Diese Arbeit wurde von der EU (STREP Projekt 241577 &quot;BIG HEART&quot; 7. Europäischen Forschungsrahmenprogramm, CP), Menarini International Operations Luxemburg (AM), Telethon GGP07133 (CP) und Gilead Sciences (AM) unterstützt.

Die Versuchsprotokolle auf menschlichem Gewebe wurden von der Ethikkommission der Universität Careggi-Krankenhaus (; erneuert Mai 2009 2006/0024713) zugelassen. Jeder Patient hat eine schriftliche Einverständniserklärung. 1. Solutions und Vorbereitung der Ausrüstung Lösungen werden in Tabelle 1 beschrieben. Ein vereinfachtes Flussdiagramm des Zellisolationsverfahren ist in Fig. 1 angegeben. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Lösung </td><td> CP </td><td> DB </td><td> KB </td><td> TB </td><td> PS </td><td> EB1 </td><td> EB2 </td></tr><tr><td rowspan="23"> Reagens (mM) </td><td> KH 2 PO 4 </td><td> 50 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 8 </td><td> 1.2 </td><td> 5 </td><td></td><td></td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 </td><td></td><td></td><td> 10 </td><td> 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Adenosin </td><td> 5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 140 </td><td> 10 </td><td> 20 </td><td> 10 </td><td></td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Mannit </td><td> 100 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Taurin </td><td> 10 </td><td> 20 </td><td> 5 </td><td></td><td></td><td> 20 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td></td><td> 113 </td><td></td><td> 136 </td><td></td><td> 113 </td><td> 113 </td></tr><tr><td> KCl </td><td></td><td> 4.7 </td><td> 85 </td><td> 5.4 </td><td> 25 </td><td> 4.7 </td><td> 4.7 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td></td><td> &lt;/ Td&gt; <td></td><td> 1.2 </td><td> 5 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td></td><td> 0,6 </td><td> 30 </td><td></td><td></td><td> 0,6 </td><td> 0,6 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td></td><td> 0,6 </td><td></td><td></td><td></td><td> 0,6 </td><td> 0,6 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td></td><td> 12 </td><td></td><td></td><td></td><td> 12 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> KHCO 3 </td><td></td><td> 10 </td><td></td><td></td><td></td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Na-Pyruvat </td><td></td><td> 4 </td><td></td><td></td><td></td><td> 4 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> BDM </td><td></td><td> 10 </td><td></td><td></td><td></td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> BHBA </td><td></td><td></td><td> 5 &lt;/ Td&gt; <td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bernsteinsäure </td><td></td><td></td><td> 5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td></td><td></td><td> 0,5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 K-ATP </td><td></td><td></td><td> 2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Brenztraubensäure </td><td></td><td></td><td> 5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kreatin </td><td></td><td></td><td> 5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> KMES </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 115 </td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> Enzyme (U / ml) </td><td> Collagenase Typ V </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 250 &lt;/ Td&gt; <td> 250 </td></tr><tr><td> Protease Typ XXIV </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 4 </td><td></td></tr><tr><td> pH-Wert </td><td></td><td> 7,4 KOH </td><td> 7.3 NaOH </td><td> 7.1 KOH </td><td> 7,35 NaOH </td><td> 7.2 KOH </td><td> 7.3 NaOH </td><td> 7.3 NaOH </td></tr></tbody></table> . Tabelle 1 Lösungen für die Probengewinnung, Zellisolierung und funktionelle Charakterisierung von Myozyten CP = kardioplegischen Lösung verwendet. DB = Dissoziationspuffer; KB = Kraft-Brühe Lösung; TB = Tyrode-Puffer; PS = Pipettenlösung; EB1 = Enzympuffer 1; EB2 = Enzympuffer 2. <ol><li> Bereiten kardioplegischen (CP)-Lösung. CP-Lösung kann bei 4 ° C für bis zu 1 Woche gelagert werden. </li><li> Bereiten Ca 2 +-freien Puffer Dissoziation (DB). Diese Lösung sollte innerhalb des Tages verwendet werden. </li><li> Bereiten Kraft-Brühe (KB)-Lösung. KB-Lösung kann bei 4 ° C für bis zu 1 wee gespeichert werdenk. </li><li> Bereiten Ca 2 +-freien Tyrode-Puffer (TB). Diese Lösung sollte innerhalb des Tages verwendet werden. </li><li> Alle Lösungen mit Spritzenfilter vor der Verwendung. </li><li> Bereiten Sie die Aufschlussgerät (2), ein Schaben des Behälters zwei einander gegen Bürsten aus Silikonelastomer, von denen einer drehbar durch einen Elektromotor gebildet. Die Aufschlussgerät ist eine Sonderanfertigung. Einzelheiten zur Verdauung Vorrichtung sind in Fig. 8; Bilder der Vorrichtung sind in den Fig. 2C und 2D. Das Gewebe Kammer mit 70% Ethanol und Wasser waschen. </li></ol> 2. Erhebung und Verarbeitung der myokardialen Proben <ol><li> Gießen Sie 40 ml cardiplegic (CP)-Lösung in einem 50 ml-Tube und speichern sie in Eis für den Transport von der Probe operative Zimmer zur Zellisolierung Labor. </li><li> Sammeln Sie die ventrikuläre Herzmuskelprobe aus dem operativen Raum sofort nach der Exzision, waschen Sie es mit eiskaltemCP-Lösung und speichern sie in der Röhre. Verwenden endokardialen Proben aus dem oberen Zwischenkammerscheidewand bei Operationen am offenen Herzen, Gewichtung&gt; 100 mg ausgeschnitten. </li><li> Schnelle Übertragung von der Probe an das Labor Bereich; Start der Verarbeitung von Proben innerhalb von 10 min von der Probe Exzision. </li><li> Während man die Probe in eiskaltem CP-Puffer, entfernen Sie vorsichtig die fibrotischen endokardialen Schicht mit einer feinen Schere unter einem Stereomikroskop; danach, schneiden Sie den myokardialen Gewebe in kleine Stücke (2-3 mm lang). Je nach Gewebeprobe, Größe, schneiden Sie einen Gesamtbetrag von ventrikulären Myokard zwischen 100 mg und 1 g für jede Isolation. </li><li> Nach Abschluss der Gewebewolf, übertragen Sie die myokardiale Brocken in der