Wir danken für die Bereitstellung von CDDO DFPA Reata Pharma. Wir anerkennen auch die Unterstützung von Jane und Lee Seidman Lehrstuhl für Pädiatrie Krebs Innovation (John Letterio). Diese Arbeit wurde unterstützt vom Verteidigungsministerium [W81XWH-12-1-0452]; die Angie Fowler Jugendlichen und jungen Erwachsenen Krebs Forschungsinitiative an dem Fall Comprehensive Cancer Center; und dem Callahan Absolvent Scholar Award for Hsi-Ju Wei von f.j. Callahan-Stiftung.

Alle Studien wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit den Verfahren, die von der Case Western Reserve University School of Medicine der institutionellen Animal Care und Use Committee genehmigt.
1. Vorbereiten des Knochenmarks-abgeleitete dendritischer Zellen (BMDCs)
<ol><li>Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente durch Autoklavieren zu und führen Sie das Experiment in Klasse II biologischen Sicherheitsschrank mit entsprechenden Sicherheitsvorkehrungen.</li>
	<li>Einschläfern Sie C57BL/6 Mäusen 8-10 Wochen alt mit CO2 -Kammer. Platzieren Sie den Mauszeiger auf einen sezierenden Brett und spülen Sie mit 70 % Ethanol. Verbrauchsteuern Sie Tibia-Fibula und Femur-Knochen mit einer chirurgischen Schere und legen Sie sie mit 70 % Ethanol in der Kulturschale 10 cm.</li>
	<li>Chirurgische Messer und Zange verwenden, um Gewebe entfernt sezieren so weit wie möglich auf dem Deckel des 10 cm Kultur Gericht und Isolierung von Gebeinen und Oberschenkelknochen zu platzieren mit 70 % Ethanol in der Kulturschale 6 cm.</li>
	<li>Verwenden Sie chirurgische Sägeblätter, um beide Enden der Schienbeine und Oberschenkelknochen zu trimmen. Verwenden Sie 3 mL PBS in 3 ml Spritze mit einer Nadel 23G, um den Inhalt von Knochenmark von einem Ende der Knochen auf eine konische Rohr mit 12 ml PBS zu leeren. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 X für die beiden Enden der Knochen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 X g für 5 min.</li>
	<li>Entfernen Sie den überstand und Aufschwemmen der Zelle Pellet mit 1 ml ACK lysiereinrichtung Puffer für 5 Minuten, um rote Blutkörperchen zu entfernen.</li>
	<li>Fügen Sie 9 ml PBS verdünnen ACK lysiereinrichtung Puffer und Zentrifuge bei 300 X g für 5 Minuten.</li>
	<li>Den überstand zu entfernen und erneut mit 10 ml Kulturmedium (RPMI-1640 plus L-Glutamin, 10 % FBS, 1 % nicht-essentielle Aminosäure (100 X), 10 mM HEPES, 50 nM β-Mercaptoethanol und 5 % Penicillin/Streptomycin). Hinweis: Endotoxin-Ebene muss weniger als 0,1 EU/ml in FBS.</li>
	<li>Die Zellsuspension durch ein 40 μm Zelle Sieb passieren und nehmen 20 µl Zellsuspension und mischen mit 80 µl Trypan blau, um die Anzahl der lebenden Zellen mithilfe Cytometer.</li>
	<li>Passen Sie die Anzahl von Zellen, 1 x 106 Zellen/ml mit 15 ng/ml GM-CSF und 10 ng/ml IL-4.</li>
	<li>3 ml 1 x 106 Zellen/ml in jede Vertiefung des 6-Well-Platte-Platte und die Zellen bei 37 ° C, 5 % CO2und 95 % Luftfeuchtigkeit in den CO2 Inkubator inkubieren. Hinweis: Die Knochenmarkzellen von einer Maus ist um 3-5 x 107 Zellen, die darauf hinweist, dass es von 2 bis 3 6-Well-Platten platziert werden kann.</li>
	<li>Am 3. Tag fügen Sie alle 3 ml Kulturmedium aus jedem Bohrloch entfernen 2 ml frische PBS in jede Vertiefung hinzu und dann schwenken Sie sanft die Platte, um sicherzustellen, entfernen alle nicht-anhaftende Zellen.</li>
	<li>3 ml frisches Kulturmedium mit 15 ng/ml GM-CSF und 10 ng/ml IL-4 in jede Vertiefung zu ersetzen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C, 5 % CO2und 95 % Luftfeuchtigkeit in den CO2 Inkubator.</li>
	<li>Am 5. Tag direkt hinzufügen einer anderen 3 ml frisches Kulturmedium mit 15 ng/ml GM-CSF und 10 ng/ml IL-4 in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Zellen bei 37° C, 5 % CO2, und 95 % Luftfeuchtigkeit im CO2 Inkubator. Hinweis: Das Gesamtvolumen in jede Vertiefung ist jetzt 6 ml.</li>
	<li>Am 7. Tag legte die gesamte Platte für 10 min auf Eis. Pipette vorsichtig das Kulturmedium in jede Vertiefung, die lose anhaftende BMDCs als iDCs in Suspension zu verdrängen. Hinweis: Die anhaftenden Makrophagen sind noch an der Platte befestigt. Niedrige Temperatur und sanft Verfahren sind der Schlüssel zur Vermeidung von DC-Aktivierung um weitere Experimente zu beeinflussen.</li>
