration gradients. Our cell migration chamber method can create different linear concentration gradients in order to study cell migration for a variety of applications. This method is relatively easy to use and is typically performed by undergraduate students.
The microchannel chamber was created by placing an acrylic insert in the shape of the final microchannel chamber well into a Petri dish. After this, poly(dimethylsiloxane) (PDMS) was poured on top of the insert. The PDMS was allowed to harden and then the insert was removed. This allowed for the creation of wells in any desired shape or size. Cells may be subsequently added to the microchannel chamber, and soluble agents can be added to one of the wells by soaking an agarose block in the desired agent. The agarose block is added to one of the wells, and time-lapse images can be taken of the microchannel chamber in order to quantify cell migration. Variations to this method can be made for a given application, making this method highly customizable.

This protocol details a customizable method to measure cell migration in response to chemoattractants that may also be used to determine the diffusion rate of a drug out of a polymer matrix.

Eine Anpassbare Kammer zur Messung der Zellmigration

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between ...