Aufschlussgerät, mit sauberen eiskalt CP Lösung. Vermeiden Füllen des gesamten Volumens zwischen den beiden Silizium Bürsten (3-4 ml) mit myokardialen Brocken mit nicht mehr als 1 g der gesamten Gewebes. </li></ol> 3. Waschen und Verdauung der myokardialen Chunks <ol><li> Achterner die Brocken in die Schaben Kammer der Verdauung Gerät übertragen, ändern Sie die CP-Puffer in der Kammer mit kaltem Ca 2 +-freien Puffer Dissoziation (DB). </li><li> Den Aufschluss Vorrichtung in einem thermostatischen Bad, um die Kammer in Kontakt mit dem erhitzten Wasser in der Wanne (Abbildung 1). Stellen Sie das Bad auf 37,5 ° C und schalten Sie ihn ein, um die Temperatur des Gewebes Kammer langsam erhöhen. Schalten Sie den Motor des Aufschlussgerät, Einstellung der Rotationsgeschwindigkeit auf 1 Umdrehung / Sekunde. </li><li> Führen Sie 3 Waschzyklen mit der DB, die Änderung der Lösung in der Kammer mit sauberen DB alle 8 min. Die DB erwärmt (37 ° C) und Sauerstoff, bevor sie in Kontakt mit der Herzstücke gesättigt. </li><li> Vorbereitung Enzympuffer 1 (EB1) durch Zugabe von 250 U / ml Collagenase Typ V und 4 U / ml Protease Typ XXIV DB Lösung. Bereiten Enzympuffer 2 (EB2) durch Zugabe von 250 U / ml Kollagenase Typ V an die DB-Lösung. Warm (37 ° C) und oxygenatE EB1 und EB2. </li><li> Führen zwei Zyklen von 12 min Verdau in der Drehvorrichtung Verdauung mit 100% Sauerstoff angereicherten EB1 (bei 37 ° C). Bei jedem Zyklus werden ~ 3 ml EB1. Entfernen Sie die Lösung mit einer Pipette Aspiration und entsorgen Sie sie nach jedem Zyklus. </li><li> Bereiten 6 15-ml-Röhrchen für Zellsammlung und ~ 80 ml kaltem (4 ° C) KB Lösung zur Elution der Puffer. </li><li> Durchführen einer ersten 15 min Verdau Zyklus mit 3 ml 100% mit Sauerstoff angereichert EB2 bei 37 ° C. Nach der Verdauung Zyklus, sammeln die Lösung, die die ersten getrennt Muskelzellen in einer 15 ml Tube und verdünnt das Zellsuspension mit 12 ml kaltem KB Lösung. Bewahren Sie das Flachrohr bei Raumtemperatur. </li><li> Verdünnt das verbleibende EB2 Lösung mit einer gleichen Menge von DB, um die Konzentration von Kollagenase V für die folgenden Zyklen Verdauung halbieren. </li><li> Ausführen anderer 5 12 min Verdau Zyklen mit 3 ml EB2 bei 37 ° C; nachdem jedes von ihnen zu sammeln von Myozyten-enthaltenden Puffer in einem 15 ml konischen Röhrchen undverdünnen Sie es mit 12 ml Lösung KB. 6 speichern die Zelle, die Röhrchen bei Raumtemperatur für 30 min. </li></ol> 4. Zell Resuspension und Ca 2 + réadaptation <ol><li> 1 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA) in 20 ml Ca 2 +-freien Tyrode-Puffer (TB). Filtern Sie die Lösung. </li><li> Zentrifugieren Sie die sechs myocyte enthält konische Röhrchen bei 100 xg für 5 min auf Muskelzellen zu begleichen erzwingen. Entfernen des Überstandes und Resuspendieren der Zellen in jedem Röhrchen mit einer variablen Menge (1-3 ml, abhängig von der Ausbeute) BSA enthält TB bei RT. </li><li> Ca 2 +-Konzentration schrittweise erhöhen, in der Zelle, die Puffer durch Zugabe von kleinen Portionen von 100 mmol / l CaCl 2-Lösung. In den ersten und zweiten Schritten von Ca 2 +-Konzentration bis zu 50 &amp;mgr; mol / l und 100 mmol / L bzw. angehoben. Folgende Ca 2 +-Zugabe Schritte alle 5 min durchgeführt und die Konzentration von 100 &amp;mgr; mol / L bei jedem Schritt t angehobenoa endgültige Konzentration von 0,9 mmol / L. </li><li> Bewerten Sie die Ausbeute des Isolierungsverfahren. Übertragen Sie 0,5 ml myocyte haltigen Lösung auf die Glasbodenkammer eines Mikroskops. Bewerten 15 Mikroskopfelder bei 10-facher Vergrößerung und Ziel berechnen den Anteil der gesunden Muskelzellen (zB stabförmige Zellen mit klaren Rillen und keine signifikanten Einschlüsse, Abbildung 2). Die erwartete Rendite liegt bei etwa 20%. </li></ol> 5. Funktionale Bewertung von isolierten Kardiomyozyten. Das folgende Protokoll ist ein Beispiel für menschlichen Kardiomyozyten funktionelle Beurteilung einschließlich simultane Messungen von Aktionspotentialen und intrazelluläre Ca2 +-Flüsse. <ol><li> Bereiten Pipettenlösung (PS) für die Patch-Clamp-Experimente in perforierten Patch-Konfiguration. Die Lösung kann bei -20 ° C für bis zu 3 Monate aufbewahrt werden. </li><li> In 1,8 mmol / l CaCl 2 Ca 2 +-freien Tyrode-Puffer (TB). Use diese Lösung für Superfusion der Herzmuskelzellen während der Patch-Clamp-/ Fluoreszenzexperimente. </li><li> 1 ml der Zellsuspension in ein 1,5-ml-Röhrchen und fügen 10 mmol / L Fluoforte und 10 ul Antriebsladung Konzentrat. Inkubation 30 min bei RT. Danach stellen Sie den Schlauch in vertikale Position und die Zelle verlassen, um für 5 min zu regeln; Resuspendieren der Zellen in Ca 2 + TB enthält. </li><li> Übertragen 0,25 ml der Zellsuspension in ein kleines (0,5 ml), montiert temperaturgesteuerten Mikroskop-Aufzeichnungskammer, durch die Schwerkraft mit einem beheizten microperfusor System bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,3 ml / min superfundiert (Temperatur: 37 ± 0,5 ° C). </li><li> Verwendung einer Pipettenziehvorrichtung, herzustellen Patch-Clamp-Pipetten mit einem Spitzendurchmesser von 3 bis 5 &amp;mgr; m und einem Widerstand von 3 bis 4,5 M, wenn sie mit PS gefüllt. </li><li> In Amphotericin B zu einer Charge von PS (250 pg / ml) und verwenden Sie es, um die Elektroden zu füllen. </li><li> Wählen Sie eine stabförmige Zelle mit klaren Schichten, frei von Einschlüssen, form die Giga-Dichtung und warten Sie 5 bis 10 Minuten, bis der Zugriff Widerstand unter 20 MOhm. </li><li> Elicit Aktionspotentiale in der Stromzange Modus mit kurzen Pulsen (&lt;3 ms) bei unterschiedlichen Frequenzen der Stimulation (0,2 Hz, 0,5 Hz und 1 Hz, 1 min bei jeder Frequenz). Während der Aufzeichnungsphase, schalten Hellfeldbeleuchtung bei 492 ± 3 nm und erkennen Fluoforte Fluoreszenz bei 505-520 nm auf. Erwerben Fluoreszenz und Membranpotential Signale mit Digidata 1440A und pClamp 10.0 Software. Wiederholen Sie die Aufnahmesequenz mehrmals, wenn nötig; allerdings halten die Gesamtaufnahmezeit von unter 15 min für jede Zelle. </li></ol>

