Needle wounding methods for C. elegans were first developed by Nathalie Pujol and Jonathan Ewbank; we thank Nathalie Pujol for comments on the manuscript. Work in our laboratory on C. elegans epidermal wound repair is supported by a grant from the NIH to A.D.C. (R01 GM054657).

Die folgenden Protokolle beschreiben die detaillierte Prozedur für C. elegans Haut zu verletzen und zum Testen von Wundreaktionen. 1. Nadel Verwundung 3,4 <ol><li> Wachsen gesunde unstarved Würmer auf Standard NGM (Nematoden Wachstumsmedium) Platten mit E. coli OP50 Bakterien als Nahrung, in einem 20 ° C Inkubator gehalten. HINWEIS: Methoden für die NGM-Agar-Platten und Routine Anbau von C. elegans kann www.wormbook.org 6. </li><li> Wählen Sie 25 L4-Stadium Würmer zu einer frisch ausgesät Platte 1 Tag vor Verwundung und Kultur bei 20 ° CO / N. </li><li> Vor der Verwundung, ziehen Nadeln aus Kapillaren mit einer Nadel Magnet. Die in Verwundung verwendeten Nadeln identisch mit denen für die Mikroinjektion von C verwendet werden elegans. </li><li> Stellen Sie sicher, dass alle Würmer sind bei jungen Erwachsenen Bühne. Die Platte von Würmern auf Eis für ca. 30 min. Kühlung bewirkt, dass die Tiere träge zu sein, erleichtert Nadel Verwundung. <br /&gt; Hinweis: Innerhalb von 5 Minuten von der Entnahme aus dem Eis, werden die Würmer Zeiger sich normal bewegen. Es ist möglich, aber schwierig zu bewegenden Würmern aufgewickelt. Mit der Erfahrung, ist 5 Minuten genügend Zeit, um 25 Würmer gewickelt. Immobilisieren mit Medikamenten wie Levamisol (wie in Laser Verwundung verwendet, siehe unten), auch wenn Tiere wird länger dauern, sich zu erholen. </li><li> Entfernen Sie die Agar-Platte aus dem Eis zu einem Präpariermikroskop Stereomikroskop. Mit einem Pick-Wurm, verschieben 25 Würmer in der Mitte der Agar-Platte. </li><li> Stecken Sie die Nadel in einen 100 ul Pipettenspitze leichter halten Sie die Nadel. Punktion der vorderen oder hinteren Teil des Körpers der Schnecke mit der Nadel, die Vermeidung der Gonaden. Im allgemeinen versuchen, zwischen der hinteren Rachen und vorderen Gonade, oder zwischen dem hinteren Gonade und Rektum gewickelt. Wiederverwendung Nadeln mehrmals, bis sie brechen. HINWEIS: Achten Sie darauf, die Wunden sind kurze, sanfte Stiche, die die Nagelhaut und die Haut durchbohren, durchdringen ~ 5-10 um in das Tier. Die Nadel sollte das anim eingebenal ungefähr in einem rechten Winkel zu der Haut. Die Wunden sollten nicht dazu führen, offensichtlich Schäden an inneren Organen oder unmittelbaren Bruch des Körpers. Beachten Sie eine kleine Menge von Cytoplasma Nässen aus für ein paar Sekunden nach der Wunde; Wenn jedoch Zellinhalt austreten kann über einen längeren Zeitraum die Tiere nicht überleben. Für eine optimale Bildgebung, Wund die seitliche epidermalen Syncytium (hyp7) oder die seitliche Naht. HINWEIS: Dieses Verfahren umfasst die Verwendung einer Glasnadel. </li><li> Lassen Würmer bei RT bei 20 ° C zu erholen, dann Kultur. Beurteilen den Erfolg der Nadel Verwundung von einer Reihe von unten beschriebenen Assays. Mehr als 95% der Wildtyp-Tiere überleben 24 h nach der Nadel zu verletzen im jungen Erwachsenenstadium. Die Wirkung der Verwundung in Larven oder älteren Erwachsenen ist noch nicht umfassend untersucht. </li></ol> 2. Laser Verwundung 3 Verwenden Femtosekunden-Laserstrahlung (800 nm), um genauere Verwundung durchzuführen. <ol><li> Bereiten Agar pAnzeigen auf einem Objektträger mit geschmolzenem 2% Agar 7. Achten Sie darauf, die Pads ähnlich wie die Agar-Pads für die Live-Darstellung von C verwendet werden, elegans. </li><li> Übertragen Sie 10 jungen erwachsenen