This work was supported by the National Institute on Aging (AG039768) to MHK. We thank Drs. Thomas Sharkey and Honggao Yan for generously providing the instruments, as well Sean Weise and Yan Wu for technical assistance.

1. Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Bereiten Aggregationspuffer (20 mM Tris, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Lagern Sie bei RT, über Monate stabil. Supplement 1 mM Dithiothreitol (DTT) vor dem Gebrauch. HINWEIS: a HEPES-basierten Puffer (10 mM HEPES, pH 7,5, 0,1 mM EDTA, 5 mM DTT) erzeugt auch ähnliche Ergebnisse in Tau-Aggregation. </li><li> Bereiten Thioflavin T oder Thioflavin S-Stammlösung (3 mM, in Aggregationspuffer) und Filter von 0,22 um sterile Filtereinheit. Bei -20 ° C in einem Röhrchen mit Aluminiumfolie abgedeckt, über Monate stabil. </li><li> Bereiten Heparin-Stammlösung (300 &amp; mgr; M in Aggregationspuffer). Lagerung bei -20 ° C, für Monate stabil. </li><li> Bereiten Dithiothreitol (DTT) Lager (1 M, gelöst in Wasser). Aliquot in 1,5-ml-Röhrchen. Lagerung bei -20 ° C. Vor Aggregationstests, tauen die 1M Lösung bei RT. Von diesem 1,000x Lager, bereiten eine aliquote Menge von 100 mM Arbeits Lager mit VE-Wasser. Lassen Sie auf dem Eisbis bereit. </li><li> Entfernen tau von -80 ° C Tiefkühltruhe. Tauwetter auf Eis. Passen tau zu vorbestimmten Konzentration mit der Aggregationspuffer. In einer Mikrozentrifuge bei 20.800 × g für 10 min bei 4 ° C auf vorgeformte große Aggregate zu entfernen. Diese Pre-Spinnschritt erhöht die Konsistenz in der anschließenden Fluoreszenz-Messung von jeder Charge des Proteins prep. Den Überstand in ein anderes Röhrchen; lassen auf Eis, bis bereit, die Aggregationsreaktion zu montieren. </li></ol> 2. No-Farbstoff, Terminal Assay HINWEIS: Der Aggregationsreaktion dieses Assays wird in Abwesenheit des fluoreszierenden Farbstoffs erfolgt. Nach dem Vermischen aller Komponenten wird das Reaktionsgemisch auf vorbestimmten Zeitpunkten fort. Aliquote werden dann aus der Aggregationsreaktion aufgenommen und mit ThT oder ThS für Amyloid Bindung vor Fluoreszenzmess gemischt. Das Anfangsvolumen der Aggregationsreaktion hängt von der Anzahl von Zeitpunkten benötigt. Dieser Ansatz kann require eine große Menge von Tau-Protein, aber schnell, einfach, und kann in einem Fluorometer oder einem Multiwell-Plattenleser (siehe Diskussion) erfolgen. Unten ist die Schritt-für-Schritt-Betrieb mit Hilfe der ISA SPEX FluoroMax-2 Kompakt Spektrofluorometer für Fluoreszenz Quantifizierung. <ol><li> Einrichten des Aggregatmischung in 1,5 ml-Eppendorf-Röhrchen, wie in Tabelle 1. Jede Säule repräsentiert die Zutaten für einen 100 &amp; mgr; l-Reaktion, die für einen Zeitpunktmessung ausreichend ist notwendig. Stellen Sie die Anzahl für das Aggregations Mischung auf der Basis der Zeitpunkte für das jeweilige Experiment benötigt. Fügen Sie zusätzliche 10% der einzelnen Komponenten, um Platz für das Pipettieren Fehler geben. Die hier gezeigte typische Reaktion, die Heparin kann durch Arachidonsäure oder Aggregationspuffer ersetzt werden. Hinzufügen DTT 1 mM zu dem Reaktionsgemisch. Wenn die gesamte Reaktion dauert mehr als einen Tag, ergänzen frischem DTT Alltags (1 mM), um eine reduzierende Umgebung zu gewährleisten. </li><li> Das Röhrchen ein paar Mal, um zu mischen. Place jede Reaktion in einem 37 ° C Brutschrank oder Wasserbad. Das Rühren wird für Tau-Aggregation notwendig. </li><li> Vor der Messung der Fluoreszenz, schalten Sie den Spektrofluorometer (Lampe, dann Computer). HINWEIS: Die Xenon-Bogenlampe, die sofort verwendet werden kann. Für die besten Ergebnisse lassen jedoch die Maschine zum Aufwärmen für etwa 10 Minuten vor dem Lesen Fluoreszenz. </li><li> Starten der Software auf dem Computer. <ol><li> Wählen Sie Echtzeit-Anzeige-Modus im Instrument Control Center eingestellt Anregungswellenlänge von 450 nm (Schlitz bis 2 nm) und Emissionswellenlänge auf 510 nm (Spalt bis 5 nm). Schließen Echtzeit Anzeigemodus-Fenster, um das Instrument Control Center zurückzukehren. </li><li> Wählen Constant Wellenlänge Analyse, drücken Sie auf Hinzufügen &gt;&gt; Taste im oberen Rahmen auf Wellenlängen-Sets