<ol>
	<li>Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+cardiac+myocytes.+I.+Preparation+of+adult+myocytes+and+their+homology+with+the+intact+tissue.">Isolated cardiac myocytes. I. Preparation of adult myocytes and their homology with the intact tissue.</a> Cardiovascular Research. 15, 483-514 (1981).</li><li>Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+cardiac+myocytes.+II.+Functional+aspects+of+mature+cells.">Isolated cardiac myocytes. II. Functional aspects of mature cells.</a> Cardiovascular Research. 15, 549-579 (1981).</li><li>Harding, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+dependence+of+contraction+velocity+in+single+isolated+cardiac+myocytes.">Species dependence of contraction velocity in single isolated cardiac myocytes.</a> Cardioscience. 1, 49-53 (1990).</li><li>Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+single+atrial+and+ventricular+cells+from+the+human+heart.">Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart.</a> Canadian Medical Association Journal. 126, 791-793 (1982).</li><li>Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+calcium-current+in+isolated+human+ventricular+myocytes+from+patients+with+terminal+heart+failure.">Characteristics of calcium-current in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 23, 929-937 (1991).</li><li>Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+handling+in+isolated+ventricular+myocytes+from+patients+with+terminal+heart+failure.">Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure.</a> Circulation. 85, 1046-1055 (1992).</li><li>Cohen, N. M., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+current+in+single+human+cardiac+myocytes.">Calcium current in single human cardiac myocytes.</a> Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 4, 422-437 (1993).</li><li>Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+K++currents+in+isolated+human+ventricular+myocytes+from+patients+with+terminal+heart+failure.">Alterations of K+ currents in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure.</a> Circulation Research. 73, 379-385 (1993).</li><li>Virag, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slow+component+of+the+delayed+rectifier+potassium+current+in+undiseased+human+ventricular+myocytes.">The slow component of the delayed rectifier potassium current in undiseased human ventricular myocytes.</a> Cardiovascular Research. 49, 790-797 (2001).</li><li>Nanasi, P. P., Varro, A., Lathrop, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+ventricular+and+atrial+cardiomyocytes:+technical+note.">Isolation of human ventricular and atrial cardiomyocytes: technical note.</a> Cardioscience. 4, 111-116 (1993).</li><li>Benitah, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+inward+current+in+single+cells+isolated+from+adult+human+ventricles.+Pflugers+Archiv.">Slow inward current in single cells isolated from adult human ventricles. Pflugers Archiv.</a> European Journal of Physiology. 421, 176-187 (1992).</li><li>Verkerk, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+mechanism+of+delayed+afterdepolarizations+in+ventricular+cells+isolated+from+human+end-stage+failing+hearts.">Ionic mechanism of delayed afterdepolarizations in ventricular cells isolated from human end-stage failing hearts.</a> Circulation. 104, 2728-2733 (2001).</li><li>Cerbai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+hyperpolarization-activated+current,+I(f),+in+ventricular+myocytes+from+human+failing+heart.">Characterization of the hyperpolarization-activated current, I(f), in ventricular myocytes from human failing heart.</a> Circulation. 95, 568-571 (1997).</li><li>Kohncke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+kv+channel+recordings+in+murine+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes.">Isolation and kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).</li><li>Tomaselli, G. F., Marban, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+remodeling+in+hypertrophy+and+heart+failure.">Electrophysiological remodeling in hypertrophy and heart failure.</a> Cardiovascular Research. 42, 270-283 (1999).</li><li>Maron, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+cardiomyopathy:+a+systematic+review.">Hypertrophic cardiomyopathy: a systematic review.</a> JAMA: The Journal of the American Medical Association. 287, 1308-1320 (2002).</li><li>Olivotto, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+hypertrophic+cardiomyopathy:+from+developmental+biology+to+clinical+practice.">The many faces of hypertrophic cardiomyopathy: from developmental biology to clinical practice.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 349-367 (2009).</li><li>Maron, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+cardiomyopathy+is+predominantly+a+disease+of+left+ventricular+outflow+tract+obstruction.">Hypertrophic cardiomyopathy is predominantly a disease of left ventricular outflow tract obstruction.</a> Circulation. 114, 2232-2239 (2006).</li><li>Peeters, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+isolation+of+human+ventricular+myocytes+from+single+endocardial+and+epicardial+biopsies.">Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies.</a> The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).</li><li>Lippiat, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+recording+using+the+perforated+patch+clamp+technique.">Whole-cell recording using the perforated patch clamp technique.</a> Methods Mol Biol. 491, 141-149 (2008).</li><li>Coppini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+sodium+current+inhibition+reverses+electromechanical+dysfunction+in+human+hypertrophic+cardiomyopathy.">Late sodium current inhibition reverses electromechanical dysfunction in human hypertrophic cardiomyopathy.</a> Circulation. 127, 575-584 (2013).</li><li>Kuusisto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-grade+inflammation+and+the+phenotypic+expression+of+myocardial+fibrosis+in+hypertrophic+cardiomyopathy.">Low-grade inflammation and the phenotypic expression of myocardial fibrosis in hypertrophic cardiomyopathy.</a> Heart. 98, 1007-1013 (2012).</li><li>Yan, G. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+2+early+afterdepolarization+as+a+trigger+of+polymorphic+ventricular+tachycardia+in+acquired+long-QT+syndrome+:+direct+evidence+from+intracellular+recordings+in+the+intact+left+ventricular+wall.">Phase 2 early afterdepolarization as a trigger of polymorphic ventricular tachycardia in acquired long-QT syndrome : direct evidence from intracellular recordings in the intact left ventricular wall.</a> Circulation. 103, 2851-2856 (2001).</li><li>Yue, L., Feng, J., Li, G. R., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+outward+and+delayed+rectifier+currents+in+canine+atrium:+properties+and+role+of+isolation+methods.">Transient outward and delayed rectifier currents in canine atrium: properties and role of isolation methods.</a> The American Journal of Physiology. 270, 2157-2168 (1996).</li><li>Li, G. R., Feng, J., Yue, L., Carrier, M., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+two+components+of+delayed+rectifier+K++current+in+human+ventricular+myocytes.">Evidence for two components of delayed rectifier K+ current in human ventricular myocytes.</a> Circulation research. 78, 689-696 (1996).</li><li>Viswanathan, P. C., Shaw, R. M., Rudy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+IKr+and+IKs+heterogeneity+on+action+potential+duration+and+its+rate+dependence:+a+simulation+study.">Effects of IKr and IKs heterogeneity on action potential duration and its rate dependence: a simulation study.</a> Circulation. 99, 2466-2474 (1999).</li><li>Volders, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+contribution+of+IKs+to+canine+ventricular+repolarization:+key+role+for+beta-adrenergic+receptor+stimulation.">Probing the contribution of IKs to canine ventricular repolarization: key role for beta-adrenergic receptor stimulation.</a> Circulation. 107, 2753-2760 (2003).</li><li>Sanguinetti, M. C., Jurkiewicz, N. K., Scott, A., Siegl, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoproterenol+antagonizes+prolongation+of+refractory+period+by+the+class+III+antiarrhythmic+agent+E-4031+in+guinea+pig+myocytes.+Mechanism+of+action.">Isoproterenol antagonizes prolongation of refractory period by the class III antiarrhythmic agent E-4031 in guinea pig myocytes. Mechanism of action.</a> Circulation Research. 68, 77-84 (1991).</li><li>Coppini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+approach+to+treatment+of+hypertrophic+cardiomyopathy:+pre-clinical+rationale+and+design+of+a+prospective+randomized+pilot+trial+with+ranolazine.">A translational approach to treatment of hypertrophic cardiomyopathy: pre-clinical rationale and design of a prospective randomized pilot trial with ranolazine.</a> Circulation. 125, 1 (2012).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Wir haben beschrieben und validiert, eine Methode, um praktikable Muskelzellen von chirurgischen Proben menschlichen Myokard zu isolieren. Ausgehend vom zuvor beschriebenen Protokolle, die erfolgreich an isolierten Zellen von Vorhof chirurgischen Proben, die Technik benutzt hatte, um eine Trennung von einzelnen tragfähige Muskelzellen von erkrankten Myokard entwickelt und fein abgestimmt. Frühe Berichte zeigten, dass Isolierung einzelner Kardiomyozyten aus Brocken von atriale und ventrikuläre Gewebe selektiv beeintr?...

