Diese Arbeit wurde zum Teil durch NIH / NCI Grants Anzahl 1R01CA158372-01 (Qi) und New Drug Staat Key Project Grant Number 009ZX09102-205 (Qi) unterstützt. Schreiben Hilfe wurde von Dr. Judy Racadio vorgesehen ist, und wurde von der Universität von Cincinnati Abteilung für Hämatologie und Onkologie finanziert. Vontz Core-Imaging Lab (VCIL) in der Hochschule für Medizin an der Universität von Cincinnati.

Ethik-Erklärung der Tiernutzung. Und des Cincinnati Children Hospital Research Foundation (Tierschutz-Assurance-Nummer A3108-01): Alle Tierversuche wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der Universität von Cincinnati (11-05-05-02 IACUC Protocol Number) genehmigt. Alle Versuche mit Mäusen folgten die Tierpflege-Richtlinien der Universität von Cincinnati und des Cincinnati Children Hospital Research Foundation. 1. Bereiten Tiermodelle Hinweis: Drei verschiedene Tiermodelle unten skizziert haben in unserer früheren Studien verwendet: <ol><li> Orthotopische Gehirntumor der Maus: Mit Nu / Nu athymischen weiblichen Mäusen, die mit der menschlichen intrakranial U87-ΔEGFR-Luc Zellen injiziert worden. Diese Mäuse entwickeln einen aggressiven Tumor, die typische Merkmale der menschlichen Glioblastom. </li><li> Gentechnisch veränderte Gehirntumor Mausmodellen 13: Rasse MUT3 (GFAP-cre; Nf1loxP / +; Trp53-/ +) männlichen Mäusen mit Trp53loxP/loxP; PtenloxP / loxP Weibchen Mut6 Mäuse zu erzeugen (GFAP-cre; Nf1loxP / +; Trp53-/loxP; PtenloxP / +). Pflegen MUT3 Mäuse in B6CBAF1 / J-Stamm durch Zucht männlich MUT3 Mäuse mit weiblichen B6CBAF1 / J-Mäusen. Genotyp der Mäuse zwischen P9 und P12 und bestätigen Sie die Genotypen nach der Ernte ihren Geweben. </li><li> K / B × N-Arthritis: Verwenden C57Bl/6J Mäusen, die intraperitoneal mit 150 ul Seren von KRN x NOD F1-Mäusen verabreicht wurden. Diese Mäuse entwickeln Arthritis 24 bis 48 Stunden nach Injektion Seren. Imaging der arthritischen Mäusen an Tag 7 durchgeführt folgenden Seren Verwaltung, ein Zeitpunkt, bei dem Mäuse zeigen offene makroskopische Arthritis. Mäuse sollte anhand der Kriterien in dem nächsten Schritt beschrieben ausgewertet werden. <ol><li> Bewertung von Mäusen für makroskopische Arthritis mit einer arthritischen Index makroskopischen Scoring-System wie folgt: 0 = keine nachweisbare Arthritis, 1 = Schwellung und / oder Rötung der Pfote oder eine Ziffer, 2 = zwei Gelenke beteiligt, 3 = drei Gelenke INVOLved, und 4 = schwere Arthritis der gesamten Pfote und Stelle. Die arthritischen Punktesystem wird verwendet, um die Anzahl der betroffenen Gelenke und der Schwere der Arthritis in der Maus Pfoten bestimmen. Auch Mäuse, die mit der höchstmöglichen Punktzahl arthritischen zeigen nur selten Anzeichen von Unbeweglichkeit. Allerdings ist Arthritis wachten 3x/Woche und Mäusen in übermäßige Schmerzen (wie schwere Immobilität von geschwollenen Pfoten, die Lebensmittel-und Wasserverbrauch hemmt) geopfert werden. </li><li> Hinweis: Flüssigkeiten injiziert IV in die Schwanzvenen der Maus haben Sterilität während des Experiments gehalten. Sauber, steril, Einweg-Spritzen und Ampullen sind für Studien Lösung Zubereitung und Verabreichung verwendet. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung von fluoreszenzmarkierten SapC-DOPS Nanovesicles <ol><li> SapC Proteinproduktion: Rekombinante SapC Protein mit genauen menschlichen SapC Sequenz wurde in E. hergestellt coli-Zellen wie zuvor mit Modifikationen 4 beschrieben.SapC wurde von Ethanol, gefolgt von Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie-Reinigungen fällt. Nach der Gefriertrocknung, trocken SapC verwendet wurde und die Konzentration wurde durch sein Gewicht bestimmt. </li><li> Mischen SapC Protein wie zuvor beschrieben 7,10,11. Mix DOPS (0,18 mg) und CVM (0,03 mg) in einem Glasröhrchen und mit Stickstoffgas auf Lipid Lösungsmittel verdampfen. </li><li> Hinzufügen SapC Proteinpulver (0,32 mg) zu der Mischung, die Aussetzung der Trockenmischung in 1 ml PBS-Puffer und beschallen Bad für etwa 15 min, wie vorstehend beschrieben 7,10,11. Dann übergeben Sie die Suspension durch eine Sephadex G25-Säule (PD-10), freie CVM Farbstoff zu entfernen. Anregungs-und Emissionsmaxima des Endprodukts, dh SapC-DOPS-CVM nanovesicles, sind 653 nm und 677 nm auf. </li></ol> 3. Imaging <ol><li> Verwenden Gehirntumor und Arthritis Mausmodellen (oben in Schritt 1 beschrieben), um das System zu testen Maroi. Anesthetize Mäuse mit 2% Isofluran bewirken. 1-2% Isofluran ist maintaINED für die Dauer der bildgebenden Verfahren. Warmluft wird kontinuierlich und sanft in die Abbildungskammer für die Dauer der Bildgebungs geliefert. Eine kleine Perle von sterilen künstliche Tränen Salbe wird jedem Auge der Maus angelegt, um zu decken und schmieren das Auge. Platzieren Mäuse in der MARS-System durch Positionieren der Mäuse in Rückenlage mit ihrem Rücken zunächst in Richtung der Kamera (1) gerichtet ist. Kalibrieren Sie den MARS 380 ° Trägerfolie und positionieren Sie die Maus mit der Dreh Software in der Registerkarte Protokoll Bruker MI. Erhalten Basis-Images von Mäusen vor SapC-DOPS-CVM Verwaltung in der unten beschriebenen Weise. </li><li> Injizieren Sie 200 ul SapC-DOPS-CVM intravenös in die Schwanzvene der Maus. Verabreichen und arthritischen Mäusen oder Hirntumor-tragenden Mäusen zu steuern. </li><li> Bild Mäuse 24 Stunden nach der Injektion wieder auf 7-9 Tage nach der Injektion, indem Fluoreszenz (25 sec Belichtungszeit) und X-ray (10 sec Belichtungszeit) iMagier bei 10 °-Schritten über einen Zeitraum von 380 °, wodurch eine geringe Überlappung, um sicherzustellen, gibt es keine Lücken in der Drehdatenmenge. Mit Bruker MI-Software, überlagern Fluoreszenz auf Röntgenbildern für anatomische Lokalisierung. </li></ol> 4. Bildanalyse <ol><li> Zeichnen Sie eine rechteckige ROI umfasst die Breite des Sichtfeld (FOV) der Erkrankung Website (Tumor-und Arthritis). Der ROI muss groß genug sein, um die Krankheit Merkmals innerhalb des FOV das Tier bewegt sich im Verlauf der 380 °-Drehung zu halten. Für Gehirntumor Mäuse (orthotope und transgene Modelle), verwenden Sie die gleiche rechteckige ROI auf jeden Tumor-Modell und seine drei (3) entsprechenden Kontrollmäusen für alle Zeitpunkte (Baseline, 24 Stunden und 9 Tage). Die Positionierung der rechteckigen ROI für jede Maus über alle Zeitpunkte durch Verwendung anatomischer Landmarken auf entsprechenden Röntgenbilder eines jeden Tieres erhalten. Die anatomische Wahrzeichen (s) auf der Tumormodell identifiziert, müssen auch pla verwendet werdence identischen rechteckigen ROIs auf entsprechenden Kontrollen jedes Modell. Anatomische Landmarken auf den Röntgenbildern ermöglicht konsistente Platzierung ROI identifiziert sind die Basis des Schädels und der hinteren Seite des Jochbogens. Sie sind auf der rechten und linken Seiten visualisiert Schädel in der posterior-anterior (PA) Bild. </li><li> Nach der automatischen Hintergrundabzug, Ermittlung der mittleren Fluoreszenzintensität für jedes Bild. Konvertieren Sie die Fluoreszenzbilder Photonen / s / mm 2 mit Bruker MI Imaging-Software. Zeichnen Sie die Fluoreszenzwerte als Funktion der Bildwinkel und gelten als Fehlerbalken die Standardabweichung der von Kontrollmäusen mit Excel oder andere Grafik-Software erhalten gemittelte Fluoreszenzwerte. </li></ol>

