Name: isolation and cultivation of adult rat cardiomyocytes
Uploaded: 2017-10-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

Die Autoren danken Nadine Woitasky und Peter Volk für technische Hilfe. Darüber hinaus danken den Autoren für ihre Hilfe bei der Vorbereitung der Handschrift Frau Claudia Lorenz (medizinische Schriftsteller, ACCEDIS). Dieser Handschrift wurde finanziell unterstützt von der DFG (Schlu 324/7-1).

die Untersuchung nach der Anleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren durch die US National Institute of Health (NIH Publikation Nr. 85-23, revidiert 1996) veröffentlicht. In der Regel männliche Wistar-Ratten im Alter von 3 bis 4 Monaten und mit einem durchschnittlichen Gewicht von 250-350 g sind für dieses Protokoll verwendet. Eine Ratte Herz ist ausreichend für 20 Kultur Gerichte (1 mL pro Schale; innen-ø: 35 mm) mit einer ungefähren Zelldichte von 1,5 x 10 4 Zellen/1000 mm 2.
 1. Vorbereitung der Medien und Reagenzien <ol><li>Kreatin Carnitin Taurin Medium (CCT Medium) Hinweis: CCT Medium ist ein komplexes Medium basierend auf Medium 199 mit dem Zusatz von Kreatin, Carnitin und Taurin.
	<ol><li>Bereiten Sie 1 L Medium 199: 3,6 g Hepes und Mix hinzufügen und für 1 h. Dann fügen Sie 655,5 mg Kreatin (5 mM), 395,4 mg Carnitin (2 mM) und 625,5 mg Taurin (5 mM). Carnitin und Taurin ändern pH bis &#60; 7. Um das Wachstum von kontaminierenden Zellen, z. B. Endothelzellen und Fibroblasten hemmen, fügen Sie 10 µM Cytosin β-D-Arabinofuranoside auf das Medium. Den pH mit NaOH (2 mM) auf 7,4 und steriler Filter das Medium anpassen. Speichern der CCT-Medium bei 4 ° c</li>
	</ol></li> <li>Powell Medium <ol><li>für 1 L Powell Medium lösen 6,43 g NaCl (110 mM) mit 0,19 g KCl (2,5 mM), 0,16 g KH 2 PO 4 (1,2 mM), 0,3 g MgSO 4 7 H 2 O (1,2 mM), 5,96 g Hepes (25 mM), und 1,98 g D (+ )-Glucose-Monohydrat (10 mM) in sterilen Aqua. 7.4 und steriler Filter Medium pH mit NaOH (2 M) passen. Shop-Powell-Medium bei 4 ° c</li>
	</ol></li> <li>Kalzium-Chlorid (CaCl 2) <ol><li>vorbereiten eine 100 mM CaCl 2-Lösung (50 mL) und bereiten Aliquote mit 500 µL CaCl 2. Einfrieren der Aliquote bei-20 ° c</li>
	</ol></li> <li>Vorbereitung Kulturmedium <ol><li>bereiten drei Zelle Nährböden: Pre-Beschichtung, Medium, Beschichtung, und Waschmedium. Verwenden Sie CCT-Medium für alle drei Medien (Tabelle 1) als Grundlage. CCT-Medium mit 1 mL pro Kulturschale zu berechnen. Daher bereiten 20 mL CCT Medium für 20 Kultur Gerichte (Innendurchmesser: 35 mm).</li>
		<li>Zelle Kultur Platten: jede Kultur Zellplatte zu beschichten (Innendurchmesser: 35 mm) mit 1 mL Pre-plating Medium. Die beschichteten Platten bei 37 ° C über Nacht oder mindestens 2 Stunden vor der Verwendung zu speichern.</li>
	</ol></li></ol> 2. Isolierung von adulten Kardiomyozyten <ol><li>Vorbereitung von Langendorff Perfusion System <ol><li>erhitzen, Beschichtung und Waschmedium auf 37 ° c ein Rohr von 500 µL CaCl 2 aufzutauen und wiegen 25 mg Kollagenase.</li>
		<li>Bündig Langendorff Perfusion System mit Aqua-steril, danach lassen Sie Powell Medium zirkuliert das System für 5 min.</li>
		<li>80 mL Powell Medium Langendorff Perfusion System einfüllen, ohne irgendwelche Bläschen und Gas das Medium mit 95 % Sauerstoff air.</li>
		<li>Bereiten Sie eine Tube (50 mL) mit 40 mL Powell Medium, auf 37 ° C erwärmen und mit 95 % Sauerstoff gas.</li>
		<li>Bereiten Sie einen Thread von ca. 25 cm Länge zur Befestigung entfernt mitten auf die Kanüle.</li>
		<li>Entfetten eine Rasierklinge mit Alkohol (70 % nach Volumen) und befestigen Sie ihn an den Häcksler. Klemmen Sie eine Kunststoffscheibe in den Häcksler.</li>