	<li>Die Zellsuspension bei 300 X g für 5 Minuten zentrifugieren und Aufschwemmen mit frischem Nährmedium für weitere Experimente. Hinweis: BMDCs durch Durchflusszytometrie mit Fluoreszenz-markierten CD11c Antikörper identifiziert werden können und wir haben unsere gating Strategie des BMDCs für weitere Experimente in Abbildung 1gezeigt.</li>
</ol>(2) charakterisieren Sie TolDC gen und Protein-Profil
<ol><li>Platte 2 ml 1 x 106 BMDCs/ml pro Bohrloch in 6 Well-Platte mit Kulturmedium in Anwesenheit oder Abwesenheit von 100-400 nM CDDO DFPA für die Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit im Inkubator CO2 1 h. Hinweis: CDDO-DFPA, eine synthetische Triterpenoid ist ein nuklearer Faktor (2 erythroiden abgeleitet) - wie - 2 Faktor (Nrf2) Induktor und nuklearer Faktor κB (NF-κB)-Inhibitor. Gelten Sie andere Agenten für die Induktion von TolDCs von iDCs, wie IL-10, Vitamin D3, Dexamethason oder Bucht 11-7085, und ändern Sie diesen Schritt, um eine optimale Voraussetzung für jeden Agenten.</li>
	<li>Fügen Sie 10 oder 100 ng/ml von LPS für die Inkubation 4-24 Std., induzieren mDCs (Inkubationszeit unterscheidet sich durch Messung von mRNA oder Protein).</li>
	<li>Sanft pipette das Kulturmedium in jede Vertiefung und ernten die Zellsuspension mit 1 ml-Pipette. Zentrifugieren Sie bei 300 X g für 5 Minuten, die Zellen und überstand, bzw. zu sammeln.</li>
	<li>Analysieren der Oberfläche Liganden aus der Zelle Pellets durch Durchflusszytometrie, wie stimulierende Liganden: CD40, CD80 und CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL oder hemmenden Liganden: PD-L1, PD-L2, ILT3, ILT4.</li>
	<li>Isolierung der RNS aus der Zelle Pellets und analysieren die RNA und überstand Proben für die Cytokine Profil und gen und Protein Ebenen durch quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR) und ELISA, beziehungsweise. Hinweis: zum Beispiel, inflammatorische Zytokine: TNF-α, IFNγ, EDN-1, IL-6, IL-12 und IL-23 oder Anti-inflammatorische Zytokine: IL-4, IL-10, IL-15, TGF-β1 und HO-1.</li>
</ol>3. Beurteilung die Funktion des TolDCs In Vitro und In Vivo
<ol><li>
T-Zell-Phänomen Proliferation-Assay
	<ol>
<li>Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente durch Autoklavieren zu und führen Sie das Experiment in Klasse II biologischen Sicherheitsschrank mit entsprechenden Sicherheitsvorkehrungen.</li>
		<li>Bereiten Sie MACS-Puffer mit 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM EDTA in 500 ml PBS vor. Sterilisieren Sie den Puffer durch durch einen 0,2 µm-Filter filtern. Hinweis: Halten Sie den Puffer auf dem Eis während das folgende Experiment.</li>
		<li>CD4 zu+ T Zellen, einschläfern OT-II T-Zell-Rezeptor (TCR) Transgene Mäuse 8-10 Wochen alt mit CO2 -Kammer. Platzieren Sie den Mauszeiger auf einen sezierenden Brett und spülen Sie mit 70 % Ethanol. Isolieren der Milz von der linken Seite des Bauches mit chirurgische Scheren und Pinzetten.</li>
		<li>Legen Sie die Milz mit 2 ml PBS in einer Kulturschale 6 cm und mit der Rückseite der schiebestock 3 ml Spritze die Milz Zerkleinern, indem man ein Sieb 40 μm Zelle.</li>
		<li>Sammeln Sie die Zellsuspension und Zentrifuge bei 300 X g für 5 Minuten.</li>
		<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet in 400 µl des MACS-Puffer.</li>
		<li>Fügen Sie 100 μl der CD4+ T-Zell-Biotin-Antikörper-Cocktail bei 4° C für 5 Minuten. Hinweis: Der cocktail Antikörper bindet auf andere Zelltypen außer CD4+ T-Zellen, wie z. B. CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC-Klasse II, Ter-119 und TCRγ/δ.</li>
		<li>Fügen Sie 300 μl des MACS-Puffer und 200 μl des Anti-Biotin Perlen (Table of Materials) bei 4° C für 10 Minuten.</li>
		<li>Ort die Spalte aus der ferromagnetischen Sphären (Table of Materials) und Vorabscheidung Filter zusammen in dem magnetischen Feld und spülen Sie ihn mit 3 ml MACS-Puffer.</li>
		<li>Fügen Sie 9 ml MACS-Puffer in die Zellen und die Zentrifuge bei 300 X g für 5 Minuten.</li>
		<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet in 3 ml MACS-Puffer und wenden Sie auf die Spalte. Sammeln Durchflussverfahren mit CD4+ T Zellen.</li>
		<li>Spalte mit einer anderen 3 ml MACS-Puffer waschen und auch die Durchströmung zu sammeln.</li>