<ol>
	<li>Pizzonia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodality+animal+rotation+imaging+system+(Mars)+for+in+vivo+detection+of+intraperitoneal+tumors.">Multimodality animal rotation imaging system (Mars) for in vivo detection of intraperitoneal tumors.</a> Am J Reprod Immunol. 67, 84-90 (2012).</li><li>Al-Mehdi, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+depth+of+cellular+imaging+in+the+intact+lung+using+far-red+and+near-infrared+fluorescent+probes.">Increased depth of cellular imaging in the intact lung using far-red and near-infrared fluorescent probes.</a> Int J Biomed Imaging. , (2006).</li><li>Gertner-Dardenne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipophilic+fluorochrome+trackers+of+membrane+transfers+between+immune+cells.">Lipophilic fluorochrome trackers of membrane transfers between immune cells.</a> Immunol Invest. 36, 665-685 (2007).</li><li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+human+saposins+expressed+in+Escherichia+coli.+Evidence+for+binding+and+activation+properties+of+saposins+C+with+acid+beta-glucosidase.">Functional human saposins expressed in Escherichia coli. 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Arch Biochem Biophys. 424, 210-218 (2004).</li><li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-selective+targeting+and+cytotoxicity+by+liposomal-coupled+lysosomal+saposin+C+protein.">Cancer-selective targeting and cytotoxicity by liposomal-coupled lysosomal saposin C protein.</a> Clin Cancer Res. 15, 5840-5851 (2009).</li><li>Kaimal, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saposin+C+coupled+lipid+nanovesicles+enable+cancer-selective+optical+and+magnetic+resonance+imaging.">Saposin C coupled lipid nanovesicles enable cancer-selective optical and magnetic resonance imaging.</a> Mol Imaging Biol. 13, 886-897 (2011).</li><li>Lu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+4+can+recognize+SapC-DOPS+to+stimulate+macrophages+to+express+several+cytokines.">Toll-like receptor 4 can recognize SapC-DOPS to stimulate macrophages to express several cytokines.</a> Inflamm Res. 60, 153-161 (2011).</li><li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saposin+C+coupled+lipid+nanovesicles+specifically+target+arthritic+mouse+joints+for+optical+imaging+of+disease+severity.">Saposin C coupled lipid nanovesicles specifically target arthritic mouse joints for optical imaging of disease severity.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Abu-Baker, S., Chu, Z., Stevens, A. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pten+haploinsufficiency+accelerates+formation+of+high-grade+astrocytomas.">Pten haploinsufficiency accelerates formation of high-grade astrocytomas.</a> Cancer Res. 68, 3286-3294 (2008).</li></ol>

Es gibt nichts zu offenbaren.

