Die Autoren danken Prof. M. Dietel und Dirk Schumacher für die Unterstützung dieser Arbeit und die kritische Durchsicht des Manuskripts. Die Forschung, die zu diesen Ergebnissen geführt Unterstützung der Innovative Medicines Initiative Joint Undertaking unter Finanzhilfevereinbarung n ° 115234, Ressourcen, von denen die finanzielle Beteiligung Siebten Rahmenprogramms der Europäischen Union (FP7/2007-2013) und EFPIA Unternehmen in zusammengesetzt sind erhalten Sacheinlage. Diese Arbeit wurde von der Berliner Krebsgesellschaft (BKG) unterstützt.

Das Gesamtkonzept des Versuchs einschließlich der Herstellung von primären Zellen aus Single-Tumorgewebe Charakterisierung des primären Zellkultur, Fibroblasten-Depletion und magnetische Zellsortierung von CD133 und CD133 + - Melanomzellen ist in Abbildung 1 gezeigt. Ein. Beispiel Acquisition <ol><li> Überprüfen ethischen Zulassung vor der Prüfung die nächsten Schritte. </li><li> Bereiten Sie eine 50-ml-Tube mit sterilem PBS mit 1% Penicillin-Streptomycin Endkonzentration und Übergabe der Operation OP-Team ergänzt. </li><li> Organisieren schnellen Transport von Tumorgewebe von Operation Zellkulturlabor bei 4 ° C. </li></ol> 2. Herstellung von primären Melanom Single-Zellen aus Tumorgewebe <ol><li> Führen Sie alle Schritte unter sterilen Bedingungen. </li><li> Vor Resektion des Tumors, muss man die Dissoziation zuzubereiten. 10 ml Dissoziation Mix pro 2-4 g Gewebe erforderlich ist. Die Mischung kann Immedia verwendet werdenTely oder in 10 ml-Aliquots bei -20 ° C für die spätere Verwendung gespeichert. <ol><li> Vorbereiten einer Lösung enthaltend 150 mM Natriumchlorid. Mix mit einem Vortex, bis die Lösung klar ist. Bei Bedarf steril Filtrat Natriumchlorid-Lösung mit einer 0,22 um-Filter. </li><li> Abzuwiegen DNase I und Herstellung einer Lösung, die 10 mg / ml DNase I in 150 mM Natriumchlorid. Mix durch Invertieren, bis die Lösung klar ist. </li><li> Bereiten Sie eine Lösung mit 100mg/ml Collagenase IV in PBS. Mix durch Invertieren, bis die Lösung klar ist. Aliquots von Kollagenase-Lösung kann bei -20 ° C für mehrere Monate gelagert werden. </li><li> Bereiten Sie die Dissoziation Mischung mit einer Endkonzentration von 1% Penicillin-Streptomycin, 1 mg / ml Kollagenase IV und 0,1 mg / ml DNase I in Quantum 263 Medium. Mix mit einem Vortex. Optional: bei Verwendung von der Haut Melanomgewebe merken Amphotericin B-Lösung zur Dissoziation Mischung abgeleitet zu einer Endkonzentration von 1,5 ug / ml Amphotericin B. </li></ol></li><li> Pre-warm die required Mengen Dissoziation Mischung, PBS und Quantum 263 mittel bis 37 ° C. </li><li> Ort Tumorgewebe auf einer sterilen Petrischale. Absaugen übermäßige Lösung aus dem Gewebe und 500 ul Dissoziation Mix. Mince Tumor in kleine Stücke von 2-4 mm mit frischen, sterilen Skalpellen. </li><li> Transfer 2-4 g Hackfleisch Tumorgewebe in einem gentleMACS C Tube mit 5 ml Dissoziation Mix. Spülen Petrischale mit zusätzlichen 4,5 ml Dissoziation Mix und fügen übrigen Gewebefragmente der gentleMACS C Tube. </li><li> Schließen gentleMACS C Rohr und befestigen Sie sie kopfüber auf der Hülse des gentleMACS Dissoziator. Führen Sie das gentleMACS Programm &quot;h_tumor_01&quot;. </li><li> Nehmen Sie den gentleMACS C Rohr aus dem Dissoziator und inkubieren Sie die Probe für 30 min bei 37 ° C unter ständiger Rotation mit dem MACSmix Tube