		<li>Um Milz Pfanne DCs zu erhalten, einschläfern Sie C57BL/6 Mäusen mit CO2 Kammer ca. 8-10 Wochen alt. Platzieren Sie den Mauszeiger auf einen sezierenden Brett und spülen Sie mit 70 % Ethanol. Isolieren der Milz von der linken Seite des Bauches mit chirurgische Scheren und Pinzetten. Setzen die Milz in der 6cm Kulturschale mit 2 ml Kollagenase D-Lösung (2 mg/ml Kollagenase D aufgelöst in HBSS, enthält Kalzium, Magnesium).</li>
		<li>Spritzen Sie 1 ml der Kollagenase D Lösung zur Milz zwei Mal eine 1 ml Spritze mit einer Nadel 25G. Schneiden Sie die Milz mit einer kleinen Schere in kleine Stücke.</li>
		<li>Schütteln und Inkubation bei Raumtemperatur für 25 Minuten.</li>
		<li>Fügen Sie 500 µl 0,5 M EDTA bei Raumtemperatur für 5 Minuten. Hinweis: Die Schritte von 3.1.13-3.1.14 sind entscheidend für die Erhöhung der Ausbeute von DCs.</li>
		<li>Jetzt mithilfe der Rückseite der schiebestock 3 ml Spritze mince der Milz Brei durch ein Sieb 40 μm Zelle vorbei und sammeln die Zellsuspension durch Zentrifugieren bei 300 X g für 5 Minuten.</li>
		<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet in 350 μl des MACS-Puffer, 50 μl der FcR Blocking Reagenz und 100 μl des Pan Dendritische Zelle Biotin-Antikörper Cocktail bei 4° C für 10 Minuten. Hinweis: Der Antikörper gegen Antigene, die nicht von DCs ausgedrückt sind cocktail.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen, indem 9 ml MACS-Puffer und Zentrifuge auf 300 X g für 5 Minuten.</li>
		<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet in 800 µl des MACS-Puffer und fügen Sie 200 μl des Anti-Biotin Perlen bei 4 ° C für 10 Minuten.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte aus 3.1.9-3.1.11 DCs zu sammeln.</li>
		<li>Spalte mit einer anderen 3 ml MACS-Puffer zwei Mal waschen und auch die Durchströmung sammeln.</li>
		<li>2 x 105 DCs/ml mit 1 μM CFSE bei 37 ° C für 15 Minuten in das Vorhandensein oder Fehlen von 100-400 nM CDDO DFPA bei 37 ° C für 1 Stunde separat, Beschriftung der CD4+ -T-Zellen (1 x 107/ml) zu behandeln, Waschen mit PBS , und passen Sie die Lautstärke um Endkonzentration bei 2 x 106 T Zellen/ml zu erhalten.</li>
		<li>Als nächstes in eine 96-Well-Platte Co Kultur 100 μl der behandelten dendritischen Zellen mit dem gleichen Volumen des CFSE--mit der Bezeichnung CD4+ T-Zellen, beide gesammelt aus den oben genannten Schritte, um 01:10 Verhältnis. Fügen Sie jetzt 100 ng/mL Ovalbumin (OVA) Peptid 323-329 pro Brunnen und messen die Intensität der CFSE-der T-Zellen durch Durchflusszytometrie nach 2-3 Tagen Inkubationszeit. Hinweis: Die Zellzahlen und das Verhältnis von DCs und T Zellen aus unserer bisherigen Arbeit37optimiert worden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Induzieren passiv EAE durch die Injektion von BMDCs gepulst mit Myelin Oligodendrozyt Glykoprotein (MOG) (35-55)
	<ol>
<li>Platte 2 ml 1 x 106 BMDCs/ml pro Bohrloch in 6 Well-Platte mit Kulturmedium in das Vorhandensein oder Fehlen von 100-400 nM CDDO DFPA für die Inkubation von 1 Stunde.</li>
		<li>Fügen Sie 10 ng/ml von LPS für Inkubation 24 hrs.</li>
		<li>Hinzufügen von 100 μg/ml MOG (35-55) für die Inkubation 4 Stunden.</li>
		<li>Ernte der Zellsuspension und Zentrifuge bei 300 X g für 5 Minuten.</li>
		<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet mit PBS und die Zellen zu zählen.</li>
		<li>Subkutan Spritzen Sie 200 μl der 2 x 106 Zellen auf ca. 8-10 Wochen alten weiblichen C57BL/6 Mäusen (100 μl in jedem Hinterbein).</li>
		<li>Am Tag der Injektion BMDC und 48 Stunden. später, injizieren 200 ng Pertussis-Toxin (PTX) in jeder Maus.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritte 3.2.6-3.2.7 einmal pro Woche für 4 Wochen.</li>
		<li>Die klinischen Symptome der EAE täglich mithilfe von Standardkriterien37 (0,5-hinken Endstück, 1-hinken Rute, 2-mäßig Hind Gliedmaßen Schwäche, 3 schwere Hind Gliedmaßen Schwäche, 4 komplette Hind Extremität Lähmung, 5-Tetraplegie oder sterbenden Zustand, 6-Tod) zu bewerten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Dieses Paper beschreibt ein effizientes Protokoll, das die reproduzierbar iDCs generieren und anschließend Unterscheidung in TolDCs verwendet werden kann, und wir schlagen vor, dies angewendet werden, kann um die Kapazität der neuen molekularen Ziel Agenten induzieren die TolDC bewerten Phänotyp. Wie in diesem Bericht beschrieben, folgten wir eine Sequenz, in der ersten TolDC Ausdruck der Oberfläche Liganden durch Durchflusszytometrie, gefolgt von einer Bewertung der DC Cytokine Profil qRT-PCR und ELISA gemessen anal...