Die genaue Bestimmung der Lage und Größe von soliden Tumoren und Entzündungsherde bei rheumatischen Bedingungen ist entscheidend für die Umsetzung eine angemessene Behandlung und Follow-up Krankheitsprogression oder Remission. Während wertvolle, aktuelle Bildstrategien (Röntgenstrahlen, MRI, Ultraschall, Röntgen-Computertomographie) liefern unvollständige Bewertung des Krankheitsstatus. Zum Beispiel wird arthritischen Gelenkschäden üblicherweise durch Röntgenstrahlen, die Informationen über die Knochenstruktur, aber nicht auf weichem Gewebe Entzündung und Zerstörung, die charakteristisch für frühe Stadien der Erkrankung liefert bewertet. Die hier vorgestellte Maroi Verfahren verbindet die Vorteile der beiden Röntgenbilder und anspruchsvolle Weichgewebeabbildungsmodalitäten (z. B. MRI oder Ultraschall) in einem integrierten, nicht invasiv und einfacher Plattform, ermöglicht auch eine vollständige 3D-Mapping-und Wiederaufbau des erkrankten Gewebes oder Organs in Kleintiere wie Mäuse. Diese Methode nutzt die selektive Affinität of SapC-DOPS nanovesicles für exponierte Phosphatidylserin-Reste, die in den Membranen von Krebs und Entzündungszellen reichlich vorhanden sind. Die Determinante dieser Bindung ist SapC eine fusogene lysosomale Protein mit einer starken Affinität für anionische Phospholipide wie Phosphatidylserin 7,10,11. Wenn zu einer Fluoreszenzsonde (CVM) konjugiert sind, können systemisch injiziert SapC-DOPS, Tumor und arthritischen Websites durch Fluoreszenz-Bildgebung verfolgt werden. Einschränkungen der Methode sind, um die Empfindlichkeit, die derzeit schränkt seine Verwendung zu Abbildung von kleinen Tieren wie Mäusen verwandt. Wie bei anderen bildgebenden Verfahren wird eine optimale Fluoreszenzsignal-Rausch-Verhältnis von der Größe des Tumors oder den Umfang der Arthritis beschränkt und kann bei der Abbildung Geweben oder Organen mit hohen Hintergrund (Autofluoreszenz), wie Nasen (Bildgebung), Darm beeinträchtigt werden / Kot (abdominale Bildgebung) und Pfoten (Hinterbein-Bildgebung). In diesem Zusammenhang haben wir festgestellt, daß ein dunkelrotes Farbstoff wie CVM proVides bessere spektrale Trennung und Auflösung in der in-vivo-Einstellung als die anderen fluoreszierenden Sonden im sichtbaren Bereich. Weitere Fallstricke sind potenzielle Bewegung des Tieres während der Bildgebung, die beide während der Narkose und post mortem (Rigor mortis). Hinterbein Positionierung, insbesondere ist oft schwierig zu stabilisieren, um eine Bewegung während der Drehung zu vermeiden. Im gegenwärtigen Zustand der Technik ist auch zeitaufwendig, mit Scan-mal so lang wie 60 Minuten benötigt, um eine volle Drehung vollenden und zu erwerben qualitativ hochwertige Bilder. Die Maroi Verfahren weist eine Anzahl von Vorteilen gegenüber anderen bildgebenden Verfahren. Die Fähigkeit, Bild erkrankte Gewebe ab 38 (oder mehr) unterschiedlichen Winkeln ermöglicht die Visualisierung von Fluoreszenz, die bei der Beurteilung der aus einer einzigen Ebene behindert werden kann; Das ist wertvoll in Tierstudien, weil es kann helfen, die Zahl der falsch-negative, die von der Bildgebung zu unpassenden Winkel führen zu minimieren. Durch overlying Röntgen-und Fluoreszenzbilder kann eine genaue anatomische Lokalisation der erkrankten Stelle bestimmt werden. Schließlich ist die Möglichkeit der Live (in vivo)-Bildgebung ermöglicht Langzeitstudien durchgeführt werden.