	</ol></li> <li>Extraktion des Herzens <ol><li>eine männliche Wistar-Ratten mit 4 % bis 5 % Isofluran zu betäuben und mit zervikale Dislokation zu opfern. Öffnen Sie den Bauch hinter den Rippenbögen mit einem Bauch Scherkräften und mit der gleichen Schere, Schnitt durch die Membran der Brusthöhle öffnen.</li>
		<li>Entfernen Sie das Herz mit der Lunge und Thymus, durch Schneiden oben hoch kranialen Thymus in der Brusthöhle. Übertragen Sie das Material sofort auf eiskalten Salzlösung.</li>
		<li>Der Lunge und Thymus aus dem Herzen mit einer sezierenden Schere (groß) zu entfernen und durch das Material mit der Kapsel Pinzette fixieren, letztere auf eine neue Kochsalzlösung übertragen.</li>
	</ol></li> <li>Isolation <ol><li>entfernen überschüssiges Gewebe, wie Rückstände aus Thymus, Luftröhre, Fett und Bindegewebe aus dem Herzen mit Kapsel Zange und einen sezierenden Schere (groß oder klein). Aufdecken die Aorta und trennen Sie es mit einer sezierenden Schere (groß oder klein) zwischen der ersten und zweiten Kiemen Arch</li>
		<li>Starten das Abtropfen von Langendorff Perfusion System. Platzieren Sie das Herz an der Kanüle von Langendorff Perfusion System und fixieren Sie es zuerst mit einem Krokodil-Klemme und später mit dem vorbereiteten Thread. Spülen Sie das Herz, bis es frei von Blut ist.</li>
		<li>25 mg Kollagenase in 5-6 mL warmen Powell Medium auflösen und Hinzufügen von 12,5 µL CaCl 2 (30 µM).</li>
		<li>Verkehr in unmittelbarer Nähe ein Glastrichter, verbunden mit dem Langendorff Perfusion System, über das tropfende Herz bewegt und die Perfusion System gelöst Kollagenase hinzufügen. Starten Sie die Durchblutung für 25 min mit einer Drop-Geschwindigkeit von 1 Tropfen pro Sekunde. 
		Hinweis: Während der Perfusion, das Herz wird anschwellen und eine wachsartige aussehen.</li>
		<li>Die Perfusion nach 25 min zu stoppen und das Herz aus dem Langendorff Perfusion System entfernen. Der Aorta, Atrien und Bindegewebe aus dem Herzen zu entfernen, und öffnen Sie die Rechte und linke Ventrikel.</li>
		<li>Hacken das Herz zweimal in einem Winkel von 90° (Schnittbreite: 0,7 mm; Geschwindigkeit: 0,15 cm/s). Wiederholen Sie diesen Vorgang manuell mit zwei Skalpelle für 10 s pro Seite.</li>
		<li>12 mL des Mediums Perfusion überführen in ein neues Gefäß (50 mL). Gießen Sie die Zelle Gülle in dieses Medium und Digest Zellen für weitere fünf Minuten bei 37 ° C. Mix Lösung jede Minute.</li>
		<li>Die Lösung mit dem verdauten Herzen durch eine Nylon-Mesh (200 µm) in ein neues Gefäß (50 mL) zu filtern.</li>
		<li>Zentrifugieren die filtrierte Lösung bei 29 X g für 3 min. verwerfen den Überstand und 6 mL warmen Powell Medium darunter 12,5 µL CaCl 2 (250 µM), die Zelle Pellet hinzufügen. Das Pellet durch glatte zitternden Bewegungen aufzuwirbeln. Zentrifugieren Sie wieder bei 29 X g für 2 min. überstand verwerfen und 6 mL warmen Powell Medium mit 25 µL CaCl 2 (500 µM) ersetzt. Auflösen der Zelle Pellet durch sanftes Schütteln Bewegungen und fügen 12 mL warmen Powell mittlere einschließlich 120 µL CaCl 2 (1 mM). Zentrifuge für ein drittes Mal bei 16 X g für 1 min. Wieder entfernen des Überstands.</li>
		<li>Mischen die Zelle Pellet mit dem vorgewärmten Beschichtung Medium.</li>
		<li>Pre-Beschichtung Medium aus Kultur Platten entfernen. 1 mL Plattieren Medium, einschließlich der isolierten Kardiomyozyten auf jede Kultur-Platte zu übertragen. Inkubieren Sie frische isolierte Kardiomyozyten bei 37 ° C für 1 h</li>
		<li>Entfernen der Beschichtung Medium von Kultur-Platten. Fügen Sie 1 mL Waschmedium auf jede Kultur-Platte und die Platten bei 37 ° C bis zu sechs Tage ohne Ändern des Mediums speichern.</li>
		<li>Zur Untersuchung des Einfluss der verschiedenen Chemikalien und Behandlungen auf ARVC, zuerst aktualisieren Beschichtung Medium indem Waschmedium und danach verschiedene Chemikalien. 