hinzuzufügen. Stellen Erfassungsparameter der Standardfehler um 1 und Maximum Trials bis 3, dann auf Hinzufügen. Klicken Sie auf Los! Um die Datenanzeige zu öffnenFenster. </li><li> Im Datenanzeigefenster, klicken Sie auf Start, um das Dialog Acq Musterkiste Neu öffnen. Wählen Sie &quot;unbekannt&quot; für die Probentyp. </li></ol></li><li> Zu jeder 100 ul Aggregation Mischung, fügen Sie 98 ul Aggregationspuffer und 2 ul 3 mM Thioflavin T. Pipettieren mehrmals, um zu mischen. </li><li> Übertragen Sie die gesamte Mischung in eine Küvette (FCA3, Außenabmessung, BxLxH = 12,5 mm x 12,5 mm x 45 mm). Setzen Sie die Küvette in den Probenhalter in den Probenraum und den Deckel schließen. Klicken Sie auf Ausführen, um die Fluoreszenz-Daten zu sammeln. Notieren Sie die Daten. </li><li> Entfernen Sie die Küvette und dekantiert die Lösung. Spülen Sie die Küvette mit destilliertem Wasser 3-mal. Trocken durch Einblasen von Luft in und außerhalb der Küvette. </li></ol> 3.-Farbstoff, kontinuierliche Modus Probe mit SpectraMax M2 Plate Reader Hinweis: Dieses Assay unterscheidet sich von der vorhergehenden dadurch, dass der fluoreszierende Farbstoff ThT oder ThS im aggrega enthaltention Reaktion. Dies ermöglicht eine kontinuierliche Messung der gleiche Satz von Reaktionen. Aufgrund der wiederholten Verwendung der Reaktion ist dieses Verfahren besser mit einem automatischen Multiwell Plattenlesegerät durchgeführt (wie nachfolgend den Betrieb SpectraMax M2 gezeigt). Eine regelmäßige Fluorometer funktioniert auch, aber die Häufigkeit der Messung des schnellen Aggregationsreaktionen etwas begrenzt ist, aufgrund der manuellen Natur des Vorgangs. <ol><li> Richten Sie die Aggregation Mischung in einer 96-Well-Platte (96-Loch-schwarzen Festplatte, gut Volumen 360 ul, flacher Boden), wie in Tabelle 2. Jede Spalte steht die Zutaten für eine 200 ul-Reaktion, die für eine ausreichend ist erforderlich Zeit-Punkt-Messung. Gut mischen durch Pipettieren mehrmals. Ergänzen frischer 1 mM DTT jeden Tag im Verlauf der Experimente. </li><li> Inkubiere die Platte mit 96 Vertiefungen bei 37 ° C. </li><li> Zu jedem Zeitpunkt vor der Fluoreszenzmessung, schalten Sie den Multimode-Mikroplatten-Reader und den Computer ein. Lassen Sie ausreichend Zeit für die maschine zu stabilisieren, ca. 10 min. </li><li> Starten der Software auf dem Computer. Temperatur auf 37 ° C und wählen Fluoreszenzintensität (FI-Top Read) Modus eingestellt Anregungswellenlänge bei 450 nm und Emissionswellenlänge bei 510 nm. </li><li> Legen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen in die Schublade und drücken Sie die READ-Taste, um die Messung zu starten. </li><li> Nach der Lektüre, entfernen Sie die Platte aus und senden es zurück zu der 37 ° C-Inkubator. Kopieren Sie die Daten und fügen Sie ihn in eine Excel-Tabelle für die Datenanalyse und Plotten. </li></ol> 4.-Farbstoff, kontinuierliche Modus Assay auf einer Compact Spectrofluorometer <ol><li> Richten Sie die Aggregation Mischung in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen wie in Tabelle 3. Jede Spalte steht die Zutaten für eine 200 ul-Reaktion, die für eine Zeit-Punkt-Messung genug ist notwendig. </li><li> Das Röhrchen ein paar Mal, um zu mischen. </li><li> Schalten Sie die Spektrofluorometer und stellen Sie die Software wie in den Schritten 2.3 und 2.4. </li><li> Übertragen Sie die gesamte Mischung toa Küvetten. Setzen Sie die Küvette in den Probenhalter in den Probenraum und den Deckel schließen. Klicken Sie auf Ausführen, um die Fluoreszenz-Daten zu sammeln. Notieren Sie die Daten. </li><li> Lesen in angemessenen Abständen, indem Sie auf Ausführen und Aufzeichnen der Daten auf Weiter. Wenn die Aggregation bei einer hohen Frequenz (beispielsweise alle 30 oder 60 Sekunden) überwacht werden soll, lassen die Reaktion in der Küvette und in der Maschine, bis entweder die Messung beendet ist, oder, wenn genügend Zeit vorhanden ist, um Reaktionen oder Küvetten vertauschen. </li><li> Entfernen Sie die Küvette und dekantiert die Lösung. Spülen Sie die Küvette mit destilliertem Wasser 3-mal. Trocken durch Einblasen von Luft in und außerhalb der Küvette. </li></ol>