Ganze Tierbildgebung hat sich zu einem leistungsfähigen Werkzeug für die Untersuchung von Tierarzneimitteltherapie. Unter aktuellen Imaging-Systeme, ermöglicht die MS PRO FX Forscher genau visualisieren fluoreszenzmarkierten (oder lumineszierende)-Verbindungen und / oder Geweben in lebenden Mäusen, und gleichzeitig erhalten Röntgenbilder. Mit der kürzlich eingeführten multimodale Tierrotationssystem (MARS) eine vollständige, automatische Rotation der Maus, um sowohl die fluoreszierenden / lumineszierende und Röntgenbilder in bestimmten Winkeln zu erfassen 1 erreicht. Bildaufnahme kann so programmiert, daß sequentielle Bildfolge kann zu bestimmten, der Zwischenwinkel so klein wie 1 ° erfasst werden. Dies ermöglicht es, die optimale Orientierung des Tieres, dh zu identifizieren. , in dem der Abstand zwischen dem intern erzeugten Fluoreszenz / Lumineszenz-Signal und die Erfassungseinrichtung des Systems ist der kürzeste. Dies wiederum erleichtert die genaue Positionierung des Tieres für die nachfolgende Abbildungs ​​SEssions während Längsschnittstudien. In diesem Bericht beschreiben wir die Umsetzung einer Multi-Angle-Dreh optische Bildgebung (Maroi)-System zur in vivo Quantifizierung von fluoreszierenden Marker Intensität. Maroi Signalkurvenanalyse kann in Längsschnittstudien für die direkte Korrelation von Fluoreszenzsignalverteilung präzise Karte erkrankten Stellen oder biologische Prozesse von Interesse verwendet werden. Dieses System wurde verwendet, um die Absorption von fluoreszenzmarkierten SapC-DOPS nanovesicles nach orthotopen und spontane Tumoren zu überwachen, als auch von arthritischen Foci in lebenden Mäusen; vorgesehen, multispektrale und multimodaler Datensätze von kompletten Dreh Deckung der Tiere abgeleitet. Unter den vielen Fluoreszenzsonden derzeit für die in vivo-Bildgebung zur Verfügung, denen emittierenden im nahen Infrarot und fernen roten Spektralbereich verleihen den niedrigsten Interferenz mit der Haut und Gewebe, und stellen die größte Verbreitung und Bild reslösung. Wir verwendeten CellVue Maroon (CVM) 2,3, eine weit rot fluoreszierenden Zell Linker (Ex 647/Em 667), um SapC-DOPS (SapC-DOPS-CVM) 4-12 zu beschriften.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1246">
	<colgroup>
		<col /> 
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
			<td style="width:423px;">Gibco (Grand Island, NY)</td>
			<td style="width:307px;">11965</td>
			<td style="width:167px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:423px;">Gibco (Grand Island, NY)</td>
			<td style="width:307px;">16000077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:423px;">Hyclone (Logan, Utah)</td>
			<td style="width:307px;">SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Dioleoylphosphatidylserine</td>
			<td style="width:423px;">Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL)</td>
			<td style="width:307px;">840035C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">CellVue Maroon</td>
			<td style="width:423px;">Molecular Targeting Technologies, Inc. (Exton, PA)</td>
			<td style="width:307px;">C-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sephadex G25 column PD-10</td>
			<td style="width:423px;">Amersham Pharmacia Biotech, (Piscataway, NJ)</td>
			<td style="width:307px;">17-0851-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:351px;">New Standard Stereotaxic for Rats and Mice</td>
			<td style="width:423px;">Harvard Apparatus (Holliston, MA)</td>
			<td style="width:307px;">726335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Bransonic Ultrasonic Cleaners Model 1510</td>
			<td style="width:423px;">Branson Ultrasonics (Danbury,CT)</td>
			<td style="width:307px;">CPN-952-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Multi-spectral FX system</td>
			<td>Bruker Corporation (Billerica, MA)</td>
			<td style="width:307px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multi-angle Rotational Optical Imaging Device</td>
			<td>Bruker Corporation (Billerica, MA)</td>
			<td style="width:307px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo optical imaging of brain tumors and arthritis using fluorescent sapc-dops nanovesicles

Wir beschreiben eine Mehrfachwinkel-Dreh optischen Abbildungs ​​(Maroi)-System für die in vivo-Überwachung von physiopathologischen Prozessen mit einem fluoreszierenden Marker markiert ist. Mausmodelle (Gehirntumor und Arthritis) wurden verwendet, um die Nützlichkeit dieses Verfahrens zu beurteilen. Saposin C (SapC)-Dioleoylphosphatidylserin (DOPS) nanovesicles mit CellVue Maroon (CVM) Fluorophor markiert wurden intravenös verabreicht. Die Tiere wurden dann in der Drehhalterung (MARS) des in vivo-Bildgebungssystem angeordnet ist. Die Bilder wurden in 10 °-Schritten über 380 ° erworben. Eine rechteckige Region von Interesse (ROI) wurde über die gesamte Bildbreite auf das Modell Erkrankungsstelle angeordnet. Innerhalb der ROI, und für jedes Bild, mittlere Fluoreszenzintensität wurde nach Subtraktion des Hintergrunds berechnet. In den Mausmodellen untersucht wurden die markierten nanovesicles sich sowohl in den orthotopen und transgene Hirntumoren entnommen und in den arthritischen Stellen (Zehen und Knöchel). Curve Analyse des Multi-Winkel-image ROIs bestimmt den Winkel mit dem höchsten Signal. Somit wird der optimale Winkel für die Abbildung jedes Erkrankungsstelle charakterisiert. Die Bildgebung von fluoreszierenden Verbindungen angewendet Maroi Verfahren ist eine nichtinvasive, wirtschaftlich und präzise Werkzeug für In-vivo-quantitative Analyse der Krankheitszustände, die in den beschriebenen Mausmodellen.