Dendritische Zellen (DCs) waren sind fester Bestandteil des angeborenen Immunsystems zuerst entdeckt und gekennzeichnet durch Ralph Steinman und Zanvil Cohn 1973 als primäre professionelle Antigen präsentierenden1 Zellen. DCs haben gezeigt, dass eine wichtige Rolle in Immunaktivierung spielen, verarbeitete Antigene an T-Zellen und B-Zellen über große Histocompatibility komplexe (MHC) in sekundären lymphatischen Organe verbinden die angeborenen und der adaptiven Immunsystem2präsentiert. In den Säugetieren Immunsystem gibt es mindestens zwei Kategorien von DCs die myeloische DCs und DCs (pDCs)3plasmazytoide beschrieben sind. Myeloische DCs, auch bekannt als konventionelle DCs (cDCs), zeichnen sich durch die Expression von CD11c und kann als unreif DCs (iDCs) in Vitro aus Vorläuferzellen des Knochenmarks oder peripherem Blut Monozyten mit unterschieden werden Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF) und IL-4 in murinen oder menschlichen Arten, bzw.4.
Aktivierung von "Gefahr" signalisiert, wie Pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMP) oder Schaden-assoziierte molekulare Muster (feucht), fahren iDCs Reifung in Richtung immunogen DCs als Reife DCs (mDCs) über verschiedene Muster Anerkennung Rezeptoren für verbindlich die DC Oberfläche5. Immunogen DCs weitere erstklassige naive T-Zell-Proliferation und Differenzierung durch Hochregulation der ARBEITSPLATZAUSSTATTUNG2, costimulatory Liganden (CD40, CD80 und CD86)6, Zytokine und andere lösliche Mittler-7. Eine Kaskade von Pro-inflammatorischen Mediator Produktion von immunogen DCs ist essentiell für Zytokin-vermittelte T-Zell-Differenzierung. IFN-γ und IL-12 sind notwendig für Th1 Differenzierung8 und IL-1, sind beispielsweise IL-6 und IL-23 für naive T-Zelle Polarisation Richtung Th17 Zellen9von entscheidender Bedeutung. Obwohl Reife DCs auf fremde Antigene reagieren, unkontrollierte DC-Aktivierung von selbstantigenen Toleranz Ablation verursachen und fördern die Entwicklung von Autoimmunerkrankungen durch die Generierung von autoreaktiven T-Zellen, deren Aktivierung zur Zerstörung des Gewebes10 führt .
Die jüngsten Berichte lieferten eindeutige Beweise für DC Plastizität, veranschaulicht durch ihre Fähigkeit zur Interaktion mit verschiedenen Queues innerhalb ihrer Mikroumgebung Gewebe und in verschiedenen Effektor/Suppressor DC Teilmengen zu unterscheiden. Die Anti-inflammatorische Mediatoren wie IL-10-11, TGF-β12und HO-113 haben gezeigt, eine wichtige Rolle bei Immunsuppression durch Induktion tolerogene DCs (TolDCs) zu spielen. Diese TolDCs regulatorische Funktionen erwerben und T-Zell-Proliferation-14zu unterdrücken. Darüber hinaus das Fehlen der Ko-Stimulation von DCs und die Produktion von Anti-inflammatorische Mediatoren aus TolDCs sowohl zur Induktion von regulatorischen T-Zellen (Tregs) beitragen und auch effektiv hemmen Th1 und Th17 Differenzierung und Erweiterung15. In vergangenen zwei Jahrzehnten wurde durch mehrere Untersucher das therapeutische Potenzial von TolDCs berichtet. In diesen Studien die Verwaltung der Ex-Vivo erzeugt nicht nur gelindert TolDCs pathologische Symptome in präklinischen Modellen von Autoimmunerkrankungen16 aber führte auch zur Entwicklung der Immuntoleranz bei Patienten17 ,18. Interessant ist, heute die TolDCs Therapie galt als alternative oder Zusatztherapie Ansatz für Autoimmunerkrankungen in mehreren klinischen Studien, einschließlich 1 Diabetes Mellitus19, rheumatoider Arthritis20, Typ 21, Multiple Sklerose (MS)22,23,24und Crohns Krankheit25.
Es gibt eine Vielzahl von Protokollen, die beschäftigt sind, TolDCs zu entwickeln und mehrere Labore haben Methoden zur Generierung und phänotypischen Charakterisierung des TolDCs berichtet. Diese Methoden können reproduzierbar TolDCs in Vitro aus hämatopoetischen Vorläuferzellen zu generieren und, sie in einem tolerogene Zustand in Vivo26,27,28,29stabil zu halten. Die iDCs kann durch die Einwirkung von verschiedenen immunmodulatorischen pharmakologische Wirkstoffe oder Anti-inflammatorische Zytokine TolDCs umgewandelt. Vitamin D3 ist beispielsweise eine bekannte pharmakologische Agenten bekannt erweitern Produktion von IL-10 und IL-12 Sekretion von DCs zu unterdrücken und damit ihre immunsuppressive Funktion30steigern. Darüber hinaus Wenn DCs starke entzündliche Reize wie Lipopolysacchariden (LPS), ausgesetzt sind mehrere pharmakologische Wirkstoffe wie Dexamethason31, Rapamycin32und Kortikosteroide33 haben gezeigt, dass induzieren die TolDC Phänotyp durch Verringerung der DC oberflächenexpression von CD40, CD80 und CD86 ARBEITSPLATZAUSSTATTUNG34. IL-10 und TGF-β sind die meisten studiert Anti-inflammatorische Zytokine, DC Toleranz35 und die gleichzeitige Exposition gegenüber beide dieser Zytokine induzieren nachweislich zu tolerogene Phänotyp in DCs36zu induzieren.
Seit der tolerogene DC von funktionellen Eigenschaften definiert ist, anstatt durch phenotypische Marker gibt es muss eine große eine einheitliche Methode zur zellulären und funktionelle Charakterisierung des TolDCs zu entwickeln. Darüber hinaus eine strenge und konsequente Protokoll muss für die einheitliche Bewertung und Charakterisierung von tolerogene DC-Phänotyp festgestellt werden, wenn wir effektiv und reproduzierbar die Möglichkeit neuer Wirkstoffe induzieren TolDC Phänotyp in vergleichen sollen die Labor. Hier bieten wir Ihnen ein detailliertes Protokoll mit schrittweisen Methoden iDCs von hämatopoetischen Vorläuferzellen von Mäusen isolieren und anschließend die Wirksamkeit neuer Wirkstoffe in der Bewertungsphase für ihre Fähigkeit zur TolDCs, iDCs umzuwandeln analysieren bietet eine robuste phänotypische und funktionelle Charakterisierung des TolDCs in Vitro und in Vivo. Diese Beschreibung umfasst eine aufwändige Methode zur Charakterisierung des TolDCs durch ihre Oberfläche Liganden, Cytokine Profil und immunsuppressive Funktionen in Vitro. Wir bieten auch ein Beispiel für eine Methode, um die mögliche therapeutische Anwendung dieser TolDCs in einem präklinischen Modell der MS, Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) zu erkunden. Dieses etablierte Protokoll hilft Ermittlern auszuwertende die Kapazität der neuen Agenten, die Induktion von TolDCs zu fördern und die Bemühungen um die Ausweitung der therapeutischen Entwicklung TolDC erleichtern.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CDDO-DFPA (RTA-408)</td>