Rotator auf dem höchsten Laufgeschwindigkeit (12 rpm) oder durch Drehen des Rohres manuell alle 5 min ständiger Gewebefragmente resuspendieren . </li><li> Bringen gentleMACS C Rohr kopfüber auf dem Ärmel ter gentleMACS Dissoziator und führen Sie das gentleMACS Programm &quot;h_tumor_02&quot;. </li><li> Nehmen Sie den gentleMACS C Rohr aus dem Dissoziator und inkubieren Sie die Probe für 30 min bei 37 ° C unter ständiger Rotation mit dem MACSmix Tube Rotator auf dem höchsten Laufgeschwindigkeit (12 rpm) oder durch Drehen des Rohres manuell alle 5 min ständiger Gewebefragmente resuspendieren . </li><li> Bringen gentleMACS C Rohr kopfüber auf der Hülse des gentleMACS Dissoziator und führen Sie das gentleMACS Programm &quot;h_tumor_03&quot;. </li><li> Nehmen Sie den gentleMACS C Rohr aus dem Dissoziator, resuspendieren Probe und gelten die Zellsuspension auf eine 70 um Zellsieb auf einem 50 ml Röhrchen gegeben. Wenn ein Verstopfen des Filters auftritt, rühren Zellsuspension mit einem Sterilfilter Spitze bis zur vollständigen Suspension durchlief. </li><li> Spülen Zellsieb mit 5 ml Quantum 263 Medium. </li><li> Optional: wenn Sie noch Gewebestücke in den Filter, resuspendieren Fragmente in Quantum 263 mittel-und Saatgut in einer geeigneten Zellkultur dis linksh. Inkubieren Fragmente bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Entsorgen Zellsieb und schließen Sie die 50 ml Tube mit der verdauten Zellsuspension. Zentrifuge Zellsuspension für 5 min bei 300 xg und Überstand verwerfen. </li><li> Optional: Wenn Zellpellet erscheint rot aufgrund einer hohen Menge an Erythrozyten vorzubereiten 1x Red Blood Cell Lysis Solution durch Verdünnen 10x Lösung 1:10 in doppelt destilliertem Wasser, Zellpellet in 500 ul PBS und 5 ml 1x Red Blood Cell Lysis Solution. Vortex 5 sec und Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min. Zentrifuge für 5 min bei 300 xg und Überstand verwerfen. </li><li> Resuspendieren Tumorzellen mit Quantum 263 und Saatgut die Zellen in geeigneten Zellkultur-Flasche. Kultur Tumorzellen bei 37 ° C und 5% CO 2 und routinemäßig Durchgang Zellen, wenn sie 80% Konfluenz erreichen. </li></ol> 3. Charakterisierung von primären Zellkultur und Fibroblast Depletion <ol><li> Analysieren primäre Zellkultur phänotypisch mit einem mikroskopischenpe. </li><li> Ernten eine geringe Menge (0,5 x 10 6 Zellen) des primären Zellkultur und führen RT-PCR mit Primern für neoplastische-, Melanom-, Stammzell-und Stromazelle Markergene. Die wichtigsten Gene zu analysieren sind CD90 (Fibroblasten Marker), TYR (Melanom / Melanozyten Marker), CD133 (Krebsstammzellen Marker), CD83 (Marker für reife dendritische Zellen) und ein Housekeeping-Gen (zB HPRT oder GAPDH). </li><li> Wenn mikroskopische Analyse und hohe Expression von CD90 während der RT-PCR ergab eine hohe Kontamination des primären Melanomen Kultur mit Fibroblasten, müssen Sie Fibroblasten mit den Anti-Fibroblasten MicroBeads und D Säulen von Miltenyi erschöpfen. </li></ol> 4. Magnetic Cell Sorting von CD133 + und CD133 - Melanomzellen mit LS Columns <ol><li> Planen MACS-Puffer, enthaltend 2 mM EDTA und 5% FCS in PBS. Mix durch Invertieren und steril Filtrat Puffer unter Verwendung eines 0,22 um Steritop-GP Filter Unit. Chill Puffer auf 4-8 ° Cund entgasen vor dem Gebrauch. </li><li> Pre-warm Accutase, PBS und Quantum 263 mittel-bis 37 ° C. </li><li> Waschen 80% konfluenten Zellen mit PBS. Fügen Sie entsprechende Menge Accutase und inkubieren, bis die Zellen aus der Kultur Oberfläche lösen. Collect Zellen in einem 50 ml-Röhrchen mit 263 Quantum Medium. </li><li> Ermitteln der Zellzahl und zentrifugieren die erforderliche Anzahl von Zellen (Laut Miltenyi dem Protokoll eine maximale Anzahl von 2x 10 9 Zellen pro LS Spalte geladen werden kann. Zelllinie spezifische optimalen Zahlen bestimmt werden sollte, und kann wesentlich geringer sein.) Für 5 min bei 300 xg und 4-8 ° C. Absaugen Überstand vollständig. </li><li> Resuspendieren maximal 1x 10 8 Zellen mit 350 ul MACS-Puffer (für höhere Zellzahlen bis zu skalieren alle folgenden MACS-Puffer, FcR Blockierungsreagenz, CD133/1-Biotin und Anti-Biotin MicroBeads Volumina entsprechend). </li><li> Fügen Sie 100 ul FcR Blockierungsreagenz. </li><li> Fügen Sie 50 ul CD133/1-Biotin. Mix gut mit einem Vortex und inkubieren bei 4-8 ° C foder 10 min. </li><li> Waschen der Zellen durch Zugabe von 10 ml MACS-Puffer und Zentrifugieren für 5 min bei 300 xg und 4-8 ° C. Absaugen Überstand vollständig. </li><li> Wiederholen Waschschritt (4,8) </li><li> Zellpellet mit 400 ul MACS-Puffer. </li><li> Fügen Sie 100 ul Anti-Biotin-Mikrokugeln. Mix gut mit einem Vortex und inkubieren bei 4-8 ° C für 15 min. </li><li> Unterdessen bereiten die MACS Separator für die magnetische Separation. Bringen QuadroMACS um MACS Separator Multi Stand. Legen die erforderliche Anzahl von Spalten mit den LS Spalte Flügel nach vorne in dem magnetischen Feld des QuadroMACS. Legen Sie eine Pre-Separation Filter (mit 30 um Nylon-Mesh) in jedes LS Säule und einer entsprechenden Sammelstelle Rohr (15 ml oder 50 ml) unter jeder Spalte. Planen Filter und Spalte durch Spülen mit 3 ml MACS-Puffer. Durchfluss verwerfen. </li><li> Waschen der Zellen durch Zugabe von 10 ml MACS-Puffer und Zentrifugieren für 5 min bei 300 xg und 4-8 ° C. Absaugen Überstand vollständig. </li><li> Die Zellen mit 500 ulMACS-Puffer und gelten Zellsuspension auf die LS Spalte mit dem Pre-Separation Filter. </li><li> Waschen dreimal mit 3 ml MACS-Puffer pro Spalte. Nur neue Puffer, wenn die Spalte leer ist. </li><li> Die gesammelten Gesamtabwassers enthält die unmarkierte CD133 - Zellfraktion. </li><li> Entsorgen Sie die Pre-Separation Filter entfernen Spalte aus dem Separator und legen Sie sie auf einer geeigneten Sammelstelle Rohr. </li><li> Bewerben 5 ml MACS-Puffer. Unmittelbar spülen die markierten CD133 + Zellen, die durch fest drückt den Kolben in die Spalte. </li><li> Um die Reinheit des negativen Fraktion zu erhöhen, wird Zellsuspension auf eine neue äquilibriert LS Spalte in der QuadroMACS eingefügt. Der Abstrom enthält die CD133 - Fraktion. </li><li> Entsorgen Sie Spalten. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Um Kontaminationen Erythrozyten aus dem Tumor Zellpellet entfernen empfehlen wir unter Verwendung des roten Blutkörperchens Lyselösung von Miltenyi. Die Vorteile Lysieren der Erythrozyten gegenüber dem traditionellen Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation sind, dass sie schneller und einfacher ist. Weiterhin werden Verunreinigungen mit Ficoll oder roten Blutkörperchen und dem Verlust von Tumorzellen vermieden. Wenn Sie das Wachstum von Fibroblasten in der primären Zellkultur beobachten sie sollten sofort entfernt we...