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Dieses Protokoll zeigt unterschiedliche Assaybedingungen und Instrumente, die phosphorylierungsabhängige schnell tau Aggregationskinetik erkennen. Im Terminal Assay wird der Fluoreszenzfarbstoff ThT zu einem Teil der Reaktionsmischung aus dem Master zu jedem Zeitpunkt entfernt, hinzugefügt. Amyloid-bindende-induzierte Fluoreszenz wird gemessen 26. In der zweiten, mit Farbstoff Modus Tau-Aggregation in Gegenwart von ThT oder ThS geführt, wodurch diese Art von Reaktion geeignet für automatischen Echtzeit-Be...

Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine von einer großen Sammlung von neurodegenerativen Erkrankungen wie Tauopathien bekannt. Die Quintessenz der zugrunde liegenden Pathologie Tauopathie um die Neurofibrillen, NFTs, in Neuronen, Astrozyten und Mikroglia 1-4. Die NFT Dichte korreliert mit kognitiver Beeinträchtigung 3,5 und Verlust von Nervenzellen 6. NFT enthält in erster Linie hyperphosphoryliertem Tau-Protein (im Folgenden als &quot;p-tau&quot; fortan genannt), die direkt oder gepaarten helikalen Filamenten (PHF) 7,8 bildet. Tau ist ein Mikrotubuli-assoziierten Protein vermutlich axonalen Transport, die für neuronale Signalübertragung und den Handel 9,10 ist zu erleichtern. Jedes tau Molekül 2-3 Phosphate im normalen Gehirn, sondern die Phosphoryl-Gehalt steigt um mehrere Falten in Tauopathie Patienten 11. Mehrere Kinasen sind wahrscheinlich zu Tau-Hyperphosphorylierung beitragen einschließlich GSK3 &amp; bgr; (Glykogensynthasekinase 3β) und CDK5 (cyclin-dehängig Kinase 5) 12,13, aber der direkte Auslöser für die pathologischen Phosphorylierung weiter Ferne 14. Abnormalen Phosphorylierung in oder in der Nähe der Mikrotubulus-Bindungsmotive distanziert tau vom Filament 15, und bewirkt tau Fehllokalisierung zu der somatodendritischen Faches, p-tau oligomerisiert in gerader oder gepaarte helikale Filamente, die schließlich in NFT Einschlüsse polymerisieren kann. Die enge Verbindung zwischen Tau-Hyperphosphorylierung, NFT-Bildung und Neurodegeneration zu einer vorherrschenden Annahme, dass p-tau Tangles hervorrufen apoptotischen und andere zytotoxische Reaktionen, und damit ist die zugrunde liegende Ursache für Tauopathie Neurodegeneration 16,17. Drogen-Bildschirme und frühen klinischen Tests, die auf dieser Prämisse wurden eingeleitet 18. , Gibt es bei diesem Hypothese Herausforderungen 19,20. Zum Beispiel Santacruz et al. Zeigten, dass die kognitiven Funktionen von transgenen Mäusen kann durch Unterdrücken der Expression eines mutierten verbessernhumanem tau, obwohl NFTs weiterhin von bestehenden tau Moleküle 21 bilden. In einem Drosophila Modell NFT wurde gezeigt, dass die toxische zytosolische Tau-Sequestrierung, die zugrunde liegenden Nervenzellen 22,23 schützen. Offensichtlich ist die Pathogenese Rolle NFT, falls vorhanden, stark beeinflussen die Richtung Tauopathie Therapeutika Entwicklung. In hohen Konzentrationen rekombinanten oder normale Gehirn tau Protein spontan, sondern langsam polymerisiert in ein PHF-ähnliche Struktur in vitro, wie durch die Bindung mehrerer β-Faltblatt bevorzugt Fluoreszenzfarbstoffe, elektronenmikroskopischen und Lichtstreuungsspektroskopie 24-27 angegeben. Hinzufügen von Heparin oder Arachidonsäure, eine reichliche Fettsäuren im menschlichen Gehirn, drastisch beschleunigt PHF-Bildung in tau isoform- und Induktor konzentrationsabhängigen Weise 28-32. Interessanterweise hyperphosphoryliertem tau gereinigt von AD-Gehirnen oder vollständig in vitro Phosphorylierungsreaktionen a vorbereitetggregates schneller und effizienter 26,33-35. Diese