		Hinweis: Auswertung mit Lichtmikroskopie: mit jeder Zelle Vorbereitung, 150 bis 300 Kardiomyozyten sollte pro Tag von Lichtmikroskopie überwacht werden. Alle gezählte Kardiomyozyten nach ihrem Auftritt in Gruppen zu unterteilen (z. B. &#34; stabförmigen &#34;, &#34; abrunden &#34;, &#34; Verbreitung &#34;, und &#34; ungewöhnliches Aussehen &#34;). Die Kategorie &#34; Verbreitung &#34; umfasst alle Herzmuskelzellen mit Pseudopodien-ähnlichen Strukturen. &#34; Ungewöhnliches Aussehen &#34; umfasst alle ARVC mit einer unregelmäßigen Oberfläche und keine nachweisbaren intakte Zellmembran.</li>
	</ol></li></ol> 3. Beispiel Experimente <ol><li><ol><li>Analyze morphologischen und strukturelle Umwandlungen von ARVC während des Anbaus durch konfokale Lasermikroskopie Fluoreszenz/Immunfluoreszenz-Färbung der adulten Kardiomyozyten. Mithilfe von Phalloidin-TRITC F-Aktin Strukturen untersuchen &#34; stabförmigen &#34;, &#34; abrunden &#34;, und &#34; verbreiten &#34; ARVC. Führen Sie nach Angaben des Herstellers Färbung &#39; s-Protokoll. Ein Beispiel für Phalloidin-TRITC Färbung erhält in Referenz Nippert Et al. 11. mit Fluoreszenz/Immunfluoreszenz-Färbung, Unterschiede in der de - und re - differentiation des kontraktilen Apparates in kultivierten adulten Kardiomyozyten zwischen experimentelle Behandlungen (z. B. mit Swiprosin-1, Ionomycin) untersucht werden können.</li>
	</ol></li> <li>Echtzeit-quantitative RT-PCR (qRT-PCR) <ol><li>durchführen qRT-PCR um Veränderungen in der mRNA Expression verschiedener Gene zu untersuchen (z. B. OSM, Swiprosin-1, β-MHC) während des Anbaus der ARVC. Für ausreichende Stichprobengröße verwenden größere Kultur Gerichte (Innendurchmesser: 60 mm) mit 2 mL Volumen. ARVC fünf Kultur Gerichte ergibt eine Probe. Isolierung von mRNA und Transformation der cDNA nach Angaben des Herstellers durchführen &#39; s Protokoll.</li>
	</ol></li> <li>Immunoblot-Techniken <ol><li>führen Western Blots, Änderungen im Protein-Expression (z. B. für Swiprosin-1) während des Anbaus der ARVC zu untersuchen. Verwenden einer Kulturschale (1 mL) pro Probe.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Schl&#252;ter, K. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cardiomyocytes - Active Players in Cardiac Disease. , (2016).</li><li>Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+calcium+stable+adult+cardiac+myocytes.">Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).</li><li>Schl&#252;ter, K. -. D., Schreiber, D., Fabbro, D., McCormick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+ventricular+cardiomyocytes:+isolation+and+culture.">Adult ventricular cardiomyocytes: isolation and culture.</a> Protein Tyrosine Kinases: From Inhibitors to Useful Drugs. 290, 305-314 (2005).</li><li>Eppenberger, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+analysis+of+the+regeneration+of+myofibrils+in+long-term+cultures+of+adult+cardiomyocytes+of+the+rat.">Immunocytochemical analysis of the regeneration of myofibrils in long-term cultures of adult cardiomyocytes of the rat.</a> Dev. Biol. 130 (1), 1-15 (1988).</li><li>Burrows, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cultivation+of+tissues+of+the+chick-embryo+outside+the+body.">The cultivation of tissues of the chick-embryo outside the body.</a> JAMA. 55 (24), 2057-2058 (1910).</li><li>Cavanaugh, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsation,+migration+and+division+in+dissociated+chick+embryo+heart+cells+in+vitro.">Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro.</a> J Exp Zool A Eco Genet Physiol. 128 (3), 573-589 (1955).</li><li>Muir, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+observation+on+the+cellular+structure+of+cardiac+muscle.">Further observation on the cellular structure of cardiac muscle.