Dissection der elektrophysiologischen Eigenschaften des Herzmuskels hat sich deutlich nach der Entwicklung von Techniken für die einzelnen Herzmuskelzellen Isolation vorangekommen. Die jüngsten Fortschritte im Verständnis der Herzkontraktion Anregung Kopplung (EC-Coupling) haben auch durch die Fähigkeit der Isolierung lebensfähigen Einzel Kardiomyozyten, die alle physiologischen Eigenschaften des intakten Gewebes behalten gemacht worden. Patch-Clamp-Verfahren werden routinemäßig verwendet, um die Funktion und pharmakologische Modulation von Herz sarkolemmalen Ionenströme zu untersuchen. Aufnahmen der intrazellulären Calcium-Dynamik mit Ca 2 +-sensitiven Farbstoffen werden auch regelmäßig auf einzelne Herzmuskelzellen aus einer Vielzahl von gesunden und kranken Modelle durchgeführt wird, liefert wichtige Daten über die Physiologie des EG-Kupplung als auch auf die pathologischen Veränderungen der intrazellulären Ca 2 + Homöostase, die zu mechanischen Beeinträchtigungen und erhöhte Belastung in arrhythmogene Herzkrankheiten. Information aus diesen Studien ist entscheidend für das Verständnis der elektrophysiologischen und mechanischen Auswirkungen von Drogen in der Klinik. Es gibt jedoch bestimmte Arten Unterschiede in den Transmembranströmen und in den EG-Kupplung Proteine, die für bestimmte Funktionen des Herzaktionspotentials und der Herzmechanik zu berücksichtigen. Während also Studien von Myozyten aus nicht-menschlichen Säugetieren isoliert haben die biophysikalischen Eigenschaften und physiologischen Rollen von spezifischen Transmembranionenkanäle und EC-Kopplung Proteine ​​aufgeklärt, sie sind nicht zwangsläufig relevanten Modelle der menschlichen Herzmuskelzellen. Isolation von lebensfähigen Muskelzellen aus menschlichen Herzmuskel ist daher unerlässlich, um die Pathophysiologie von Herzerkrankungen verstehen und Validierung neuer therapeutischer Ansätze. Menschenvorhofgewebe ist leicht verfügbar, wie Vorhof Anhänge werden oft während der chirurgischen Verfahren verworfen. Erste quantitative Untersuchungen der erwachsenen menschlichen Herzaktionspotentiale und Ionen currents beschäftigt enzymatisch isolierten Vorhofzellen 1-4. Aufnahmen von Aktionspotentialen oder Ströme aus isolierten erwachsenen Menschen ventrikuläre Zellen wurden anschließend berichtet 3,5-10. Die meisten dieser Studien wurden Zellen aus explantierten Herzen gewonnen und verwendet entweder Collagenase-Perfusion einer Koronararterie Segment oder Belichtung von relativ großen Mengen an Kollagenase Exzidate isolierte Zellen zu erhalten. Diese Studien ermöglichte eine detaillierte Charakterisierung einer Anzahl von Transmembran-Ionenströme aus humanen Kardiomyozyten aus gesunden Herzen und von Patienten mit terminaler Herzinsuffizienz. Aufnahmen von L-Typ-Ca 2 +-Strom (I CA-L) 5-7, transiente Kalium-Auswärtsstrom (I to) 8, Einwärtsgleichrichter Kaliumstrom (I κ1) 8, die verschiedenen Komponenten des verzögerten Gleichrichter-Kaliumstrom (I κ ) 9 berichtet. Vorschüsse und Raffination vondie Isolationsverfahren 10, erlaubt eine eindeutige Charakterisierung der ionischen Basis der erhöhten arrhythmogene Potential in terminaler Herzinsuffizienz, bestehend aus Aktionspotential-Verlängerung 11 nach Depolarisationen 12 verzögert und erhöhte lustig Strom 13 führt zu diastolischen Depolarisation und Extrasystolen. Erwachsene Herzmuskelzellen werden in der Regel von kleinen Tieren durch retrograde Perfusion des ganzen Herzens mit verschiedenen Enzymmischungen, eine Technik, die hohe Ausbeuten von Ca 2 +-Zellen tolerant 14 erzeugt isoliert. Isolierung von Herzmuskelzellen, die aus Fragmenten von Gewebe von Natur aus weniger erfolgreich wahrscheinlich wegen des begrenzten Zugangs zu einzelnen Enzyme Myozyten verglichen mit der durch Perfusion der Koronararterien erreicht. Wegen der sehr begrenzten Verfügbarkeit von Spenderherzen ungenutzt ist der einzige praktische Weg, um normale menschliche ventrikuläre Zellen auf einer regelmäßigen Basis zu erhalten, die durch enzymatische digestion der oft sehr kleinen Gewebefragmenten bei elektiven chirurgischen Verfahren ausgeschnitten. Die einzige menschliche Krankheitsmodell, die gründlich auf Zellebene charakterisiert worden ist terminaler Herzinsuffizienz aufgrund der Zugänglichkeit zu transplantierten Herzen. Allerdings tritt terminaler Herzinsuffizienz in einer Minderheit der Patienten und oft mit einem gemeinsamen Weg von schweren Umbau des Herzmuskelzellen, die relativ unabhängig von der zugrunde liegenden Ursache 15 ist. Die Fähigkeit, die Funktion der einzelnen Herzmuskelzellen von Patienten zu einem früheren nicht andernfalls Stadium der Erkrankung zu beurteilen ist entscheidend, um die spezifische Pathophysiologie verschiedener ererbte oder erworbene Zustände zu verstehen. Die hypertrophe Kardiomyopathie (HCM) ist ein beredtes Beispiel. HCM ist eine gemeinsame (1/500 Personen) vererbbare Herzerkrankung, die durch Herzhypertrophie, erhöhter arrhythmogene Risiko-und Kontraktions Änderungen aufgrund Ausflusstraktobstruktion und diastolischen Dysfunktion 16. Kardiomyozyten aus HCM Herzen undergo eine komplexe Umbauprozesse, die Änderungen in der Zellstruktur (Hypertrophie, myofibrillären Unordnung) und EC-Kupplung 17. Allerdings hat die meisten Informationen von Myozyten Dysfunktion bei HCM aus transgenen Tiermodellen zu kommen. Da nur eine Minderheit von HCM-Patienten entwickelt sich in Richtung Terminal Herzinsuffizienz und Herztransplantation benötigt, sind HCM Herzen sehr selten zur Zellisolierung mit Standard-Methoden zur Verfügung. Jedoch mindestens 30% der HCM-Patienten entwickeln obstruktive Symptome aufgrund massiver Blut Septumhypertrophie verändernde Ausflusstrakt Fluss während der Systole (HCM) 18. Die wirksamste verfügbare therapeutische Option für die Entlastung der Obstruktion in HCM ist die chirurgische Septum Myektomie: während dieser chirurgische Eingriff ist eine variable Größe oberen Teil der Scheidewand von trans Aorten-Ansatz entfernt. Dieser Teil des hypertrophierten Septum ist deshalb zur Zellisolierung aus dem frischen Gewebe zur Verfügung. Verfahren zur Isolierung von menschlichen ventricular Muskelzellen von einzelnen, kleinen transvenous Endomyokardbiopsie Proben zuvor entwickelt und veröffentlicht 19. Wir implementierten eine Methode, um einzelne septalen Myozyten von Myokard-Proben von Patienten, die Herzchirurgie, einschließlich Patienten mit HCM unterziehen Septum Myektomie und Patienten, die sich Ventil Ersatzverfahren zu isolieren. Zusätzlich zu einer detaillierten Beschreibung der Trennprotokolls, repräsentativen elektrophysiologischen und Ca 2 +-Fluoreszenzmessungen vorgestellt werden, was die Lebensfähigkeit der isolierten humanen Kardiomyozyten und die Durchführbarkeit der Patch-Clamp-und intrazellulären Ca 2 +-Studien.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1059">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;"><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p9791?lang=it&amp;region=IT">P9791&#160;</a></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4 * 7H2O)</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/m1880?lang=it&amp;region=IT">M1880&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h3375?lang=it&amp;region=IT">H3375&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adenosine</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9251?lang=it&amp;region=IT">A9251&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8270?lang=it&amp;region=IT">G8270&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mannitol</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/m4125?lang=it&amp;region=IT">M4125&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Taurine</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s7653?lang=it&amp;region=IT">S7653</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p9333?lang=it&amp;region=IT">P9333&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s7907?lang=it&amp;region=IT">S7907&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s6297?lang=it&amp;region=IT">S6297&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/237205?lang=it&amp;region=IT">237205</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p2256?lang=it&amp;region=IT">P2256&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,3-Butanedione monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b0753?lang=it&amp;region=IT">B0753&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide(NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s8045?lang=it&amp;region=IT">S8045&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/49601?lang=it&amp;region=IT">49601</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pyruvic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/107360?lang=it&amp;region=IT">107360</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-Hydroxybutyric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/166898?lang=it&amp;region=IT">166898</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adenosine 5&#8242;-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8937?lang=it&amp;region=IT">A8937</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Creatine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c0780?lang=it&amp;region=IT">C0780&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Succinic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s3674?lang=it&amp;region=IT">S3674&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/e0396?lang=it&amp;region=IT">E0396&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Albumin from bovine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a0281?lang=it&amp;region=IT">A0281</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8266?lang=it&amp;region=IT">M8266&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c9263?lang=it&amp;region=IT">C9263&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase, Bacterial, Type XXIV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium chloride solution, ~1 M in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/21115?lang=it&amp;region=IT">21115</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium chloride 0.1 M solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/53704?lang=it&amp;region=IT">53704</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium methanesulfonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/83000?lang=it&amp;region=IT">83000</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FluoForte Reagent</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ENZ-52015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Powerload concentrate, 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P10020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Perfusion Fast-Step System</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>VC-77SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amphotericin B solubilized</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9528?lang=it&amp;region=IT">A9528&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multiclamp 700B patch-clamp amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digidata 1440A</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pClamp10.0&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="108">
			<td height="108" style="height:108px;">Digestion Device</td>
			<td>CUSTOM</td>
			<td>CUSTOM</td>
			<td style="width:255px;">The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Fig 1 C-D and in Fig.7. We can provide further details if requested</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone elastomer for the digestion device&#39;s brushes</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>SYLGARD&#174; 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Variable speed rotating motor for the digestion device</td>
			<td>Crouzet</td>
			<td>Crouzet 178-4765&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Mold for brushes casting</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>N.A.</td>
			<td style="width:255px;">The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and functional characterization of human ventricular cardiomyocytes from fresh surgical samples