Ergebnisse sind in hervorragender Übereinstimmung mit der pathologischen Rolle von p-tau. Ein in vitro-System auf der Grundlage der Aggregation von p-tau kann somit als ein leistungsfähiges Werkzeug für AD Wirkstoff-Screening dienen. Angesichts der engen Verbindung zwischen Tau-Aggregation und die fortschreitende Neurodegeneration von AD, sowie die letzten Fehler in der Medikamentenentwicklung zur Förderung der Aß-Plaques eine andere Taste histologische Marker der AD 36-38, das Interesse an der Entdeckung Drogen, die steuern, Tau-Aggregation steigt. In der Tat, einige Gruppen haben bereits Drogen-Bildschirme mit unterschiedlichen Durch begonnen, mit In-vitro-Tau-Aggregation Reaktionen als primäre Assay. Eine Reihe von Chemikalien wurden als hemmend oder Umkehrung Aktivitäten auf Tau-Aggregation in vitro 39-42 aufweisen. Allerdings werden alle aktuellen Tau-Aggregation Regler Bildschirme verwenden unmodifizierten tau, die den Schlüssel pathologischen Kennzeichen Phosphor vermisstlierung und hob eine Sorge um die Spezifität und Wirksamkeit der Verwendung dieser Verbindungen bei AD-Behandlung. Eines der Haupthindernisse für die Entwicklung Aggregationsassays zur biochemischen Charakterisierung und AD Wirkstoff-Screening ist die Herstellung von ausreichenden Mengen des pathophysiologisch relevanten hyperphosphoryliertem Tau-Protein. Verwendung des Zippers Assisted Catalysis System, in dem die 1N4R Isoform von tau und der GSK-3β-Kinase in E. coexprimiert coli als Leucin-Zipper-Fusionsproteine, haben wir diese Herausforderung zu meistern (. Sui et al, eingereicht; siehe Abbildung 1 für die Endprodukte von Tau und p-tau; siehe auch 43 Vorab Massenspektrometrie Charakterisierung von p-tau). Aus einem Panel von für unterschiedliche Phosphorylierungsstellen von Tau neun Antikörper wurden positive Signale in acht Positionen gesehen (Daten nicht gezeigt). Im Folgenden beschreiben wir, Protokolle und Besetzungen, die die Aggregation kinetische d unterscheiden kannifferences zwischen unmodifizierten tau und p-tau-Arten. Diese Assays wurden aus veröffentlichten Protokollen, die den Anstieg der Fluoreszenz von Thioflavin T (ThT) oder Thioflavin S (ThS) auf Amyloid (tau Aggregate) Bindung 26 gemessen modifiziert. In der ersten &quot;Endgerät&quot;, keine Farbstoffansatz Aggregationsreaktionen werden zusammengebaut und in der Abwesenheit des Amyloid-Farbstoff inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wird ein Aliquot jeder Reaktion entnommen und mit einem gleichen Volumen des ThT-haltigen Puffer gemischt, um eine Aggregation schalten und THT tau Aggregate binden. Fluoreszenz wird von einem IAP FluoroMax-2-Fluorometer gemessen. In der zweiten &quot;mit Farbstoff&quot; kontinuierliche Überwachung Assay ThT oder ThS in den Aggregationsreaktionen enthalten. Fluoreszenz kann kontinuierlich während des gesamten Experiments manuell oder unter Verwendung eines Mehrplatten-Lesegeräts gemessen werden. Darüber hinaus beschreiben wir einen Test, der eine nahezu physiologische Konzentration von Tau und p-tau für die Aggregation in der kontinuierlichen Messung mo verwendetde. Die Wirkung der Phosphorylierung bleibt leicht nachweisbar. Im Folgenden werden wir Schritt-für-Schritt-Betrieb wird beschrieben, und zeigen repräsentative Ergebnisse dieser Tests. Diskussion über einige der Vor-und Nachteile der einzelnen Ansätze sowie potenzielle Wirkstoff-Screening-Anwendungen werden folgen. In einer hohen Konzentration, aggregiert tau amyloidartigen Strukturen spontan. Jedoch im Labor tau Fibrillenbildung wird typischerweise durch solche Induktoren wie Heparin (mittleres Molekulargewicht 6000 g / mol) und Arachidonsäure beschleunigt. Beispiele hier gezeigten sind 30 uM Heparin. Die Bildung von Tau Amyloidaggregaten durch die Fluoreszenz von Amyloid-Bindung durch Thioflavin T (ThT) oder Thioflavin S (ThS) resultierenden überwacht. Nach Bindung an Tau-Aggregaten weist ThT eine Rotverschiebung der Fluoreszenz (Anregung: 450 nm; Spitzenemission: 485 nm). ThS andererseits eine schwache Emission bei 510 nm (Anregung bei 450 nm) vor Amyloid-Bindung, aber dies fluorescence steigt signifikant in Gegenwart eines Amyloid Protein wie das aggregierte tau 44. Beide Farbstoffe funktionieren gut bei der Aufdeckung von Tau und p-Tau-Aggregation. Aufgrund des starken und relativ breite Emissionsspitze von ThT (siehe Abbildung 2), gibt es nur 30% ige Reduktion der Fluoreszenz-Einheit bei 510 nm. Der Bequemlichkeit halber verwenden wir die gleiche Kombination von Anregungs- / Emissionswellenlängen (das heißt, 450 nm / 510 nm), um Tau-Aggregation zu überwachen, wenn entweder Farbstoff. Tau-Aggregation kann in Gegenwart oder Abwesenheit des Farbstoffs durchgeführt werden, abhängig von dem Zweck des Tests und Verfügbarkeit der Tau-Protein. Beide Arten der Reaktionen sind unten dargestellt. Darüber hinaus zeigen wir, den Betrieb von zwei verschiedenen Instrumenten - eine Einzelprobe Fluorometer (ISA-SPEX FluoroMax-2) und eine Multi-Plattenlesegerät (SpectraMax M2). Die Leser sollten in der Lage, diese Protokolle anzupassen, um ihre spezifischen Bedürfnisse und Verfügbarkeit Instrument zu entsprechen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="449">
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:116px;">Name of the reagent</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:103px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">Trizma&#160;base</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">T1503</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:116px;">NaCl</td>
			<td style="width:128px;">Macron Fine Chemicals</td>
			<td style="width:103px;">MAL-7581-06</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:116px;">Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">15576-028</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">Thioflavin T</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">T3516</td>
			<td style="width:103px;">Stored in dark</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">Thioflavin S</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">T1892</td>
			<td style="width:103px;">Stored in dark</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:116px;">heparin</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">H3393</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:116px;">DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">D9779</td>
			<td style="width:103px;">Stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">96-well plate</td>
			<td style="width:128px;">Corning</td>
			<td style="width:103px;">3917</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:116px;">ISA SPEX FluoroMax-2</td>
			<td style="width:128px;">Horiba</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:116px;">SpectraMax M2 Multi-Mode Microlate Reader</td>
			<td style="width:128px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:116px;">Mouse Anti-Tau Monoclonal Antibody</td>
			<td style="width:128px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:103px;">MAB3494</td>
			<td style="width:103px;">Stored at &#8211;80&#176;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer's disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