Wir zeigen hier, dass SapC-DOPS nanovesicles mit einem dunkelroten Farbstoff (CVM) markierten spezifisch akkumulieren in orthotopen und spontane Mausgehirntumoren sowie in arthritischen Gelenken von K / B × N-Mäusen. Serien aus einer ROI während vollständige Umdrehungen der Mäuse über jedem Erkrankungsstelle angeordnet erfassten Fluoreszenz / Röntgenbilder wurden Maroi Kurvenanalyse, welche die optimale Abbildungswinkel mit der höchsten Fluoreszenzintensität ergab, ausgesetzt. Der primäre Zweck für die Verwendung des MARS-Systems ist es, den optimalen Winkel der Fluoreszenz zu bestimmen, so daß die genauesten Messungen können genommen werden. Repräsentative Ergebnisse aus drei Experimenten mit Mäusen, die mit Gehirntumoren oder Arthritis gezeigt. Mit SapC-DOPS-CVM und das MARS-System (Abbildung 1), die bestmögliche Bildwinkel für die Beobachtung der Tumor oder Entzündung durch Arthritis bestimmt. Fluoreszenzbilder, gefolgt von einer Röntgennahme wurden alle 10 ° erworbenwährend einer 380 °-Drehung der Maus. Fluoreszenzbilder wurden auf die entsprechenden Röntgenbilder für die Bildanzeige-und Rotationsfilmerzeugungslagert. Ergebnisse der orthotopen Gehirntumormodell sind in Abbildung 2 gezeigt. Das Fluoreszenzbild eines repräsentativen orthotopen Tumor-tragenden Mäusen (Ortho1) ist in 2A gezeigt. Die optimalen Bildwinkel für dieses Tier ist 10 °, die Position, an der die Fluoreszenz Photonenintensität am größten ist (2B). Die Messungen wurden vor der Injektion mit SapC-DOPS-CVM (Baseline) 24 Stunden nach der Injektion genommen und. Kontrollmäuse (tumorfrei) erhielt eine ähnliche Behandlung. Abbildung 3 zeigt vergleichbare Daten aus der gentechnisch veränderten Gehirntumor-Mausmodell. Die Fluoreszenzbilder und Photonen Messungen wurden vor der Injektion mit SapC-DOPS-CVM (Grundlinie) aufgenommen und 24 Stunden (Fig. 3A und &lt;strong&gt; 3B) und 9 Tage (3C) nach der Injektion. Diese Grafiken zeigen, dass die optimale Bildwinkel in der tumortragenden Tier (Tumor Mut49) 20 ° 24 Stunden nach der Injektion, aber Änderungen bis 10 ° 9 Tage nach der Injektion. Dies deutet darauf hin, dass die Fluoreszenzsignaländerung mit morphologischen Veränderungen, wahrscheinlich reflektieren Tumorwachstum korreliert. Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, zeigt deutlich die Maroi Verfahren, dass das Fluoreszenzsignal abnimmt, für Vorsprünge mit zunehmender Drehung weg von der optimalen Abbildungswinkel. In Hirntumoren, wurde eine durchschnittliche Abnahme des Fluoreszenzsignals 7% erhalten, wenn physische Ausrichtung des Tieres war ± 10 ° versetzt von der optimalen Bildwinkel. Eine durchschnittliche 21% ige Abnahme der Fluoreszenz-Signal wurde bei ± 20 ° gemessen. So relativ kleine Verschiebungen aus dem optimalen Winkel kann zu erheblichen Signaldämpfung führen. Mit Hilfe der Technik für Maroi Bildpositionierung wird inve ermöglichenstigators mehr konsistente und zuverlässige Daten zu erzeugen. Die Maroi Verfahren wurde schließlich verwendet werden, um die Ausrichtung der arthritischen Gelenke durch SapC-DOPS-CVM 24 Stunden nach SapC-DOPS-CVM Injektion zu beurteilen. Dieses Tier hat 3 mit drei arthritischen Gelenken. Fluoreszenzbilder der Zehe und Knöchel des arthritischen Maus sind in den 4A und 4B gezeigt. Entsprechenden Photonen Messungen bei 10 ° Drehintervalle sind in Fig. 4C und 4D graphisch dargestellt. Die optimalen Bilderzeugungswinkel für die Zehen-und Knöchel gefundenen 140 ° und 120 °. Zusammenfassend ist die Kombination des Maroi System mit fluoreszierenden SapC-DOPS nanovesicles stellt eine nicht-invasive, genaue und hochempfindliche Strategie für die Bildgebung, die für quantitative Untersuchungen der Tumorprogression und Arthritis bei Kleintieren erlaubt. Die Möglichkeit des Erwerbs einer 360 ° multimodale Bildgebung Datenmenge erheblich Improes Datenanalyse und Interpretation, verglichen mit dem, was erreichbar mit einzelnen Winkel bildgebenden Verfahren. <img alt="Tabelle 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187table1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187table1.jpg" width="600px" /> Tabelle 1. Optimale Abbildungswinkel für jede Maus-Modell. Die Unterschiede zwischen dem Winkel der maximalen Photonenfluoreszenz (FLR optimalen Winkel) und der Standard anatomischen Winkel (X-ray) gesehen werden kann. Wenn diese beiden Winkel immer anders, ändert sich das Messsignal erheblich. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187table1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig1.jpg" width="600px"/&gt; Abbildung 1. Multi-Winkel Dreh optische Bildgebung (Maroi) Gerät. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Figur 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig2.jpg" width="600px" /> Abbildung 2. Fluoreszenzsignal vs Bildwinkel in einem orthotopen Mausmodell Gehirntumor. (A). Bild des Peakfluoreszenzsignal bei der optimalen Bildwinkel von 10 °. Die blaue Box zeigt den ROI verwendet, um die emittierten Photonen quantifizieren. (B). Graph der Bildwinkel gegenüber Photonenemission. Der Vertreter orthotopen tumortragenden Maus (Ortho1) gegen gemittelte Fluoreszenzwerte aus identischen ROIs in drei nontumor Mäuse graphisch dargestellt. Die Messungen wurden an der Basislinie genommen (vor der Injektion) und 24 Stunden nach der injection. Fehlerbalken stellen Standardabweichung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig3.jpg" width="600px" /> 3. Fluoreszenzsignals gegen Bildwinkel in einer spontanen Gehirntumor eines gentechnisch Mausmodell. (A). Bild des Spitzenfluoreszenzsignal des ROI 1 (oben blauer Kasten) an der optimalen Bildwinkel von 20 °. (B) und (C). Zeitlicher Verlauf der Bildwinkel gegenüber Photonenemission aus ROI ein. Werte aus einer Vertreter spontane Gehirntumor-tragenden Mäusen, Tumor-Mut 49, gegen gemittelten Werte von drei nicht Mäusen Tumor graphisch dargestellt. Messungen wurden an der Grundlinie (vor dem Einspritz) und 24 Stunden (B) und 9 Tage (C) nach der Injektion. Fehler b<html> ars repräsentieren die Standardabweichung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig4.jpg" width="600px" /> Abbildung 4. Fluoreszenzsignal vs Bildwinkel in einer Maus mit Arthritis der Zehen-und Knöchelgelenke. (A) und (B). Bilder, die die Spitzenfluoreszenzsignal für die Zehen (A) und Sprunggelenk (B), innerhalb der in der roten Box gezeigt ROIs. (C). Graph von Winkel gegen meine Photonenemission für den Fuß. Peak-Photon Emission kann in einem Winkel von 140 ° zu sehen ist (D) Grafik der Winkel gegenüber bedeuten Photonenemission für den Knöchel.. Maximalintensität tritt bei einem Winkel von 120 °.target = &quot;_blank&quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