</a> J. Anat. 99, 27-46 (1965).</li><li>Powell, T., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+technique+for+the+isolation+and+purification+of+adult+cardiac+muscle+cells+having+respiratory+control+and+a+tolerance+to+calcium.">A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium.</a> Biochem. Biophys. Res. Com. 72 (1), 327-333 (1976).</li><li>Schwarzfeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+development+in+cell+culture+of+myocardial+cells+of+the+adult+rat.">Isolation and development in cell culture of myocardial cells of the adult rat.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 13 (6), 563-575 (1981).</li><li>Kubin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncostatin+M+is+a+major+mediator+of+cardiomyocyte+dedifferentiation+and+remodeling.">Oncostatin M is a major mediator of cardiomyocyte dedifferentiation and remodeling.</a> Cell Stem Cell. 9 (5), 420-432 (2011).</li><li>Nippert, F., Schreckenberg, R., Hess, A., Weber, M., Schl&#252;ter, K. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+Swiprosin-1+on+the+formation+of+pseudopodia-like+structures+and+&#946;-adrenoceptor+coupling+in+cultured+adult+rat+ventricular+cardiomyocytes.">The effects of Swiprosin-1 on the formation of pseudopodia-like structures and &#946;-adrenoceptor coupling in cultured adult rat ventricular cardiomyocytes.</a> PLoS ONE. 11 (12), e0167655 (2016).</li><li>Moses, R. L., Claycomb, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorganization+and+reestablishment+of+cardiac+muscle+cell+ultrastructure+in+cultured+adult+rat+ventricular+muscle+cells.">Disorganization and reestablishment of cardiac muscle cell ultrastructure in cultured adult rat ventricular muscle cells.</a> J. Ultrastruct. Res. 81 (3), 358-374 (1982).</li><li>Eppenberger-Eberhardt, M., Flamme, I., Kurer, V., Eppenberger, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reexpression+of+&#945;-smooth+muscle+actin+isoform+in+cultured+adult+rat+cardiomyocytes.">Reexpression of &#945;-smooth muscle actin isoform in cultured adult rat cardiomyocytes.</a> Dev. Biol. 139 (2), 269-278 (1990).</li><li>Fedak, P. W., Verma, S., Weisel, R. D., Skrtic, M., Li, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+remodeling+and+failure:+from+molecules+to+man+(Part+III).">Cardiac remodeling and failure: from molecules to man (Part III).</a> Cardiovasc. Pathol. 14 (3), 109-119 (2005).</li><li>Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+myocardial+regeneration.">Mechanisms of myocardial regeneration.</a> Trends Cardiovasc. Med. 21 (2), 52-58 (2011).</li><li>Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+remodeling-concepts+and+clinical+implications:+A+consensus+paper+from+an+international+forum+on+cardiac+remodeling.">Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an international forum on cardiac remodeling.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 35 (3), 569-582 (2000).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular biology of the cell. , (2015).</li><li>P&#246;ling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Janus+face+of+OSM-mediated+cardiomyocyte+dedifferentiation+during+cardiac+repair+and+disease.">The Janus face of OSM-mediated cardiomyocyte dedifferentiation during cardiac repair and disease.</a> Cell Cycle. 11 (3), 439-445 (2014).</li><li>Decker, M. L., Behnke-Barclay, M., Cook, M. G., Lesch, M., Decker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+evaluation+of+the+contractile+apparatus+in+primary+cultures+of+rabbit+cardiac+myocytes.">Morphometric evaluation of the contractile apparatus in primary cultures of rabbit cardiac myocytes.</a> Circ. Res. 69 (1), 86-94 (1991).</li></ol>