			<td>Reata Pharmaceuticals</td>
			<td>in house synthesis</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse GM-CSF</td>
			<td>Peprotech Inc.</td>
			<td>315-03</td>
			<td>BMDC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-4</td>
			<td>Peprotech Inc.</td>
			<td>214-14</td>
			<td>BMDC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides (LPS)</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc.</td>
			<td>L2880</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc.</td>
			<td>516732</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertussis toxin (PTX)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3097</td>
			<td>EAE induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOG (35&#8211;55) peptide</td>
			<td>21stCentury Biochemicals</td>
			<td>in house synthesis</td>
			<td>EAE induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 plus L-glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acid (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>Cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated CD80</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557227</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated CD86</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555665</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated PD-L1</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>124307</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated MHCII</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-112-388</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated CD11c</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340544</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype matched PE</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-091-835</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype matched APC</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-091-836</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423801</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan dendritic cell isolation kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-100-875</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR Blocking Reagent</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-100-875</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-100-875</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-100-875</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4+ T cell isolation kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-104-454</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4+ T cell Biotin-Antibody Cocktail</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-104-454</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-104-454</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1049201</td>
			<td>BMDC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309626</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309588</td>
			<td>BMDC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309626</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309588</td>
			<td>BMDC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc.</td>
			<td>A2058</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Column</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation Filter</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase D</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc.</td>
			<td>11088858001</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025076</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ovalbumin (OVA) peptide 323&#8211;329</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc.</td>
			<td>O1641</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IFN-&#947; TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm01168134_m1</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-12a TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm00434165</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>DY419-05</td>
			<td>ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse EDN-1 ELISA</td>
			<td>RayBiotech</td>
			<td>ELM-EDN1-1</td>
			<td>ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945; TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm00443258</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse TNF-&#945; Quantikine ELISA Kit</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>MTA00B</td>
			<td>ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6 TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm00446190</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>M6000B</td>
			<td>ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-23a TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm01160011</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-23 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>DY1887-05</td>
			<td>ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4 TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm99999154_m1</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-10 TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm01288386_m1</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946; TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm01178820_m1</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Heme Oxygenase 1 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13248</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8226</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad Inc.</td>
			<td></td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCalibur Cell Analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development and functional characterization of murine tolerogenic dendritic cells