Kardiomyozyten von erkrankten Herzen sind komplexe Umbauprozesse, die Änderungen in der Zellstruktur, Erregung Kontraktion Kupplung und Membranionenströme unterzogen. Diese Veränderungen sind wahrscheinlich für das erhöhte Risiko und die arrhythmogene Kontraktions Veränderungen, die zu den systolischen und diastolischen Dysfunktion bei Herzpatienten verantwortlich zu sein. Allerdings hat die meisten Informationen über die Veränderungen der Myozyten-Funktion im Herzerkrankungen aus Tiermodellen zu kommen. Hier beschreiben wir ein Protokoll und zu validieren, um lebensfähige Muskelzellen von kleinen chirurgischen Proben von ventrikulären Myokard von Patienten, die Herzchirurgie Operationen zu isolieren. Das Protokoll wird im Detail beschrieben. Elektrophysiologischen und intrazellulären Calciummessungen berichtet, um die Durchführbarkeit einer Anzahl von Einzelzellmessungen in menschlichen Kardiomyozyten mit diesem Verfahren erhalten zu demonstrieren. Das Protokoll berichtet erWieder kann für zukünftige Untersuchungen der zellulären und molekularen Basis der funktionellen Veränderungen des menschlichen Herzens in Gegenwart verschiedener Herzkrankheiten sein. Außerdem kann diese Methode verwendet, um neue therapeutische Targets auf zellulärer Ebene zu identifizieren und die Wirksamkeit der neuen Verbindungen auf die menschliche Herzmuskelzellen zu testen, mit direktem Translationswert werden.