Würmer auf den Agarose-Pad mit Wurm holen, und fügen Sie ein 2 ul Tropfen 12 mM Levamisol Lösung. Decken Sie die Tiere und die Flüssigkeit mit einem Deckglas. Warten Sie 1-2 Minuten für die Würmer zu lähmen. </li><li> Legen Sie die Objektträger auf eine sich drehende Scheibe konfokalen Mikroskop. Bewegen Sie die Bühne, um die Würmer zu finden und sich auf den seitlichen vorderen oder hinteren Syncytial Epidermis mit einer 100X Objektiv (NA 1,4 bis 1,46). </li><li> Stellen Sie die Macht der Femtosekundenlaser bis 140 mW (gemessen vor dem Ziel). Verwenden der Femtosekundenlaser mit einer Wiederholungsrate von 80 MHz. HINWEIS: Zwei Pulse von 200 msec je (von 20 ms getrennt) sind ausreichend für Verwundung in unseren Händen. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf der apikalen Oberfläche der epidermalen Zell und Wund die Epidermis. Beachten Sie die örtlichen Störung des Zytoplasma (Blasenbildung), oder lokale Bleich of jeder Fluoreszenzmarker eingesetzt. HINWEIS: Befolgen Sie die entsprechenden Lasersicherheitsverfahren bei der Verwendung des Femtosekundenlaser. Linien- oder Punkt Scans mit Femtosekundenlasern, wie sie in zwei Photonenmikroskope sollte ausreichend Leistung für die Laser Verwundung bereitzustellen. HINWEIS: Während wir keine direkte Erfahrung mit anderen Lasern im Prinzip Verwundung sollte möglich sein, mit konventionellen UV-Laser (wie verwendet in C. elegans Zelle Ablationen). Optional können Sie eine Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) Modul auf Spinning-Disk-konfokale um die Epidermis (N. Pujol, persönliche Mitteilung) aufgewickelt. </li></ol> 3. Visualisierung von Epidermal Ca 2+ Responses to Verwundung <ol><li> Verwenden transgenen C. elegans-Stämme, die Ca 2+ Sensoren (wie beispielsweise solche der GCaMP Reihe) in der Epidermis exprimieren, unter der Kontrolle des Erwachsenen epidermalen spezifischen Promotor col-19 (1A; Transgene aufgeführt <strong&gt; Tabelle 1). Verwenden ein Transgen ein rotes Fluoreszenzprotein exprimieren, wie tdTomato als interne Kontrolle für die Transgen-Expressionsniveau. Anmerkung: Wir haben tdTomato als interne Kontrolle für die Expression des Transgens verwendet werden, wie epidermaler tdTomato Fluoreszenz relativ stabil ist und nicht mit GCaMP Abbildungs ​​stören. </li><li> Sowohl Nadel und Laser Verwundung Trigger Ca 2+ Erhebung in der Epidermis. Als Nadel Verwundung nicht ohne weiteres auf einer sich drehenden Scheibe konfokalen geführt werden, ist jedoch Laser Verwundung bevorzugt für die quantitative Analyse des Ca 2+ Antwort (Abbildung 1). </li><li> Erwerben Sie Zeitreihen-Aufnahmen in mehrdimensionalen Erfassungsmodus (Intervallzeit 2 s mit 114 ms Erregungslaserbelichtung) mit einer sich drehenden Scheibe konfokalen mit 100X Objektiv (NA 1,4 bis 1,46) und geeigneter Filtersätze (GFP Filter für GCaMP3 funktionieren). HINWEIS: Erwerben Sie Zeitraffer-Aufnahmen alle 30 Sekunden für ca. 2 Stunden, um die Ca 2+ bzw. prüfenonse zu verwunden über einen längeren Zeitverlauf. </li><li> Verwendung von Bildanalysesoftware messen die durchschnittliche GCaMP Fluoreszenz in Zehn-Äquivalent Regionen von Interesse (ROI), von denen fünf auf der epidermalen Zellcytosol und fünf im Hintergrund zentriert. </li><li> Erhalten Fluoreszenzbasis (F 0) durch Mitteln Fluoreszenz in 5 ROIs in der Epidermis dann Subtrahieren der Durchschnitt von 5 ROIs im Hintergrund vor Verletzung. Drücken die Fluoreszenzänderung &amp; Dgr; F als Verhältnis der Änderung gegenüber der Basislinie [(F t F 0) / F 0]. </li></ol> 4. Visualisierung von F-Actin Dynamics Nach Verwundung <ol><li> HINWEIS: Als Reaktion auf die