Kutane maligne Melanome sind die am wenigsten verbreitet, doch die meisten tödlichen Form von Hautkrebs. Aufgrund der steigenden Inzidenz, ein hoher Grad der Bösartigkeit und einer raschen Verbreitung, Melanome machen inzwischen 75% der malignen Hauttumoren Todesfälle 1,2. Neben chirurgischen Exzision des Primärtumors, Chemotherapie, Strahlentherapie, Immuntherapie und kombinierte Chemo-und Immuntherapie des metastasierten Melanoms sind die state-of-the-art Strategien für Melanom Behandlung 3,4. Allerdings ist das maligne Melanom durch eine schlechte Reaktion auf Chemotherapeutika (5-12%) 5,6, und nur diejenigen, 50-70% der Melanom-Patienten mit der BRAF V600E Genmutation profitieren von vielversprechenden neuen zielgerichteten Therapien wie die Behandlung mit vemurafenib 7 Um gekennzeichnet Verbesserung der allgemeinen Überlebensrate, wird ein viel besseres Verständnis der Mechanismen der Melanom Tumorgenese benötigt. Um diese Mechanismen in der Vergangenheit gut etablierte kommerzielle studierenallem zur Verfügung stehenden Zelllinien verwendet wurden. Neuere Ansätze, um die molekularen Ereignisse von Krebs Initiation und Progression zu studieren nutzen primären Kulturen direkt aus Tumorgewebe - eine Strategie Lager vielfältigen Vorteile: Der Forscher hat die volle Kontrolle des Patienten und Gewebe Auswahl. Die Zellproben gewonnenen fachmännisch ausgewählt Tumorgewebe, ähneln den Tumor mit all ihrer Heterogenität und Follow-up-Daten des Patienten und eine detaillierte Pathologie ist verfügbar, um die Charakteristiken der Kultur mit denen des ursprünglichen Tumors 8 verglichen werden. Im Gegensatz dazu ist die Verwendung von etablierten Zelllinien als relevant Modellsystemen in der Krebsforschung kontrovers diskutiert. Bereits 1987 Osborne und Kollegen beschrieben signifikante biologische Unterschiede zwischen humanen MCF-7 Brustkrebs-Zelllinien aus verschiedenen Laboratorien 9. Diese umfassende genomische Instabilität und Variation in RNA Expression während der Subkultur war Confirmed durch Hiorns et al. und sofern unterstützenden Daten nach Beweisen, dass Zelllinien nicht in Kultur zu entwickeln und damit eine Schwächung der direkten Relevanz solcher etablierten Kulturen als Modelle von Krebs beim Menschen 10. Ein weiterer wichtiger Aspekt, der weitgehend über die Jahre ignoriert wurde, ist das Risiko einer Kontamination oder übermäßiges Wachstum von Kulturen mit fremden &#39;false&#39; Zellen, die erste hervorgehoben wurde vor über zwanzig Jahren durch den Nachweis, dass eine große Anzahl von Zelllinien durch HeLa kontaminiert waren Zellen 8,11. Die Fehlinterpretation von Daten aus &#39;false&#39; Zelllinien hat vor kurzem gekommen, um in der Literatur wieder anzuzünden. Mit einer Kombination von DNA-Profiling und molekularen Zytogenetik zeigte MacLeod et al., Dass von 252 neuen Tumor-abgeleiteten humanen Zelllinien hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), fast 18% wurden Intraspezies sein oder Interspezies Kreuz -Verunreinigungen 12,13. Um diese Probleme zu vermeiden und die Nutzung der oben genannten Vorteile zu machen, haben wir beschlossen, low-Passage Melanom-Zelllinien aus frisch herausgeschnitten Metastasen zu etablieren. Robust Zelle Trennung und Analyse Technologien erfordern Single-Cell-Präparate erzeugt gleichzeitig begrenzen Zelltod und die Zerstörung der charakteristischen Oberflächenproteine ​​werden. Ein Tischgerät für die automatisierte Dissoziation von Gewebe in den Single-Zellsuspensionen ist die gentleMACS Dissoziator von Miltenyi hergestellt. Wenn in Kombination mit gentleMACS C Rohre und optimierte Dissoziation Lösungen, eine effektive und schonende Spaltung von Tumorgewebe in einem geschlossenen System verwendet wird erzielt unter Beibehaltung Antigenepitope und Reduzieren Zellverlust. Das Gerät bietet optimiert voreingestellten Programmen für eine Vielzahl spezifischer Anwendungen und garantiert standardisierte Herstellung von Einzelzell-Suspensionen, die aus Melanom Gewebe 14. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Jüngste Berichte ergab, dass die Mehrzahl der Tumoren eine kleine Subpopulation von sogenannten Krebsstammzellen (CSCs), die ausschließlich weisen Tumor-Initiierung und sich selbst erneuernde Fähigkeit beherbergen. Die Identifizierung von Melanozyten-produzierenden Stammzellen in der Dermis der Haut führte zu der Hypothese, dass diese Zellen könnte die Entstehung von Krebs-Stammzellen (CSCs) in Melanomen, da UVA-Bestrahlung können diese Zellen für maligne Transformation 15 grundieren. Das Ergebnis eines solchen genetischen Läsion würden Zellen, die eine Kombination von Tumor und Stammzelleigenschaften beherbergen sein. Einer der wichtigsten Marker vorgeschlagen, die Subpopulation von CSCs in Melanomen darstellen, ist CD133 16-20. CD133 (auch als Prominin 1 bekannt), ein Mitglied der pentaspan transmembranen Glykoproteinen, wird in hämatopoetischen Stammzellen, Endothelprogenitorzellen, neuronale und gliale Stammzellen 21-23 exprimiert. Expression von CD133 mit korreliertenasymmetrischen Zellteilung 24 und das glykosylierte