Das oben beschriebene Verfahren wurde verwendet, um die funktionellen Störungen von Kardiomyozyten aus der Scheidewand des Patienten mit hypertropher Kardiomyopathie (HCM) die Myektomie Operation unterzog isoliert charakterisieren, verglichen mit nicht andernfalls nicht hypertrophe chirurgischen Patienten 21. Die in diesem Abschnitt enthalten sind, aus diesem Werkstück 21 ab und sind hier als ein Beispiel, wie diese Technik verwendet, um die Änderungen der Herzmuskelzellfunktion bei Herzerkranku...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples at JoVE.com

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Aktuelle Erkenntnisse über die zellulären Grundlagen von Herzerkrankungen meist stützt sich auf Studien an Tiermodellen. Hier beschreiben wir und Validierung einer neuen Methode, um einzelne lebende Herzmuskelzellen von kleinen chirurgischen Proben menschlichen Myokard zu erhalten. Menschen Kardiomyozyten können für elektrophysiologische Studien-und Drogentests verwendet werden.

Isolierung und funktionelle Charakterisierung der Menschen ventrikuläre Kardiomyozyten von Fresh Chirurgische Proben

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

isolation-functional-characterization-human-ventricular

Research

JoVE Journal

Medicine

17.1K Aufrufe.  University of Florence.  Aktuelle Erkenntnisse über die zellulären Grundlagen von Herzerkrankungen meist stützt sich auf Studien an Tiermodellen. Hier beschreiben wir und Validierung einer neuen Methode, um einzelne lebende Herzmuskelzellen von kleinen chirurgischen Proben menschlichen Myokard zu erhalten. Menschen Kardiomyozyten können für elektrophysiologische Studien-und Drogentests verwendet werden. 