Die dargestellten Ergebnisse sind Teil der Doktorarbeit von Franziska Nippert.

Das Verhalten der Erwachsenen Herzzellen in Vivo ist beeinflusst durch viele Interaktionen mit anderen Zellen (z.B.Neuronen, Endothelzellen, Fibroblasten, Entzündungszellen) und die elektrischen Synzytien bilden sie1. Studium Stress Anpassung der adulten Kardiomyozyten ausschließlich erfordert daher, die Isolierung und Kultivierung ARVC. Die wichtigsten Auswirkungen der Isolierung und Kultivierung ARVC sind: 1) trennen sie von der extrazellulären Matrix und Zell-Zell Kontakte;...

Adulten Herzmuskelzellen in Vivo Arbeit als eine elektrische Synzytien nach Zell-Zell-Kontakten zwischen Myozyten. Darüber hinaus werden sie von benachbarten Zellen wie kardialen Fibroblasten, Endothelzellen, Neuronen und Entzündungszellen1beeinflusst. Um die Fähigkeit der Kardiomyozyten Anpassung ihrer intrazellulären Organisation zu studieren verändert Lastbedingungen, wie gesehen in Herzhypertrophie, die ein erster Schritt zur Herzinsuffizienz, die Isolierung und Kultivierung von Erwachsenen ventrikuläre Ratte führt Herzmuskelzellen (ARVC) ist notwendig2,3,4. In der Vergangenheit wurden Kardiomyozyten zunächst isoliert von embryonalen Küken Herzen5,6. Wenige Jahre später, wurde die erste Isolierung der unheilbar differenzierter Herzmuskelzellen mit Kalzium Erschöpfung7beschrieben. Allerdings diese adulten Kardiomyozyten waren nicht Kalzium tolerant und daher nicht für funktionelle Assays verwendet werden konnten. Schließlich, im Jahr 1976 ein neues Protokoll aktiviert Powell und Twist Erwachsenen ventrikuläre Herzzellen unter physiologischen Bedingungen8zu untersuchen. Als ersten Schritt isoliert sie Erwachsene Herzzellen unter niedrigen Kalzium-Konzentrationen und danach erhöhte Kalzium zu physiologischen Konzentrationen in einem schrittweisen Verfahren. Heute die meisten Protokolle zur Isolierung und Kultivierung von adulten Kardiomyozyten arbeiten mit diesem Kalzium-Protokoll und Kollagenase für die enzymatische Verdauung von dichten Zell-Zell Kontakte1verwenden.
Für einen erfolgreichen Anbau ist fetalen Kälberserum (FCS) oder Oncostatin M (OSM) erforderlich. ARVC führen eine de - und re - differentiation mit umfangreichen strukturellen Veränderungen einschließlich Sarkomers Demontage und Reformation9,10,11,12. Dieser Prozess ist durch einen erneuten Ausdruck der fetalen Typ Gene, wie β-Myosin heavy Chain (β-MHC) begleitet, wie man von Hypertrophie und eine Bildung von Pseudopodien-ähnliche Strukturen, auch genannt Verbreitung4,11, 13. Darüber hinaus Swiprosin-1 (EFHD2), ein neu identifizierten Protein spielt eine wichtige Rolle bei der erneuten Differenzierung der kultivierten ARVC11. Infolgedessen ARVC in Kultur verwandeln sich in weit verbreiteten, polymorphe Zellen, die Kontraktionen spontan nach zwei bis drei Wochen in Kultur2,4,14zeigen.
Die jüngsten Entdeckungen haben gezeigt, dass kardiale Re und de differentiation wie sie unter Kulturbedingungen Mimik Auftritt gesehen in Vivo während kardiale Umbau10,15bietet. Kardialen remodeling ist ein Schlüsselprozess bei Herzkrankheiten16. Da Herzerkrankungen noch die häufigste Todesursache in den industrialisierten Gesellschaften sind, ist es wichtig, ein besseres Verständnis der Biologie der adulten Kardiomyozyten (wer, 2015). Isolierung und Kultivierung ARVC können helfen, um neue Strategien und Medikamente für die Behandlung von Herzkrankheiten zu entwickeln. Mit diesem Manuskript ist ein Protokoll für die Isolierung und Kultivierung ARVC zur Verfügung gestellt. Darüber hinaus werden einige kritische Teile dieser Methode in die Diskussion Abschnitt hervorgehoben.