Epitop von CD133 konnte gezeigt werden herunterreguliert auf Zelldifferenzierung 25. Kürzlich wurden CD133 + Melanomzellen gezeigt, Selbsterneuerung und Tumor-Initiation Kapazität 19,20 zu haben. Um die Funktion von CD133 + putative Melanom CSCs zu studieren, haben wir modifiziert und optimiert die Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS)-System von Miltenyi Biotech, hoch angereichert und lebensfähige Populationen von CD133 + und CD133 zu erhalten - Zellen. Magnetkügelchen-basierten Zellabtrennung erlaubt entweder negative Selektion von Matheu et al. 26 oder positiver Selektion, wie wir hier zeigen. Während positiver Selektion die bestimmte Zielzelle Typ, zB CD133-exprimierenden Zellen, wird magnetisch mit MicroBeads, 50-nm-Partikel, superparamagnetische konjugiert hochspezifische Antikörper gegen ein markiert sindInsbesondere Zelloberflächenantigen. Während der Trennung werden die magnetisch markierten Zellen in der Säule in das Magnetfeld des Separators zurückgehalten, während unmarkierte Zellen durchfließen. Nach Waschschritten wird die Säule aus dem Magnetfeld des Separators entfernt wird, und die Zielzellen von der Säule eluiert. Die LS oder MS Spalten während positive Selektion Ergebnis in Bruchteilen von markierten und nicht markierten Zellen mit hoher Reinheit verwendet. Auf der anderen Seite, LD Spalten zur negativen Selektion verwendet wird, führen zu einer etwas geringeren Reinheit des markierten Fraktion. Aufgrund der dichteren Packung ihre Matrix die Strömungsgeschwindigkeit in diesen Spalten niedriger ist, was zu einem höheren Risiko von unmarkierten Zellen in der Säule eingefangen werden. LD Spalten sollten daher nur für strenge Depletion von einer unerwünschten Zell-Subpopulation verwendet werden. Positive Selektion kann durch direkte (Antikörper gekoppelt MicroBeads) oder indirekten magnetischen Kennzeichnung (Inkubation mit MicroBeads werden nach dem incubatio durchgeführtn mit den primären Antikörper). Spezifisch MACS MicroBeads sind für die positive Selektion von zahlreichen Zelltypen von primären Tumorzellen wie Prostata oder Melanom 27 verfügbar.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> PAA Laboratories GmbH </td><td> L11-007 </td><td></td></tr><tr><td> Amphotericin B-Lösung 250 ug / ml in entionisiertem Wasser </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> A2942-50ml </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Fibroblasten Mikroperlen </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-050-601 </td><td></td></tr><tr><td> CD133 / 1 (W6B3C1) </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-092-395 </td><td></td></tr><tr><td> Kollagenase IV </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> C5138 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Applichem GmbH </td><td> A3778.0050 </td><td></td></tr><tr><td> D-PBS ohne Ca, Mg </td><td> PAA Laboratories GmbH </td><td> H15-002 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalz Dihydrat (EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> E-7889 </td><td></td></tr><tr><td> FBS Superior- </td><td> Biochrom </td><td> S0615 </td><td></td></tr><tr><td> Indirekte CD133 Micro-Bead Kit menschlichen </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-091-895 </td><td> Inklusive: CD133 / 1 (AC133)-Biotin, anti-Biotin-Mikrokugeln und FcR Blockierungsreagenz </td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin, flüssig (100x) </td><td> Invitrogen GmbH </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Quantum 263 </td><td> PAA Laboratories GmbH </td><td> U15-815 </td><td></td></tr><tr><td> Red Blood Cell Lysis Solution (10x) </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-094-183 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ausrüstung </td></tr><tr> &lt;td&gt; Cell Sieb (70 um) </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> gentleMACS C Tubes </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-093-237 </td><td></td></tr><tr><td> gentleMACS Dissoziator </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-093-235 </td><td></td></tr><tr><td> MACS Separator Multi Stand </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-042-303 </td><td></td></tr><tr><td> MACS Seperation Spalten 25 LS Columns </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> MACSmix Tube Rotator </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-090-753 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumchloride </td><td> Merck KGaA </td><td> 567.440-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Pre-Separation Filter </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-041-407 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> QuadroMACS Separator </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-090-976 </td><td></td></tr><tr><td> Rotilabo-Spritzenfilter (0,22 um, PES) </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co. KG </td><td> P668.1 </td><td></td></tr><tr><td> Steritop-GP Filter Unit 500 ml </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> SCGPS05RE </td><td></td></tr></tbody></table>