Das Immunsystem arbeitet durch ein enge Verhältnis zwischen koordinierenden Antworten gegen fremde Antigene und Pflege einen nicht interaktiver Status gegen selbstantigenen sowie Antigene von Kommensalen Organismen abgeleitet. Die Störung dieser immun Homöostase kann zu chronischen Entzündungen und zur Entwicklung von Autoimmunität führen. Dendritische Zellen (DCs) sind die professionellen Antigen-präsentierenden Zellen des angeborenen Immunsystems beteiligt bei der Aktivierung von naiven T-Zellen um Immunantworten gegen fremde Antigene zu initiieren. DCs können jedoch auch in TolDCs unterschieden werden, die dienen zur Wahrung und Förderung der T-Zell Toleranz und Effektorzellen zur Entwicklung entweder Autoimmun- oder chronischen Entzündungen Bedingungen zu unterdrücken. Die jüngste Weiterentwicklung in unserem Verständnis des TolDCs legt nahe, dass DC Toleranz durch modulieren ihre Differenzierung Bedingungen erreicht werden kann. Dieses Phänomen führte zu enormen Wachstum in den Entwicklungsländern TolDC Therapien für zahlreiche Erkrankungen des Immunsystems verursacht durch Immuntoleranz zu brechen. Erfolgreiches Studium in präklinischen Autoimmunität murinen Modellen haben weiter die Immuntherapie Nützlichkeit des TolDCs bei der Behandlung von Autoimmun-Erkrankungen bestätigt. Heute haben TolDCs ein viel versprechendes Instrument der Immuntherapie in der Klinik für Wiederherstellung der Immuntoleranz in verschiedenen Erkrankungen des Immunsystems durch gezielte pathogene autoimmune Reaktionen, wobei schützende Immunität intakt bleiben. Obwohl eine Reihe von Strategien von mehreren Labs induzieren TolDCs vorgeschlagen wurde, gibt es keine Einheitlichkeit bei der Charakterisierung des zellulären und funktionale Phänotyps dieser Zellen. Dieses Protokoll enthält eine schrittweise Anleitung für die Entwicklung von Knochenmark stammenden DCs in großer Zahl, eine einzigartige Methode zur Unterscheidung in TolDCs mit einem synthetischen Triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic Säure-Difluoro-Propyl-Amid (CDDO-DFPA), und die Techniken verwendet, um deren Phänotyp, einschließlich Analyse der wesentlichen Molekulare Signaturen des TolDCs bestätigen. Zu guter Letzt zeigen wir eine Methode, um TolDC Funktion zu beurteilen, indem Sie testen ihre immunsuppressive Antwort in Vitro und in Vivo in einem präklinischen Modell der multiplen Sklerose.