Nadel Verwundung, beobachten eine Aktin-Ring an der Wundstelle, die nach und schließt sich um die Wunde. Diese Protokollabschnitt Assays Wundverschluss durch Messung der Aktin-Ringdurchmesser. </li><li> Gene transgenen Würmer, die eine F-Aktin-Marker Eil wie Drosophila Moesin Aktin-Bindedomäne fusioniertGFP, exprimiert unter der Kontrolle eines Epidermis-spezifischen Promotor, wie col-19 (2A) (Transgen juIs352). HINWEIS: Wir haben ähnliche Ergebnisse mit anderen Aktin-Bindedomäne Marker wie LifeAct oder F-tractin (unveröffentlichte Ergebnisse) erhalten. </li><li> Führen Nadel Verwundung auf P col-19-GFP-Moesin transgenen Würmer. Nach Nadel Verwundung, beobachten einen Ring von GFP-Moesin um die Wunde von ca. 5 min. Die Aktin-Ring kleiner im Durchmesser und schließlich schließt 2-3 Stunden nach der Verwundung in Wildtyp-Tiere (Abbildung 2A). </li><li> Bereiten Sie eine 2% Agar-Pad auf einem Glasträger und übertragen 10 Würmer auf das Pad in 2 ul 12 mM Levamisol Lösung. Bild der GFP-Moesin Ringe 1 Stunde nach der Verletzung mit herkömmlichen konfokalen Mikroskopie. HINWEIS: Die Verwendung der konfokalen Mikroskopie, um z-Stapel (13 x 0,5 um) von Aktin-Ringe 1 Stunde nach der Verletzung zu erwerben. </li><li> Messen Sie die Aktin-Ringdurchmesser nach der Verwundung. Zur Quantifizierung epidermalen GFP-Moesin, zuerst eine maximale Intensität Projektion der Z-Stapel und ziehen 4 Linien-Scans (bei 45 ° zueinander) über die GFP-Moesin Ring. Ringdurchmesser wird als die mittlere Spitze-Spitze-Abstand der vier Zeilenabtastungen (2B) definiert ist. Für Ringe, die bereits geschlossen haben, wird der Durchmesser als 0 &amp; mgr; m definiert. HINWEIS: F-Actin-Ringe sind bequem gemessen 1 h nach der Verwundung, da dies etwa auf halbem Weg durch den Wundverschluss Prozess im Wildtyp. F-Actin-Ringe können auch zu mehreren Zeitpunkten gemessen werden, um einen zeitlichen Verlauf des Wundverschlusses abzuleiten. Zeitraffer-Filme des Wundverschlusses kann mit Levamisol-immobilisiert Würmer und Spinning-Disk-konfokale Mikroskopie erworben werden. </li></ol> 5. Assay Induktion von Epidermal antimikrobielle Peptide HINWEIS: Verwundung löst auch angeborenen Immunantwort in der C elegans Haut. Transkription von Genen, antimikrobielle Peptide (AMP) kodiert, indin der Epidermis uced. Die NLP-29 (Neuropeptid-like protein) AMP ist stark durch Verwundung 4 induziert. Um zu untersuchen, wie sich die Epidermis steuert AMP Expression nach Verwundung, verwenden transgenen Reporter oder Echtzeit-PCR, einzelne AMP Transkriptniveaus erkennen. <ol><li> Transgene Reporter-Assay für die angeborene Immunantwort zu verwunden 4. </li><li> Führen Nadel Verwundung (wie in Protokoll 1) an erwachsenen Tieren die transgenen Reporter frIs7, die P nlp-29- GFP und P col-12-DsRed als interne Kontrolle enthält auszudrücken. Beachten unverwundete erwachsenen Tieren so dunkel rot oder orange in einer GFP-Langpassfilter. HINWEIS: Verwundung Wildtyp-Würmer P nlp-29 -GFP Expression zu induzieren, jedoch nicht auf P col-12 -dsRed, was zu Würmern, orange, gelb, grün oder unter GFP langen Pass Beleuchtung angezeigt. Der Verlust der Funktion von Genen in der p38 MAPK-Weg, wie Tempel-1 oder NSY-1 blockieren nlp-29 -GFPInduktion nach Verwundung 4. P nlp-29- GFP wird in großen Mengen in Larvenstadien exprimiert </li><li> Führen AMP Induktionsassays in reife junge Tiere. Stellen Sie sicher, dass unverletzten Kontrolltiere haben geringe Mengen an GFP. HINWEIS: P nlp-29- GFP-Expression wird auch durch osmotischen Stress 8 induziert, wobei jedoch auch andere Umwelteinflüsse sein. </li><li> 6 Stunden nach der Verwundung, punkten