patient derived cell culture and isolation of cd133+ putative cancer stem cells from melanoma

Trotz verbesserter Behandlungen Optionen für Melanome heute verfügbar ist, Patienten mit fortgeschrittenen malignen Melanom noch eine schlechte Prognose für das progressionsfreie Überleben und das Gesamtüberleben. Daher muss der translationalen Forschung weiter molekulare Beweise für gezielte Therapien für maligne Melanome zu verbessern. In der Vergangenheit haben onkogenen Mechanismen im Zusammenhang mit Melanom wurden ausgiebig in etablierten Zelllinien untersucht. Auf dem Weg zur personalisierten Behandlungsschemata auf individuelle genetische Profile basieren, schlagen wir vor, Patienten-Zelllinien anstelle von generischen Zelllinien zu verwenden. Zusammen mit hochwertigen klinischen Daten, vor allem auf Patienten-Follow-up, werden diese Zellen maßgeblich zu einem besseren Verständnis der molekularen Mechanismen, die hinter Melanom Progression. Hier berichten wir über die Einrichtung von primären Melanomen Kulturen aus seziert frischem Tumorgewebe. Dieses Verfahren beinhaltet Zerkleinerns und Dissoziation des Gewebes in einzelne Zellen, refernung von Verunreinigungen mit Erythrozyten und Fibroblasten sowie primäre Kultur und zuverlässige Überprüfung der Zellen Melanom Herkunft. Jüngste Berichte zeigten, dass Melanome, wie die Mehrzahl der Tumoren, Hafen eine kleine Subpopulation von Krebsstammzellen (CSCs), die ausschließlich Kraftstoff Tumorinitiation und Progression in Richtung der metastatischen Stadium sein. Einer der wichtigsten Marker für CSC Identifizierung und Isolierung in Melanom ist CD133. Um CD133 + CSCs aus primären Melanom Kulturen zu isolieren, haben wir modifiziert und optimiert die Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) Verfahren von Miltenyi was zu hohen Sortenreinheit und Lebensfähigkeit der CD133 + CSCs und CD133 - bulk, die angebaut werden können und funktionell analysiert danach.