Die Differenzierung und die Auswahl von BMDCs:
Vorläuferzellen des Knochenmarks wurden komplette RPMI Medium im Beisein von GM-CSF und IL-4 in iDCs für 7 Tage (Abbildung 1A) differenzieren kultiviert. Am 1. Tag Zellen waren klein und zeigte sphärische Morphologie. Waschen mit PBS, bevor die Ersetzung der frisches Medium am Tag3 Zellen zur Form Cluster beigetragen und auch die Ein...

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Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu entwickeln und tolerogene dendritischen Zellen (TolDCs) zu charakterisieren und deren immuntherapeutischen nutzen zu bewerten.

Entwicklung und Charakterisierung von dendritischen Zellen murinen Tolerogene

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

10.5K Aufrufe.  Case Western Reserve University. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu entwickeln und tolerogene dendritischen Zellen (TolDCs) zu charakterisieren und deren immuntherapeutischen nutzen zu bewerten.

Serie: Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

Segmentation and Measurement of Fat Volumes in Murine Obesity Models Using X-ray Computed Tomography

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are associated with obesity, though the precise underlying mechanisms that contribute to the disease are currently being delineated.2,3 Several small animal models of obesity have been developed and are employed in a variety of studies.4 A critical component to these experiments involves the collection of regional and/or total animal fat content data under varied conditions.
Traditional experimental methods available for measuring fat content in small animal models of obesity include invasive (e.g. ex vivo measurement of fat deposits) and non-invasive (e.g. Dual Energy X-ray Absorptiometry (DEXA), or Magnetic Resonance (MR)) protocols, each of which presents relative trade-offs. Current invasive methods for measuring fat content may provide details for organ and region specific fat distribution, but sacrificing the subjects will preclude longitudinal assessments. Conversely, current non-invasive strategies provide limited details for organ and region specific fat distribution, but enable valuable longitudinal assessment. With the advent of dedicated small animal X-ray computed tomography (CT) systems and customized analytical procedures, both organ and region specific analysis of fat distribution and longitudinal profiling may be possible. Recent reports have validated the use of CT for in vivo longitudinal imaging of adiposity in living mice.5,6 Here we provide a modified method that allows for fat/total volume measurement, analysis and visualization utilizing the Carestream Molecular Imaging Albira CT system in conjunction with PMOD and Volview software packages.

Fat content analysis is routinely conducted in studies utilizing murine obesity models. Emerging methods in small animal CT imaging and analysis are providing for longitudinal detail rich fat content analysis. Here we detail step by step procedures for performing small animal CT imaging, analysis, and visualization.

Segmentierung und Messung von FAT-Volumes in Murine Obesity Modellen mithilfe von Röntgen-Computertomographie

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are ...

Forschung

Medizin

Development of Obliterative Bronchiolitis in a Murine Model of Orthotopic Lung Transplantation

Orthotopic lung transplantation in rats was first reported by Asimacopoulos and colleagues in 1971 1. Currently, this method is well accepted and standardized not only for the study of allo-rejection but also between syngeneic strains for examining mechanisms of ischemia-reperfusion injury after lung transplantation. Although the application of the rat and other large animal model 2 contributed significantly to the elucidation of these studies, the scope of those investigations is limited by the scarcity of knockout and transgenic rats. Due to no effective therapies for obliterative bronchiolitis, the leading cause of death in lung transplant patients, there has been an intensive search for pre-clinical models that replicate obliterative bronchiolitis. The tracheal allograft model is the most widely used and may reproduce some of the histopathologic features of obliterative bronchiolitis 3. However, the lack of an intact vasculature with no connection to the recipient's conducting airways, and incomplete pathologic features of obliterative bronchiolitis limit the utility of this model 4. Unlike transplantation of other solid organs, vascularized mouse lung transplants have only recently been reported by Okazaki and colleagues for the first time in 2007 5. Applying the basic principles of the rat lung transplant, our lab initiated the obliterative bronchiolitis model using minor histoincompatible antigen murine orthotopic single-left lung transplants which allows the further study of obliterative bronchiolitis immunopathogenesis6.

Obliterative bronchiolitis is the key impediment to the long-term survival of lung transplant recipients and the lack of a robust preclinical model precludes examining obliterative bronchiolitis immunopathogenesis. Unlike other solid organ transplants, vascularized mouse lung transplantation has only recently been developed. Here we show our independently developed obliterative bronchiolitis model after murine orthotopic single-lung transplantation.