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In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

Wir beschreiben eine Mehrfachwinkel-Dreh optischen Abbildungs ​​(Maroi)-System für die in vivo Quantifizierung einer Fluoreszenzmarkierung von Saposin C (SapC), Dioleoylphosphatidylserin (DOPS) nanovesicles geliefert. Der Einsatz Mausmodellen von Krebs und Arthritis, zeigen wir, wie die Signalkurve Maroi Analyse kann für die genaue Zuordnung und biologische Charakterisierung von Krankheitsprozessen eingesetzt werden.

In Vivo Optical Imaging von Hirntumoren und Arthritis mit fluoreszierenden SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

11.2K Aufrufe.  University of Cincinnati College of Medicine.  Wir beschreiben eine Mehrfachwinkel-Dreh optischen Abbildungs ​​(Maroi)-System für die in vivo Quantifizierung einer Fluoreszenzmarkierung von Saposin C (SapC), Dioleoylphosphatidylserin (DOPS) nanovesicles geliefert. Der Einsatz Mausmodellen von Krebs und Arthritis, zeigen wir, wie die Signalkurve Maroi Analyse kann für die genaue Zuordnung und biologische Charakterisierung von Krankheitsprozessen eingesetzt werden. 

Serie: In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues as well as altered cytokine homeostasis. The innate immune system plays a crucial role in recognizing pathogens and other endogenous danger stimuli. One of the major cytokines released by innate immune cells is Interleukin (IL)-1. Therefore, we utilize a whole blood stimulation assay in order to measure the secretion of inflammatory cytokines and specifically of the pro-inflammatory cytokine IL-1&beta; 1, 2, 3.
Patients with genetic dysfunctions of the innate immune system causing autoinflammatory syndromes show an exaggerated release of mature IL-1&beta; upon stimulation with LPS alone. In order to evaluate the innate immune component of patients who present with inflammatory-associated pathologies, we use a specific immunoassay to detect cellular immune responses to pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), such as the gram-negative bacterial endotoxin, lipopolysaccharide (LPS). These PAMPs are recognized by pathogen recognition receptors (PRRs), which are found on the cells of the innate immune system 4, 5, 6, 7. A primary signal, LPS, in conjunction with a secondary signal, ATP, is necessary for the activation of the inflammasome, a multiprotein complex that processes pro-IL-1&beta; to its mature, bioactive form 4, 5, 6, 8, 9, 10.
The whole blood assay requires minimal sample manipulation to assess cytokine production when compared to other methods that require labor intensive isolation and culturing of specific cell populations. This method differs from other whole blood stimulation assays; rather than diluting samples with a ratio of RPMI media, we perform a white blood cell count directly from diluted whole blood and therefore, stimulate a known number of white blood cells in culture 2. The results of this particular whole blood assay demonstrate a novel technique useful in elucidating patient cohorts presenting with autoinflammatory pathophysiologies.

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&amp;#946; using a Whole Blood Stimulation Assay

We describe a simple immunoassay to measure the production of pro-inflammatory cytokines, such as IL-1 beta production, in patients presenting with autoinflammatory phenotypes. By activating cells in whole blood cultures with pathogen-associated molecular patterns, specifically with lipopolysaccharide, cytokine secretion can be conveniently evaluated in whole blood supernatants.

Genaue und einfache Messung der pro-inflammatorischen Zytokins IL-1β mit einem Vollblut Stimulation Assay

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

Forschung

Medizin

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Evaluation von Nanopartikel-Aufnahme in Tumoren in Echtzeit über Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Probing the Brain in Autism Using fMRI and Diffusion Tensor Imaging