Serie: Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Patienten abgeleitet Zellkultur und Isolierung von CD133<sup&gt; +</sup&gt; Mutmaßliche Cancer Stem Cells von Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Forschung

Medizin

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

Isolierung von Krebs Stammzellen aus menschlichen Prostatakrebs-Proben

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

Sammlung, Isolierung, und Durchflusszytometrische Analyse der Menschen Endozervikale Proben

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension and Assessment of Right Ventricular Function in the Piglet

An original piglet model of Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension (CTEPH) associated with chronic Right Ventricular (RV) dysfunction is described. Pulmonary Hypertension (PH) was induced in 3-week-old piglets by a progressive obstruction of the pulmonary vascular bed. A ligation of the left Pulmonary Artery (PA) was performed first through a mini-thoracotomy. Second, weekly embolizations of the right lower pulmonary lobe were done under fluoroscopic guidance with n-butyl-2-cyanoacrylate during 5 weeks. Mean Pulmonary Arterial Pressure (mPAP) measured by ritght heart catheterism, increased progressively, as well as Right Atrial pressure and Pulmonary Vascular Resistances (PVR) after 5 weeks compared to sham animals. Right Ventricular (RV) structural and functional remodeling were assessed by transthoracic echocardiography (RV diameters, RV wall thickness, RV systolic function). RV elastance and RV-pulmonary coupling were assessed by Pressure-Volume Loops (PVL) analysis with conductance method. Histologic study of the lung and the right ventricle were also performed. Molecular analyses on RV fresh tissues could be performed through repeated transcutaneous endomyocardial biopsies. Pulmonary microvascular disease in obstructed and unobstructed territories was studied from lung biopsies using molecular analyses and pathology. Furthermore, the reliability and the reproducibility was associated with a range of PH severity in animals. Most aspects of the human CTEPH disease were reproduced in this model, which allows new perspectives for the understanding of the underlying mechanisms (mitochondria, inflammation) and new therapeutic approaches (targeted, cellular or gene therapies) of the overloaded right ventricle but also pulmonary microvascular disease.

Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension (CTEPH) and Right Ventricular (RV) dysfunction were induced in piglets by progressive obstruction of the pulmonary arteries. Consequences were remarkably similar to those observed in CTEPH patients. This animal model would be a very useful tool for pathophysiology and therapeutic experiments on CTEPH and RV failure.

Chronisch thromboembolischen pulmonalen Hypertonie und Beurteilung der rechtsventrikulären Funktion in der Ferkel

An original piglet model of Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension (CTEPH) associated with chronic Right Ventricular (RV) dysfunction is described. ...

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum (SR) serves as a Ca2+ reservoir for contraction, which reuptakes intracellular Ca2+ during relaxation. The SR Ca2+ reserve available for beats is determinate for cardiac contractibility, and the removal of intracellular Ca2+ is critical for cardiac diastolic function. Under some pathophysiological conditions, such as diabetes and heart failure, impaired calcium clearance and SR Ca2+ store in cardiomyocytes may be involved in the progress of cardiac dysfunction. Here, we describe a protocol to evaluate SRCa2+ reserve and diastolic Ca2+ removal. Briefly, a single cardiomyocyte was enzymatically isolated, and the intracellular Ca2+ fluorescence indicated by Fura-2 was recorded by a calcium imaging system. To employ caffeine for inducing total SR Ca2+ release, we preset an automatic perfusion switch program by interlinking the stimulation system and the perfusion system. Then, the mono-exponential curve fitting was used for analyzing decay time constants of calcium transients and caffeine-induced calcium pulses. Accordingly, the contribution of the SR Ca2+-ATPase (SERCA) and Na+-Ca2+ exchanger (NCX) to diastolic calcium removal was evaluated.

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Here, we describe a protocol to evaluate sarcoplasmic reticulum Ca2+ reserve and diastolic calcium removal function in cardiomyocytes by a calcium imaging system.

Bewertung der sarkoplasmatischen Retikulum Calcium Reserve und intrazellulären diastolische Calcium Entfernung in isolierten ventrikulären Kardiomyozyten

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise investigation of the behavior of these cells under specific treatments and environments is possible. This manuscript presents a protocol for successful isolation and cultivation of adult rat ventricular cardiomyocytes (ARVC).
The rat is sacrificed by cervical dislocation under deep anesthesia. Then, the heart is extracted and the aorta is uncovered. Subsequently, perfusion on the Langendorff perfusion system with calcium depletion and collagenase treatment is performed. Afterwards, ventricular tissue gets minced, re-circulated, and filtered, followed by three centrifugation steps with gradual addition of CaCl2 until physiological calcium concentration is reached. ARVC are plated on cell culture dishes. After refreshing the cell culture medium, ARVC can be cultivated for up to six days without changing the serum-containing culture medium. Isolation of ARVC is a calcium sensitive process. Small changes in the intracellular calcium concentration cause a decrease in the quality and viability of the isolated cells.
Freshly isolated ARVC are rod shaped. Within the first days of cultivation they lose the rod-shaped morphology and form pseudopodia-like structures (spreading). During this morphological formation ARVC initially degrade their contractile elements followed by a reformation through actin stress fibers and de novo sarcomerogenesis. After one week of cultivation, most ARVC show a widespread appearance with a clearly detectable cross striation. This process is sensitive to intracellular calcium concentration, as treatment with ionomycin attenuates spreading. Key markers in this process of de- and re-differentiation are &#946;-myosin heavy chain (&#946;-MHC), oncostatin M (OSM), and swiprosin-1 (EFHD2). Recent studies have suggested that cardiac re- and de-differentiation occurring under culture conditions mimics features seen in vivo during cardiac remodeling. Therefore, isolation and cultivation of ARVC play a key role in understanding the biology of cardiomyocytes.

Here, we present a protocol for the isolation and cultivation of adult rat ventricular cardiomyocytes (ARVC). Isolated ARVC can be used for short and long-term cultivation. The isolation and cultivation of ARVC can play a key role in developing new treatment regimens for cardiac diseases.