die Anzahl der Würmer, die P-29 nlp -GFP Induktion (Abbildung 3) 9 mit einem Fluoreszenz Binokular mit GFP Langpassfilter haben. HINWEIS: Bei 1 Stunde nach der Verwundung P nlp-29- GFP sichtbar induziert und erreichte einen Höchststand von 6 Stunden nach der Verwundung und dann bleibt bis zu 24 Stunden nach der Verletzung erhöht. Quantifizieren Ausdruck durch visuelle Scoring 4,9. Alternativ zu quantifizieren Expressionsniveaus mit Hilfe eines Fluoreszenz-aktivierten Wurm Sortierer 4. Für die Schneckensortierer, müssen mindestens 50 Tieren, die verletzt werden. </li><li> Echtzeit-PCR-Assay für quantitating Transkriptniveaus der einzelnen AMP-Gene. Assay Transkriptionsniveaus für mehrere Gene: NLP-29, NLP-30, CNC-1 und CNC-5. </li><li> Führen Nadel Verwundung auf Wildtyp oder mutierten Würmer (siehe Protokoll 1) </li><li> Sammeln Sie 50 verwundet Würmer und 50 unverwundete Würmer zu den gewünschten Zeiten (zB 3, 6, 24 Stunden) nach der Verwundung. </li><li> Extrahieren RNA unter Verwendung eines kommerziellen Kits nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Führen Sie die reverse Transkription zu insgesamt 20 ul cDNA erhalten unter Verwendung eines kommerziellen Reverse-Transkriptase-Kit. </li><li> Für die RT-PCR, verwendet 0,2 ul cDNA (1/40) von jeder Probe in Kombination mit einem grünen supermix mit Fluorescein und 0,2 uM Primer. Um RNA-Qualität zu vergleichen, verwenden ama-1 oder snb-1-RT-PCR als Referenz; Vergleichen Sie die relativen Expressionslevel AMP durch die Normalisierung der internen Kontrolle (ama-1 oder snb-1), oder vergleichen fache Induktion nach der Verwundung (AMP Induktion in verwundeten Würmern / unverwundete Würmer) von Normalizing die interne Kontrolle. HINWEIS: CNC-1 und CNC-5 sind caenacin Familie antimikrobielle Peptide, deren Transkription durch Verwundung 10 aktiviert. Typischerweise Nadel Verwundung induziert Ausdruck (~ 500fach für CNC-1) über einen Zeitverlauf von 4 h 10. Primer, die in veröffentlichten Arbeiten sind in Tabelle 2 aufgeführt. </li></ol> 6. Assay Überleben nach der Verwundung <ol><li> HINWEIS: Anschweissen aktiviert mindestens zwei unabhängige Signalwege in der Epidermis: die Ca 2+ abhängige Wundreparaturwegs und der angeborenen Immunantwort Wegs. Beide Wege sind für die vollständige Überlebens steriler Verwundung erforderlich. Um zu testen, ob eine Mutante oder RNAi-Behandlung wirkt Wundheilung, messen Überleben nach 24-48 Stunden nach der Verwundung. Optional können Sie mit herkömmlichen Lebensdauer-Tests, um die Wirkung der Verwundung auf Langlebigkeit 4,9 zu bestimmen. </li><li> Führen Nadel Verwundung auf junge Erwachsene (L4 + 24 h) Schnecken (50 Würmer, wiederholen several mal) folgende Protokoll 1 oben. Pflegen Sie eine entsprechende Anzahl von unverletzten Würmer als Kontrollen. </li><li> Überprüfen Überleben alle 24 h (Transfer verwundet Würmer auf eine neue Agarplatte alle 24 h). Beachten ~ 50% Überlebensrate 24 Stunden nach der Verletzung in Mutanten, die an der Wundheilung defekt sind, wie gtl-2 oder tir-1, bei Normierung auf unverletzten Kontrolltieren. Der Tod wird als ein Mangel der lokomotorischen Reaktion auf durch Schnecken Pick berühren definiert. </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+transgenic+C.+elegans+by+biolistic+transformation.">Generation of transgenic C. elegans by biolistic transformation.</a> J Vis Exp. (42), (2010).</li><li>Hashmi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+nematodes+using+arrays+of+micromechanical+piercing+structures.">Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures.</a> BioTechniques. 19, 766-770 (1995).</li></ol>