Newly emerging theories suggest that the brain does not function as a cohesive unit in autism, and this discordance is reflected in the behavioral symptoms displayed by individuals with autism. While structural neuroimaging findings have provided some insights into brain abnormalities in autism, the consistency of such findings is questionable. Functional neuroimaging, on the other hand, has been more fruitful in this regard because autism is a disorder of dynamic processing and allows examination of communication between cortical networks, which appears to be where the underlying problem occurs in autism. Functional connectivity is defined as the temporal correlation of spatially separate neurological events1. Findings from a number of recent fMRI studies have supported the idea that there is weaker coordination between different parts of the brain that should be working together to accomplish complex social or language problems2,3,4,5,6. One of the mysteries of autism is the coexistence of deficits in several domains along with relatively intact, sometimes enhanced, abilities. Such complex manifestation of autism calls for a global and comprehensive examination of the disorder at the neural level. A compelling recent account of the brain functioning in autism, the cortical underconnectivity theory,2,7 provides an integrating framework for the neurobiological bases of autism. The cortical underconnectivity theory of autism suggests that any language, social, or psychological function that is dependent on the integration of multiple brain regions is susceptible to disruption as the processing demand increases. In autism, the underfunctioning of integrative circuitry in the brain may cause widespread underconnectivity. In other words, people with autism may interpret information in a piecemeal fashion at the expense of the whole. Since cortical underconnectivity among brain regions, especially the frontal cortex and more posterior areas 3,6, has now been relatively well established, we can begin to further understand brain connectivity as a critical component of autism symptomatology.
A logical next step in this direction is to examine the anatomical connections that may mediate the functional connections mentioned above. Diffusion Tensor Imaging (DTI) is a relatively novel neuroimaging technique that helps probe the diffusion of water in the brain to infer the integrity of white matter fibers. In this technique, water diffusion in the brain is examined in several directions using diffusion gradients. While functional connectivity provides information about the synchronization of brain activation across different brain areas during a task or during rest, DTI helps in understanding the underlying axonal organization which may facilitate the cross-talk among brain areas. This paper will describe these techniques as valuable tools in understanding the brain in autism and the challenges involved in this line of research.

Neuroimaging techniques, such as functional MRI and Diffusion Tensor Imaging have become increasingly useful in characterizing the cognitive and neural deficits in autism. An examination of brain connectivity in autism at a network level along with adaptations for scanning children with developmental disabilities is presented.

Probing the Brain in Autism mittels fMRT und Diffusion Tensor Imaging

Newly emerging theories suggest that the brain does not function as a cohesive unit in autism, and this discordance is reflected in the behavioral ...

Non-invasive Optical Measurement of Cerebral Metabolism and Hemodynamics in Infants

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can accurately screen for brain injury, monitor injury evolution, or assess response to therapy. The energy used by neurons is derived largely from tissue oxidative metabolism, and neural hyperactivity and cell death are reflected by corresponding changes in cerebral oxygen metabolism (CMRO2). Thus, measures of CMRO2 are reflective of neuronal viability and provide critical diagnostic information, making CMRO2 an ideal target for bedside measurement of brain health.
Brain-imaging techniques such as positron emission tomography (PET) and single-photon emission computed tomography (SPECT) yield measures of cerebral glucose and oxygen metabolism, but these techniques require the administration of radionucleotides, so they are used in only the most acute cases.
Continuous-wave near-infrared spectroscopy (CWNIRS) provides non-invasive and non-ionizing radiation measures of hemoglobin oxygen saturation (SO2) as a surrogate for cerebral oxygen consumption. However, SO2 is less than ideal as a surrogate for cerebral oxygen metabolism as it is influenced by both oxygen delivery and consumption. Furthermore, measurements of SO2 are not sensitive enough to detect brain injury hours after the insult 1,2, because oxygen consumption and delivery reach equilibrium after acute transients 3. We investigated the possibility of using more sophisticated NIRS optical methods to quantify cerebral oxygen metabolism at the bedside in healthy and brain-injured newborns. More specifically, we combined the frequency-domain NIRS (FDNIRS) measure of SO2 with the diffuse correlation spectroscopy (DCS) measure of blood flow index (CBFi) to yield an index of CMRO2 (CMRO2i) 4,5.
With the combined FDNIRS/DCS system we are able to quantify cerebral metabolism and hemodynamics. This represents an improvement over CWNIRS for detecting brain health, brain development, and response to therapy in neonates. Moreover, this method adheres to all neonatal intensive care unit (NICU) policies on infection control and institutional policies on laser safety. Future work will seek to integrate the two instruments to reduce acquisition time at the bedside and to implement real-time feedback on data quality to reduce the rate of data rejection.

We combined frequency-domain near-infrared spectroscopy measures of cerebral hemoglobin oxygenation with diffuse correlation spectroscopy measures of cerebral blood flow index to estimate an index of oxygen metabolism. We tested the utility of this measure as a bedside screening tool to evaluate the health and development of the newborn brain.

Non-invasive optische Messung des zerebralen Metabolismus und Hämodynamik bei Säuglingen

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality  and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can  accurately ...

In vivo Macrophage Imaging Using MR Targeted Contrast Agent for Longitudinal Evaluation of Septic Arthritis

Macrophages are key-cells in the initiation, the development and the regulation of the inflammatory response to bacterial infection. Macrophages are intensively and increasingly recruited in septic joints from the early phases of infection and the infiltration is supposed to regress once efficient removal of the pathogens is obtained. The ability to identify in vivo macrophage activity in an infected joint can therefore provide two main applications: early detection of acute synovitis and monitoring of therapy.
In vivo noninvasive detection of macrophages can be performed with magnetic resonance imaging using iron nanoparticles such as ultrasmall superparamagnetic iron oxide (USPIO). After intravascular or intraarticular administration, USPIO are specifically phagocytized by activated macrophages, and, due to their magnetic properties, induce signal changes in tissues presenting macrophage infiltration. A quantitative evaluation of the infiltrate is feasible, as the area with signal loss (number of dark pixels) observed on gradient echo MR images after particles injection is correlated with the amount of iron within the tissue and therefore reflects the number of USPIO-loaded cells.
We present here a protocol to perform macrophage imaging using USPIO-enhanced MR imaging in an animal model of septic arthritis, allowing an initial and longitudinal in vivo noninvasive evaluation of macrophages infiltration and an assessment of therapy action.

In vivo Macrophage Imaging Using MR Targeted Contrast Agent for Longitudinal Evaluation of Septic Arthritis

We demonstrate how to perform macrophage MR imaging using ultrasmall superparamagnetic contrast agent (USPIO) in septic arthritis, allowing an initial and longitudinal in vivo non-invasive evaluation of macrophages infiltration and an assessment of therapy efficacy.