Entwicklung einer Bronchiolitis obliterans in einem Mausmodell der orthotopen Lungentransplantation

Orthotopic lung transplantation in rats was first reported by Asimacopoulos and colleagues in 1971 1. Currently, this method is well accepted and ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Isolation, Charakterisierung und vergleichende Differenzierung humaner Dental Pulp Stammzellen aus bleibenden Zähne mit zwei verschiedenen Methoden abgeleitet

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Patienten abgeleitet Zellkultur und Isolierung von CD133<sup&gt; +</sup&gt; Mutmaßliche Cancer Stem Cells von Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have been developed to facilitate the study of the molecular and cellular pathophysiology of this disease. In this manuscript we describe specific techniques for the quantification and characterization of atherosclerotic lesions in the murine aortic sinus and ascending aorta. The advantage of this procedure is that it provides an accurate measurement of the cross-sectional area and total volume of the lesion, which can be used to compare atherosclerotic progression across different treatment groups. This is possible through the use of the valve leaflets as an anatomical landmark, together with careful adjustment of the sectioning angle. We also describe basic staining methods that can be used to begin to characterize atherosclerotic progression. These can be further modified to investigate antigens of specific interest to the researcher. The described techniques are generally applicable to a wide variety of existing and newly created dietary and genetically-induced models of atherogenesis.

We describe procedures to quantify and characterize atherosclerotic lesions in mouse models using precision sectioning of the aortic sinus and ascending aorta combined with histochemical and immunohistochemical analysis.

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

Isolierung und funktionelle Charakterisierung der Menschen ventrikuläre Kardiomyozyten von Fresh Chirurgische Proben

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

Beurteilung von Eierstockkrebs Sphäroid Bindung und Invasion von Mesothelzellen in Echtzeit

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

Hochdurchsatz-Charakterisierung von adulten Stammzellen für die Zuführung von therapeutischen Faktoren für neuroprotektive Strategien Engineered

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The approach allows unbiased identification and functional characterization of individual colorectal afferents. Extracellular recordings of propagated action potentials (APs) that originate from one or a few afferent (i.e., single-fiber) receptive fields (RFs) in the colorectum are made from teased nerve fiber fascicles. The colorectum is removed with either the pelvic (PN) or lumbar splanchnic (LSN) nerve attached and opened longitudinally. The tissue is placed in a recording chamber, pinned flat and perfused with oxygenated Krebs solution. Focal electrical stimulation is used to locate the colorectal afferent endings, which are further tested by three distinct mechanical stimuli (blunt probing, mucosal stroking and circumferential stretch) to functionally categorize the afferents into five mechanosensitive classes. Endings responding to none of these mechanical stimuli are categorized as mechanically-insensitive afferents (MIAs). Both mechanosensitive and MIAs can be assessed for sensitization (i.e., enhanced response, reduced threshold, and/or acquisition of mechanosensitivity) by localized exposure of RFs to chemicals (e.g., inflammatory soup (IS), capsaicin, adenosine triphosphate (ATP)). We describe the equipment and colorectum&#8211;nerve recording preparation, harvest of colorectum with attached PN or LSN, identification of RFs in the colorectum, single-fiber recording from nerve fascicles, and localized application of chemicals to the RF. In addition, challenges of the preparation and application of standardized mechanical stimulation are also discussed.

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation.

In-vitro-Funktionelle Charakterisierung von Maus Colorectal Afferente Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene and cell therapies are highly promising alternative approaches for CVD treatment. However, the broad clinical application of gene therapy is greatly limited by the lack of suitable gene delivery systems. The development of appropriate gene delivery vectors can provide a solution to current challenges in cell therapy. In particular, existing drawbacks, such as limited efficiency and low cell retention in the injured organ, could be overcome by appropriate cell engineering (i.e., genetic) prior to transplantation. The presented protocol describes the efficient and safe transient modification of endothelial cells using a polyethyleneimine superparamagnetic magnetic nanoparticle (PEI/MNP)-based delivery vector. Also, the algorithm and methods for cell characterization are defined. The successful intracellular delivery of microRNA (miR) into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) has been achieved without affecting cell viability, functionality, or intercellular communication. Moreover, this approach was proven to cause a strong functional effect in introduced exogenous miR. Importantly, the application of this MNP-based vector ensures cell magnetization, with accompanying possibilities of magnetic targeting and non-invasive MRI tracing. This may provide a basis for magnetically guided, genetically engineered cell therapeutics that can be monitored non-invasively with MRI.

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

This manuscript describes the efficient, non-viral delivery of miR to endothelial cells by a PEI/MNP vector and their magnetization. Thus, in addition to genetic modification, this approach allows for magnetic cell guidance and MRI detectability. The technique can be used to improve the characteristics of therapeutic cell products.

Vorbereitung und<em&gt; In Vitro</em&gt; Charakterisierung von Magnetized miR-modifizierten Endothelzellen

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...