The authors are not aware of any competing interests.

Die Nadel und Laser Verwundung hier dargestellten Verfahren stellen komplementäre Ansätze, um die Fähigkeit des Epidermisepithel um Schäden zu reparieren. Laser Verwundung relativ lokalisierte und (je nach Laserkonfiguration) kann auf die Epidermis beschränkt werden, wobei nadel Verwundung stört die Epidermis, Kutikula und wahrscheinlich interne Basalmembranen. Needle Verwundung kann genauer ähneln Wunden, die durch Krankheitserreger oder mechanische Schäden in der natürlichen Umwelt zugefügt hat. In der Regel...

Wundheilung der Haut Mechanismen der biologischen Grundlagen Interesse und relevant für die menschliche Gesundheit. Wundheilung in Wirbeltieren und Säugetieren umfaßt eine komplexe Reihe von koordinierten Antworten von mehreren Geweben und Signalisierungs 1. Viele einfache genetische Modellorganismen sind auch fähig, Heilung von Hautwunden 2. Es ist daher von Interesse, genetisch manipulierbaren Modelle der Haut die Wundheilung zu untersuchen. Wir und andere haben damit begonnen, Caenorhabditis elegans Verwendung als neues Modell für die Haut Wundheilung 3,4. Ziel dieses Protokolls ist es, eine breitere Gruppe von Forschern, C. nutzen zu können elegans als Werkzeug zur molekularen und zellulären Mechanismen der epidermalen Wundheilung zu untersuchen. Die C. elegans Haut besteht aus der Epidermis (auch als Unterhaut bekannt) und die extrazelluläre Schuppenschicht 5. Die erwachsenen Epidermis ist aus einer kleinen Anzahl von mehrkernigen Syncytien, von denen der größte der Syncytium k gebildetnown als hyp7. Die Epidermis ist ein einfaches Epithel, das die Nagelhaut auf ihrer apikalen Oberfläche absondert. Die Haut kann aktiv gegen die Haut eindringenden Krankheitserreger zu verteidigen und zu reparieren kleine Wunden 4. Wundreparatur des C. elegans Haut ist robust, da fast alle Wildtyp-Tiere überleben können kleine Stichverletzungen durch Nadeln oder lokale Hautschäden durch Laserbestrahlung verursacht überleben. C. elegans Haut Verwundung löst eine Reihe von Reaktionen, einschließlich einer epidermalen angeborenen Immunantwort, Wundverschluss und die Narbenbildung 4. Die erwachsenen Epidermis ist postmitotischen und Wundheilung umfasst lokale Zellreaktionen im Gegensatz zu epidermalen Proliferation oder Zellmigration. Wir haben gezeigt, dass Haut Verwundung löst einen starken und nachhaltigen Anstieg der epidermalen Ca 2+, erfordern die Membran TRPM Kanal GTL-2 und der internen Ca 2+ Geschäfte 3. Für Bildung und Schließung von F-Actin Ringe an der wo ist der epidermale Ca 2+ Signal erforderlichund Ort. Verwundung induziert auch angeborene Immunantworten, die die Transkription AMPs wie NLP-29 zu aktivieren. Die Verwundung induzierten Transkription AMPs ist abhängig von einer TIR-1 / PMK-1 p38 MAP-Kinase-Kaskade wirkt sich autonom in der Epidermis 4. Defekte entweder in der Ca 2+ Signalweg oder in der angeborenen Immunantwort zu niedrigeren Überleben nach der Verwundung führen. Der relativ einfache Aufbau der C. elegans Epidermis, seine genetische Lenkbarkeit und Vorteile für die in-vivo-Bildgebung machen es ein ausgezeichnetes System, um mehrere Aspekte der Wundheilung zu untersuchen. Hier präsentieren wir Protokolle für die beiden häufigsten Methoden der Verwundung: needle Verwundung und Laser Verwundung. Needle Verwundung erfordert keine spezielle Ausrüstung (mit Ausnahme der Nadel puller) und mit der Erfahrung kann auf Hunderte von Würmern pro Tag durchgeführt werden. Needle Verwundung auf Tiere wachsen auf Agar-Platten durchgeführt. Im Gegensatz dazu wird die Laser Verwundung auf anes geführtthetized Tieren montiert auf Agar-Pads unter einem Deckglas, und ist für die Live-Darstellung der zellulären Reaktionen auf Schäden geeignet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="908">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Name</td>
			<td style="width:227px;">Company</td>
			<td style="width:227px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:227px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Agarose</td>
			<td style="width:227px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:227px;">CA3510-8</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Plastic Petri plate</td>
			<td style="width:227px;">Tritech Research</td>
			<td style="width:227px;">T3308</td>
			<td style="width:227px;">60 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Levamisole</td>
			<td style="width:227px;">Sigma</td>
			<td style="width:227px;">L9756</td>
			<td style="width:227px;">12 mM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;"><a name="RANGE!A5">Borosilicate Glass Capillary&#160;</a></td>
			<td style="width:227px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:227px;">1B100F-4</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Needle puller</td>
			<td style="width:227px;">Sutter Instrument&#160;</td>
			<td style="width:227px;">P-2000</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Worm pick (Platinum wire)</td>
			<td style="width:227px;">Tritech Research</td>
			<td style="width:227px;">PT-9010</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:87px;width:227px;">M9 solution</td>
			<td style="width:227px;">Home-made</td>
			<td colspan="2" style="width:453px;">3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Sterilize by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Trizol</td>
			<td style="width:227px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:227px;">15596026</td>
			<td style="width:227px;">Use 500 ml for 50 worms</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">iQ SYBR Green</td>
			<td style="width:227px;">Bio-Rad</td>
			<td align="right" style="width:227px;">1708882</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">SuperScript III</td>
			<td style="width:227px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:227px;">18080-051</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">PCR machine</td>
			<td style="width:227px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:227px;">C1000/CFX96</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">96-well PCR tubes</td>
			<td style="width:227px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:227px;">MLL9601</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:227px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:227px;">Metamorph</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for skin wounding and assays for wound responses in c. elegans