Herstellung von ein-Zellen aus Tumorgewebe Abbildung 2 zeigt beispielhaft ein resezierten Lymphknotenmetastasen von einem späten Stadium Melanom Patienten vor (A) und nach (B) mechanische Dissoziation in 2-4 mm große Stücke. Nach enzymatischer Spaltung des Gewebes und Filtration durch ein 70 um Nylonnetz wurden die Zellen pelletiert und der Überstand verworfen. Bei diesem Schritt beobachteten wir eine hohe Kontamination mit Erythrozyten als durch die rötliche Farbe des Zel...

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Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Dieser Artikel beschreibt die Herstellung von frisch gewonnenen Melanomgewebe in primären Zellkulturen und wie Kontaminationen von Erythrozyten und Fibroblasten von den Tumorzellen zu entfernen. Schließlich beschreiben wir, wie CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putativen Melanom Stammzellen werden aus der CD133 sortiert<sup&gt; -</sup&gt; Bulk mit Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Patienten abgeleitet Zellkultur und Isolierung von CD133<sup&gt; +</sup&gt; Mutmaßliche Cancer Stem Cells von Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

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Research

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Medicine

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

21.1K Aufrufe.  Charité - Universitätsmedizin Berlin. Dieser Artikel beschreibt die Herstellung von frisch gewonnenen Melanomgewebe in primären Zellkulturen und wie Kontaminationen von Erythrozyten und Fibroblasten von den Tumorzellen zu entfernen. Schließlich beschreiben wir, wie CD133 + Putativen Melanom Stammzellen werden aus der CD133 sortiert - Bulk mit Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Serie: Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events in cardiac myocytes such as proliferation and apoptosis require an accurate identification of cardiac myocyte nuclei to analyze cellular renewal in homeostasis and in pathological conditions2. Here, we provide a method to isolate cardiomyocyte nuclei from post mortem tissue by density sedimentation and immunolabeling with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) and subsequent flow cytometry sorting. This strategy allows a high throughput analysis and isolation with the advantage of working equally well on fresh tissue and frozen archival material. This makes it possible to study material already collected in biobanks. This technique is applicable and tested in a wide range of species and suitable for multiple downstream applications such as carbon-14 dating3, cell-cycle analysis4, visualization of thymidine analogues (e.g. BrdU and IdU)4, transcriptome and epigenetic analysis.

Cardiac nuclei are isolated via density sedimentation and immunolabeled with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) to identify and sort cardiomyocyte nuclei by flow cytometry.

Isolierung von Kardiomyozyten Kerne von Post-mortem Gewebe

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Forschung

Medizin

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Isolation, Charakterisierung und vergleichende Differenzierung humaner Dental Pulp Stammzellen aus bleibenden Zähne mit zwei verschiedenen Methoden abgeleitet

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Zeitraffer-Imaging of Primary Präkanzeröse Brustepithelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen der Breast Cancer Abgeleitet

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

Isolierung von Krebs Stammzellen aus menschlichen Prostatakrebs-Proben

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

Bereicherung für chemoresistenten Eierstockkrebs Stammzellen aus menschlichen Zelllinien

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

Isolierung und Immortalisierung von Patienten stammende Zelllinien von Muskelbiopsie for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Studieren Bauchspeicheldrüsenkrebs Stammzelleigenschaften für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

Isolierung und Kultur Expansion von tumorspezifischen Endothelzellen

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

Generation von Prostatakrebs-Patienten gewonnen Xenograft-Modelle von zirkulierenden Tumorzellen

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, synovial-fluid-derived MSCs were reported to have multi-lineage differentiation potential and immunomodulatory features, which indicates that these cells can be used for tissue engineering and systemic treatments. This study presents a protocol for simple and non-invasive isolation of MSCs derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs to analyze cell surface markers for cell phenotyping and in vitro culturing. Using sexually mature six-month-old minipigs, bone marrow was extracted from the iliac crest bone using a bone marrow extractor, and the synovial fluid was aspirated from the femorotibial joint. Procedures for the collection of samples from both sources were non-invasive. The protocols for effective isolation of MSCs from harvested cell sources and for creating in vitro culture conditions to expand stable MSCs from minipigs and the application of systemic autologous treatments are provided. For cell phenotyping, the cell surface markers of both cells were analyzed using flow cytometry. In the results, the MSCs were isolated from the synovial fluid of the minipigs and showed that synovial-fluid-derived MSCs have a similar morphology and cell phenotype to bone-marrow-derived MSCs. Therefore, non-invasively obtained synovial fluid is a valuable source of MSCs.

A protocol establishing mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from the synovial fluid and bone marrow of minipigs and non-invasively collected using syringe aspiration is presented. Cellular phenotyping was performed using flow cytometry after cell isolation and in vitro cultivation of bone marrow and synovial fluids derived from MSCs.

Isolation und zelluläre Phänotypisierung von mesenchymalen Stammzellen abgeleitet von Synovialflüssigkeit und Knochenmark von Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...