<table><tbody><tr><td>Langendorff perfusion system</td><td>inhouse construction</td><td></td><td>double-walled with a water&lt;br/&gt; based heating system</td></tr><tr><td>Tissue chopper Mc Ilwain</td><td>Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aortic Cannula, OD 1,8 mm</td><td>inhouse construction</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Abdominal shears</td><td>Aeskulap</td><td>BC772R</td><td></td></tr><tr><td>Capsule forceps</td><td>Eickemeyer</td><td>171307</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scissor large</td><td>Aeskulap</td><td>BC562R</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scissor small</td><td>Aeskulap</td><td>BC163R</td><td></td></tr><tr><td>Mash with Polyamid</td><td>Neolab</td><td>4-1413</td><td>mash size 200 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>plastic disc</td><td>Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Typ II</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and cultivation of adult rat cardiomyocytes

In einem intakten Herzen beeinflussen benachbarte Zellen adulten Kardiomyozyten. Mit der Methode der Isolierung und Kultivierung von adulten Kardiomyozyten ist eine genaue Untersuchung des Verhaltens dieser Zellen unter bestimmten Behandlungen und Umgebungen möglich. Diese Handschrift enthält ein Protokoll für erfolgreiche Isolierung und Kultivierung von Erwachsenen Ratte ventrikuläre Kardiomyozyten (ARVC).
Die Ratte ist durch zervikale Dislokation Tiefe Narkose geopfert. Dann, das Herz wird extrahiert und die Aorta ist aufgedeckt. Anschließend wird die Perfusion auf dem Langendorff Perfusion System mit Kalzium Erschöpfung und Kollagenase-Behandlung durchgeführt. Danach bekommt ventrikuläre Gewebe gehackt, wieder in Umlauf gebracht, und gefiltert, gefolgt von drei Zentrifugation Schritte mit allmählicher Zugabe von CaCl2 bis physiologischer Calcium-Konzentration erreicht ist. ARVC sind beschichtet, auf Zelle Kultur Gerichte. Nach dem Aktualisieren der Zellkulturmedium, können ARVC kultiviert bis zu sechs Tage lang ohne Änderung der Serum-haltigen Kulturmedium. Isolierung von ARVC ist ein Kalzium sensibler Prozess. Kleine Änderungen in der intrazellulären Calcium-Konzentration führen eine Abnahme in der Qualität und Rentabilität der isolierten Zellen.
Frisch isolierte ARVC Rod geformt sind. In den ersten Tagen des Anbaus verlieren sie die stabförmige Morphologie und Form Pseudopodien-ähnliche Strukturen (Verbreitung). Während dieser morphologischen Bildung ARVC zunächst verschlechtern ihre kontraktile Elemente, gefolgt von einer Reformation durch Aktin Stress Fasern und de Novo Sarcomerogenesis. Nach einer Woche des Anbaus die meisten ARVC zeigen eine weit verbreitete Erscheinung mit einem eindeutig nachweisbar Kreuz Streifenbildung. Dieser Prozess ist empfindlich auf intrazellulären Calcium-Konzentration, wie Behandlung mit Ionomycin Ausbreitung vermindert. Wichtigsten Marker in diesem Prozess der de - und re - differentiation sind β-Myosin heavy Chain (β-MHC), Oncostatin M (OSM) und Swiprosin-1 (EFHD2). Jüngste Studien haben vorgeschlagen, dass kardiale Re und de differentiation Auftritt unter Kulturbedingungen Funktionen gesehen in Vivo bei kardialen remodeling imitiert. Isolierung und Kultivierung ARVC spielen daher eine Schlüsselrolle für das Verständnis der Biologie der Herzmuskelzellen.