Die C. elegans Epidermis und Cuticula bilden eine einfache, aber anspruchsvolle Hautschicht, die lokalisierte Schäden durch Verwundung was zu reparieren. Untersuchungen der Wunde Antworten und Reparatur in diesem Modell haben unser Verständnis des Zytoskeletts und genomische Reaktionen auf Gewebeschäden beleuchtet. Die beiden am häufigsten verwendeten Verfahren, um die C gewickelt elegans erwachsenen Haut sticht mit Mikroinjektionsnadeln und lokale Laserbestrahlung. Nadel lokal Verwundung stört die Kutikula, Epidermis und der extrazellulären Matrix assoziiert und können auch innere Gewebe beschädigen. Laserbestrahlung führt zu mehr lokalisiert Schaden. Verwundung löst eine Reihe von leicht getestet Antworten einschließlich erhöhter epidermaler Ca 2+ (Sekunden-min), die Bildung und die Sperrung eines aktinhaltigen Ring an der Wundstelle (1-2 h), erhöhte Transkription des antimikrobiellen Peptids Gene (2-24 h) und die Narbenbildung. Im Wesentlichen alle erwachsenen Tiere Wildtyp überleben Verwundung, woMutanten in der Wundheilung oder andere Reaktionen defekt zeigen verringerte Überleben. Detaillierte Protokolle für die Nadel und Laser Verwundung und Assays zur Quantifizierung und Visualisierung von Wundantworten und Reparaturprozesse (Ca Dynamik Aktindynamik, antimikrobielles Peptid Induktion und Überlebensrate) dargestellt.