Isolierung und Kultivierung von Erwachsenen Ratte Kardiomyozyten

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state against self-antigens as well as antigens derived from commensal organisms. The disruption of this immune homeostasis can lead to chronic inflammation and to the development of autoimmunity. Dendritic cells (DCs) are the professional antigen-presenting cells of the innate immune system involved in activating na&#239;ve T cells to initiate immune responses against foreign antigens. However, DCs can also be differentiated into TolDCs that act to maintain and promote T cell tolerance and to suppress effector cells contributing to the development of either autoimmune or chronic inflammation conditions. The recent advancement in our understanding of TolDCs suggests that DC tolerance can be achieved by modulating their differentiation conditions. This phenomenon has led to tremendous growth in developing TolDC therapies for numerous immune disorders caused due to break in immune tolerance. Successful studies in preclinical autoimmunity murine models have further validated the immunotherapeutic utility of TolDCs in the treatment of autoimmune disorders. Today, TolDCs have become a promising immunotherapeutic tool in the clinic for reinstating immune tolerance in various immune disorders by targeting pathogenic autoimmune responses while leaving protective immunity intact. Although an array of strategies has been proposed by multiple labs to induce TolDCs, there is no consistency in characterizing the cellular and functional phenotype of these cells. This protocol provides a step-by-step guide for the development of bone marrow-derived DCs in large numbers, a unique method used to differentiate them into TolDCs with a synthetic triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic acid-difluoro-propyl-amide (CDDO-DFPA), and the techniques used to confirm their phenotype, including analyses of essential molecular signatures of TolDCs. Finally, we show a method to assess TolDC function by testing their immunosuppressive response in vitro and in vivo in a preclinical model of multiple sclerosis.

Here, we present a protocol to develop and characterize tolerogenic dendritic cells (TolDCs) and evaluate their immunotherapeutic utility.

Entwicklung und Charakterisierung von dendritischen Zellen murinen Tolerogene

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state ...

Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) provide a valuable human source for studying the basic science of calcium (Ca2+) handling and signaling pathways as well as high-throughput drug screening and toxicity assays. Herein, we provide a detailed description of the methodologies used to generate high-quality iPSC-CMs that can consistently reproduce molecular and functional characteristics across different cell lines. Additionally, a method is described to reliably assess their functional characterization through the evaluation of Ca2+ handling properties. Low oxygen (O2) conditions, lactate selection, and prolonged time in culture produce high-purity and high-quality ventricular-like cardiomyocytes. Similar to isolated adult rat cardiomyocytes (ARCMs), 3-month-old iPSC-CMs exhibit higher Ca2+ amplitude, faster rate of Ca2+ reuptake (decay-tau), and a positive lusitropic response to &#946;-adrenergic stimulation compared to day 30 iPSC-CMs. The strategy is technically simple, cost-effective, and reproducible. It provides a robust platform to model cardiac disease and for the large-scale drug screening to target Ca2+ handling proteins.

Here we describe and validate a method to consistently generate robust human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and characterize their function. These techniques may help in developing mechanistic insight into signaling pathways, provide a platform for large-scale drug screening, and reliably model cardiac diseases.

Generierung von ventrikulären HiPSC-abgeleiteten Cardiomyozyten und hochwertigen Zellpräparaten für die Calciumhandling-Charakterisierung

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) provide a valuable human source for studying the basic science of calcium (Ca2+) ...

Functional Characterization of Endogenously Expressed Human RYR1 Variants

More than 700 variants in the RYR1 gene have been identified in patients with different neuromuscular disorders including malignant hyperthermia susceptibility, core myopathies and centronuclear myopathy. Because of the diverse phenotypes linked to RYR1 mutations it is fundamental to characterize their functional effects to classify variants carried by patients for future therapeutic interventions and identify non-pathogenic variants. Many laboratories have been interested in developing methods to functionally characterize RYR1 mutations expressed in patients&#39; cells. This approach has numerous advantages, including: mutations are endogenously expressed, RyR1 is not over-expressed, use of heterologous RyR1 expressing cells is avoided. However, since patients may present mutations in different genes aside RYR1, it is important to compare results from biological material from individuals harboring the same mutation, with different genetic backgrounds. The present manuscript describes methods developed to study the functional effects of endogenously expressed RYR1 variants in: (a) Epstein Barr virus immortalized human B-lymphocytes and (b) satellite cells derived from muscle biopsies and differentiated into myotubes. Changes in the intracellular calcium concentration triggered by the addition of a pharmacological RyR1 activators are then monitored. The selected cell type is loaded with a ratiometric fluorescent calcium indicator and intracellular [Ca2+] changes are monitored either at the single cell level by fluorescence microscopy or in cell populations using a spectrofluorometer. The resting [Ca2+], agonist dose response curves are then compared between cells from healthy controls and patients harboring RYR1 variants leading to insight into the functional effect of a given variant.

Here methods used to study the functional effect of RYR1 mutations endogenously expressed in Epstein Barr Virus immortalized human B-lymphocytes and muscle biopsy derived satellite cells differentiated into myotubes are described.

Funktionelle Charakterisierung endogen exprimierter humaner RYR1-Varianten

More than 700 variants in the RYR1 gene have been identified in patients with different neuromuscular disorders including malignant hyperthermia ...

Modifications of the Langendorff Method for Simultaneous Isolation of Atrial and Ventricular Myocytes from Adult Mice

A single cardiomyocyte is a vital tool in the cellular and subcellular level studies of cardiac biology and diseases as a fundamental unit of contraction and electrical activity. Hence, isolating viable, high-quality cardiomyocytes from the heart is the initial and most crucial experimental step. Comparing the various protocols for isolating the cardiomyocytes of adult mice, the Langendorff retrograde perfusion is the most successful and reproducible method reported in the literature, especially for isolating ventricular myocytes. However, isolating quality atrial myocytes from the perfused heart remains challenging, and few successful isolation reports are available. Solving this complicated problem is extremely important because apart from ventricular disease, atrial disease accounts for a large part of heart diseases. Therefore, further investigations on the cellular level to reveal the mechanisms are warranted. In this paper, a protocol based on the Langendorff retrograde perfusion method is introduced and some modifications in the depth of aorta cannulation and the steps that may affect the digestion process to isolate atrial and ventricular myocytes were simultaneously made. Moreover, the isolated cardiomyocytes are confirmed to be amenable to patch clamp investigation.

This protocol describes modifications of the Langendorff method including the depth of aorta cannulation for simultaneous Isolation of atrial and ventricular myocytes from adult mice.

Modifikationen der Langendorff-Methode zur gleichzeitigen Isolierung von atrialen und ventrikulären Myozyten aus erwachsenen Mäusen

A single cardiomyocyte is a vital tool in the cellular and subcellular level studies of cardiac biology and diseases as a fundamental unit of contraction ...