Erwachsenen Herzzellen in Kultur: Abbildung 1 zeigt eine Übersicht über frisch isolierte adulten Kardiomyozyten 2 h nach dem letzten waschen. Etwa 75 % aller Herzzellen hatte eine stabförmige Morphologie. Die restliche 25 % zeigten eine ungewöhnliche Erscheinung mit einer Runde Morphologie und keine nachweisbaren intakte Zellmembran (Abbildung 1). Am Ende des Anbaus (6. Tag), bis zu 15 % der alle Herzmuskelze...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Isolierung und Kultivierung von Erwachsenen Ratte ventrikuläre Kardiomyozyten (ARVC). Isolierte ARVC kann für kurz- und langfristige Anbau verwendet werden. Die Isolierung und Kultivierung ARVC können eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung von neuen Behandlungsschemata für kardiale Erkrankungen spielen.

Isolierung und Kultivierung von Erwachsenen Ratte Kardiomyozyten

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

isolation-and-cultivation-of-adult-rat-cardiomyocytes

Research

JoVE Journal

Medicine

15.5K Aufrufe.  Justus Liebig University Giessen. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Isolierung und Kultivierung von Erwachsenen Ratte ventrikuläre Kardiomyozyten (ARVC). Isolierte ARVC kann für kurz- und langfristige Anbau verwendet werden. Die Isolierung und Kultivierung ARVC können eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung von neuen Behandlungsschemata für kardiale Erkrankungen spielen.

Serie: Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

Isolation and Cryopreservation of Neonatal Rat Cardiomyocytes

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is difficult and time consuming. The most commonly used cells are neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs), which require isolation every time cells are needed. The birth of the rats can be unpredictable. Cryopreservation is proposed to allow for cells to be stored until needed, yet freezing/thawing methods for primary cardiomyocytes are challenging due to the sensitivity of the cells. Using the proper cryoprotectant, dimethyl sulfoxide (DMSO), cryopreservation was achieved. By slowly extracting the DMSO while thawing the cells, cultures were obtained with viable NRCMs. NRCM phenotype was verified using immunocytochemistry staining for &#945;-sarcomeric actinin. In addition, cells also showed spontaneous contraction after several days in culture. Cell viability after thawing was acceptable at 40-60%. In spite of this, the methods outlined allow one to easily cryopreserve and thaw NRCMs. This gives researchers a greater amount of flexibility in planning experiments as well as reducing the use of animals.

The isolation of neonatal rat cardiomyocytes is a time consuming and unpredictable procedure. This study describes methods for cryopreservation and thawing of neonatal rat cardiomyocytes that allows for more efficient use of cells. The thawed NRCMs can be used for various experiments without the need for performing isolations each time.