Laser oder Nadel Verwundung wird eine schnelle und anhaltende Erhöhung der epidermalen Ca Ebenen auslösen wie bei Ca Sensoren wie GCaMPs (Abbildung 1) visualisiert. Das Ca Höhen tritt innerhalb von Sekunden und erhöht bleibt für zehn Minuten. Nadel Verwundung reproduzierbar resultiert in der Bildung von F-Actin-Ringe an Wundstellen (Figur 2); erscheinen diese innerhalb von Minuten, und nach und nach in der Nähe über 1-2 Stunden nach der Verwundung. Aktin-Ringe weniger oft nach ge...

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Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Verfahren zur Haut Verwundung und Assays für Wound Antworten in<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

10.2K Aufrufe.  University of California, San Diego. The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity. 

Serie: Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the anatomy and connectivity of its nervous system has been determined from electron micrographs and refined by pharmacological assays. In this video, we describe how two complementary neural stimulants, an acetylcholinesterase inhibitor, called aldicarb, and a gamma-aminobutyric acid (GABA) receptor antagonist, called pentylenetetrazole (PTZ), may be employed to specifically characterize signaling at C. elegans neuromuscular junctions (NMJs) and facilitate our understanding of antagonistic neural circuits.
Of 302 C. elegans neurons, nineteen GABAergic D-type motor neurons innervate body wall muscles (BWMs), while four GABAergic neurons, called RMEs, innervate head muscles. Conversely, thirty-nine motor neurons express the excitatory neurotransmitter, acetylcholine (ACh), and antagonize GABA transmission at BWMs to coordinate locomotion. The antagonistic nature of GABAergic and cholinergic motor neurons at body wall NMJs was initially determined by laser ablation and later buttressed by aldicarb exposure. Acute aldicarb exposure results in a time-course or dose-responsive paralysis in wild-type worms. Yet, loss of excitatory ACh transmission confers resistance to aldicarb, as less ACh accumulates at worm NMJs, leading to less stimulation of BWMs. Resistance to aldicarb may be observed with ACh-specific or general synaptic function mutants. Consistent with antagonistic GABA and ACh transmission, loss of GABA transmission, or a failure to negatively regulate ACh release, confers hypersensitivity to aldicarb. Although aldicarb exposure has led to the isolation of numerous worm homologs of neurotransmission genes, aldicarb exposure alone cannot efficiently determine prevailing roles for genes and pathways in specific C. elegans motor neurons. For this purpose, we have introduced a complementary experimental approach, which uses PTZ.
Neurotransmission mutants display clear phenotypes, distinct from aldicarb-induced paralysis, in response to PTZ. Wild-type worms, as well as mutants with specific inabilities to release or receive ACh, do not show apparent sensitivity to PTZ. However, GABA mutants, as well as general synaptic function mutants, display anterior convulsions in a time-course or dose-responsive manner. Mutants that cannot negatively regulate general neurotransmitter release and, thus, secrete excessive amounts of ACh onto BWMs, become paralyzed on PTZ. The PTZ-induced phenotypes of discrete mutant classes indicate that a complementary approach with aldicarb and PTZ exposure paradigms in C. elegans may accelerate our understanding of neurotransmission. Moreover, videos demonstrating how we perform pharmacological assays should establish consistent methods for C. elegans research.

This video demonstrates how to employ two neural stimulants, aldicarb and pentylenetetrazole (PTZ), in complementary ways to study synaptic function in the nematode, C. elegans. This complementary approach may also be used to shed light on evolutionarily conserved mechanisms for modulating neuronal synchrony and has implications for epilepsy and seizures.

Paradigmen für pharmakologische Charakterisierung von C. elegans Synaptic Transmission Mutanten

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the ...

Forschung

Biologie

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

Neurocircuit Assays für Anfällen bei Epilepsie Mutanten Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Grundlegende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisation und Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Chemotaxis-Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Ein Verfahren zur Kultivierung von embryonalen<em&gt; C. elegans</em&gt; Zellen

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Ein Anoxia-Hunger-Modell für Ischämie / Reperfusion in<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

Methoden zur subzellulärer Kompartimente der Muskel in Beurteilen<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

Tracking und Quantifizierung von Entwicklungsprozessen in<em&gt; C. elegans</em&gt; Verwendung von Open-Source-Werkzeuge

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

Methoden zur Untersuchung Veränderungen inhärenten Proteinaggregation mit dem Alter in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

Messung physiologischer Stressreaktionen in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...