Unter Verwendung rekombinanter tau und p-tau (Abbildung 1), haben wir zwei verschiedene Protokolle, die Kinetik der Aggregation von Tau und p-tau zu vergleichen, unter Ausnutzung der starken Fluoreszenzemission ThT THS bei Bindung an amyloide Protein-Aggregate, einschließlich tau und p-tau (Abbildung 2). Mit oder ohne dem Fluoreszenzfarbstoff in der Aggregationsreaktion beobachteten wir konsequente Weiterentwicklung der Tau-Aggregation durch Hyperphosphorylierung (Figuren 3-5)....

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In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Unmodifizierten und hyperphosphoryliertem Tau-Proteine ​​wurden in zwei In-vitro-Aggregationstests verwendet, um die Hyperphosphorylierung abhängige schnell Aggregationskinetik offenbaren. Diese Assays ebnen den Weg für weitere Bildschirme für Verbindungen, die die Neigung von hyperphosphoryliertem Tau modulieren kann zur Bildung von Fibrillen, die das Fortschreiten der Alzheimer-Krankheit zugrunde bilden.

In-vitro-Assays mit Aggregation hyperphosphoryliertem Tau Protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

in-vitro-aggregation-assays-using-hyperphosphorylated-tau-protein

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

18.2K Aufrufe.  Michigan State University.  Unmodifizierten und hyperphosphoryliertem Tau-Proteine ​​wurden in zwei In-vitro-Aggregationstests verwendet, um die Hyperphosphorylierung abhängige schnell Aggregationskinetik offenbaren. Diese Assays ebnen den Weg für weitere Bildschirme für Verbindungen, die die Neigung von hyperphosphoryliertem Tau modulieren kann zur Bildung von Fibrillen, die das Fortschreiten der Alzheimer-Krankheit zugrunde bilden. 

Serie: In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Forschung

Biologie

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions. Extracellular proteins, collagen I or von Willebrand factor are deposited within the microfluidic channel using active perfusion with a pneumatic pump. The matrix proteins are then washed with buffer and blocked to prepare the microfluidic channel for platelet interactions. Whole blood labeled with fluorescent dye is perfused through the channel at various flow rates in order to achieve platelet activation and aggregation. Inhibitors of platelet aggregation can be added prior to the flow cell experiment to generate IC50 dose response data.

The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions.

Adhäsion und Aggregation unter Fluss mit Mikrofluidik-Flow-Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Mit dem GELFREE 8100 Fraktionierung System für Molecular Weight-Based Fraktionierung mit Liquid Phase Wiederherstellung

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Schnelle Homogene Detektion von biologischen Assays mit magnetischen Modulation Biosensorik-System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

Analyse von Schwann-Astrozyten Wechselwirkungen mit In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D-Bildgebung von Protein Aggregation in lebenden Zellen

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Gekoppelt Assays zur Überwachung Proteinrückfaltung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

In-vitro-Zellmigration und Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

In-vitro-Test zur Methylierung Protein-Arginin-Methylierung Studieren

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...