Isolierung und Kryokonservierung von neonatalen Rattenkardiomyozyten

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

Primäre Kultur der erwachsenen Ratte Herz Myozyten

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Biologie

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

Isolation und genetische Manipulation von Adult Herzmuskelzellen für konfokale Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

Isolation und Kultur der Neugeborenen-Maus-Kardiomyozyten

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

Isolierung, Kultur, und funktionelle Charakterisierung der erwachsenen Maus Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation of Atrial Cardiomyocytes from a Rat Model of Metabolic Syndrome-related Heart Failure with Preserved Ejection Fraction

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of metabolic syndrome (MetS)-related heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF). The prevalence of MetS-related HFpEF is rising, and atrial cardiomyopathies associated with atrial remodeling and atrial fibrillation are clinically highly relevant as atrial remodeling is an independent predictor of mortality. Studies with isolated single-cell cardiomyocytes are frequently used to corroborate and complement in vivo findings. Circulatory vessel rarefication and interstitial tissue fibrosis pose a potentially limiting factor for the successful single-cell isolation of ACMs from animal models of this disease.
We have addressed this issue by employing a device capable of manually regulating the intraluminal pressure of cardiac cavities during the isolation procedure, substantially increasing the yield of morphologically and functionally intact ACMs. The acquired cells can be used in a variety of different experiments, such as cell culture and functional Calcium imaging (i.e., excitation-contraction-coupling).
We provide the researcher with a step-by-step protocol, a list of optimized solutions, thorough instructions to prepare the necessary equipment, and a comprehensive troubleshooting guide. While the initial implementation of the procedure might be rather difficult, a successful adaptation will allow the reader to perform state-of-the-art ACM isolations in a rat model of MetS-related HFpEF for a broad spectrum of experiments.

Here, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes from a rat model of metabolic syndrome-related heart failure with preserved ejection fraction. A manual regulation of intraluminal pressure of cardiac cavities is implemented to yield functionally intact myocytes suitable for excitation-contraction-coupling studies.

Isolierung von Vorhofflimmern Herzzellen aus einem Rattenmodell der metabolischen Syndrom im Zusammenhang mit Herzinsuffizienz mit erhaltener Auswurffraktion

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of ...

Medizin

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation und Kultur der erwachsenen Maus Kardiomyozyten für Cell Signaling und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Herzhypertrophie

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

Isolierung, Kultur und Transduction von erwachsenen Maus Kardiomyozyten

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and molecular functional experiments (e.g., contraction, electrophysiology, calcium cycling, etc.) on cardiomyocytes are the gold standard for establishing mechanism(s) of disease. The mouse is the species of choice for functional experiments and the described technique is specifically for the isolation of mouse cardiomyocytes. Previous methods requiring a Langendorff apparatus require high levels of training and precision for aortic cannulation, often resulting in ischemia. The field is shifting toward Langendorff-free isolation methods that are simple, are reproducible, and yield viable myocytes for physiological data acquisition and culture. These methods greatly diminish ischemia time compared to aortic cannulation and result in reliably obtained cardiomyocytes. Our adaptation to the Langendorff-free method includes an initial perfusion with ice-cold clearing solution, use of a stabilizing platform that ensures a steady needle during perfusion, and additional digestion steps to ensure reliably obtained cardiomyocytes for use in functional measurements and culture. This method is simple and quick to perform and requires little technical skill.

The gold standard in cardiology for cellular and molecular functional experiments are cardiomyocytes. This article describes adaptations to the non-Langendorff technique to isolate mouse cardiomyocytes.

Eine einfache und effektive Methode zur konsistenten Isolierung von Maus-Kardiomyozyten

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular mechanisms of cardiovascular disease progression such as cardiac hypertrophy, fibrosis, and atherosclerosis. Although several attempts with variable success have been made to develop immortalized cell lines from the cardiovascular system to understand these cellular mechanisms, primary cells offer a more natural and close to in vivo environment for such studies. Therefore, different laboratories working on a particular cell type have developed protocols to isolate individual types of rat cardiac cells of interest. A protocol that allows the isolation of more than one cell type, however, is missing. Here an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation and enables their use for cellular analyses. This permits the most efficient use of available resources, which may save time and reduce research costs.

Several protocols have been developed and described for the isolation of different cardiac cell types from a rat heart. Here, an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation, reducing the experimental costs.

Gleichzeitige Isolierung von hochwertigen Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten aus einem erwachsenen Rattenherz

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...