In-vivo-Bildgebung mit MR Makrophagen gezielte Kontrastmittel für die Längs-Auswertung der septische Arthritis

Macrophages are key-cells in the initiation, the development and the regulation of the inflammatory response to bacterial infection. Macrophages are ...

Combined In vivo Optical and &#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in vivo optical and &#956;CT imaging allow the visualization of biological phenomena in an anatomical context. These imaging modalities may be especially useful to study conditions that impact bone. In particular, orthopaedic implant infections are an important problem in clinical orthopaedic surgery. These infections are difficult to treat because bacterial biofilms form on the foreign surgically implanted materials, leading to persistent inflammation, osteomyelitis and eventual osteolysis of the bone surrounding the implant, which ultimately results in implant loosening and failure. Here, a mouse model of an infected orthopaedic prosthetic implant was used that involved the surgical placement of a Kirschner-wire implant into an intramedullary canal in the femur in such a way that the end of the implant extended into the knee joint. In this model, LysEGFP mice, a mouse strain that has EGFP-fluorescent neutrophils, were employed in conjunction with a bioluminescent Staphylococcus aureus strain, which naturally emits light. The bacteria were inoculated into the knee joints of the mice prior to closing the surgical site. In vivo bioluminescent and fluorescent imaging was used to quantify the bacterial burden and neutrophil inflammatory response, respectively. In addition, &#956;CT imaging was performed on the same mice so that the 3D location of the bioluminescent and fluorescent optical signals could be co-registered with the anatomical &#956;CT images. To quantify the changes in the bone over time, the outer bone volume of the distal femurs were measured at specific time points using a semi-automated contour based segmentation process. Taken together, the combination of in vivo bioluminescent/fluorescent imaging with &#956;CT imaging may be especially useful for the noninvasive monitoring of the infection, inflammatory response and anatomical changes in bone over time.

Combined In vivo Optical and  &amp;#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Combined optical and &#956;CT imaging in a mouse model of orthopaedic implant infection, utilizing a bioluminescent engineered strain of Staphylococcus aureus, provided the capability to noninvasively and longitudinally monitor the dynamics of the bacterial infection, as well as the corresponding inflammatory response and anatomical changes in the bone.

Kombiniert<em&gt; In-vivo-</em&gt; Optische und μCT Imaging-Infektion, Entzündung und Knochenanatomie in einem Orthopädie Implantat-Infektion in Mäuse Monitor

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in ...

Creating Anatomically Accurate and Reproducible Intracranial Xenografts of Human Brain Tumors

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live animal &#8211;&#160;particularly in sites with unique physiological and architectural qualities such as the brain. In vitro and ectopic models cannot account for features such as vasculature, blood brain barrier, metabolism, drug delivery and toxicity, and a host of other relevant factors. Orthotopic models have their limitations too, but with proper technique tumor cells of interest can be accurately engrafted into tissue that most closely mimics conditions in the human brain. By employing methods that deliver precisely measured volumes to accurately defined locations at a consistent rate and pressure, mouse models of human brain tumors with predictable growth rates can be reproducibly created and are suitable for reliable analysis of various interventions. The protocol described here focuses on the technical details of designing and preparing for an intracranial injection, performing the surgery, and ensuring successful and reproducible tumor growth and provides starting points for a variety of conditions that can be customized for a range of different brain tumor models.

The brain is a unique site with qualities that are not well represented by in vitro or ectopic analyses. Orthotopic mouse models with reproducible location and growth characteristics can be reliably created with intracranial injections using a stereotaxic fixation instrument and a low pressure syringe pump.

Erstellen Anatomisch genaue und reproduzierbare intrakranielle Xenografts der Menschen Hirntumoren

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel. 
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

Rose Bengal Photothrombosis von konfokalen optischen Imaging<em&gt; In Vivo</em&gt;: Ein Modell des Einzelfahrzeug Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

Depletion von Maus-Zellen aus menschlichem Tumorxenografte deutlich verbessert Downstream-Analyse von Zielzellen

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the present protocol, mice expressing green fluorescent protein (gfp) under the promoter of Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) were used to image microglia cells in vivo in the retina. Microglia are resident macrophages of the retina and have been implicated in several retinal diseases1,2,3,4,5,6. This protocol provides a detailed approach for generation of retinal B-scans, with SD-OCT, and imaging of microglia cell distribution in Cx3cr1gfp/gfp mice with SLO in vivo, using an ophthalmic imaging platform system. The protocol can be used in several reporter mouse lines. However, there are some limitations to the protocol presented here. First, both SLO and SD-OCT, when used in the high-resolution mode, collect data with high axial resolution but the lateral resolution is lower (3.5 &#181;m and 6 &#181;m, respectively). Moreover, the focus and saturation level in SLO is highly dependent on parameter selection and correct alignment of the eye. Additionally, using devices designed for human patients in mice is challenging due to the higher total optical power of the mouse eye compared to the human eye; this can lead to lateral magnification inaccuracies7, which are also dependent on the magnification by the mouse lens among others. However, despite that the axial scan position is dependent upon lateral magnification, the axial SD-OCT measurements are accurate8.

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

This protocol describes how high-resolution imaging techniques such as spectral domain optical coherence tomography and scanning laser ophthalmoscopy can be utilized in small rodents, using an ophthalmic imaging platform system, to obtain information on retinal thickness and microglial cell distribution, respectively.

In Vivo Darstellung der Cx3cr1GLP/Gfp Reporter Mäuse mit Spectral-Domain optische Kohärenztomographie und Scanning Laser Ophthalmoskopie

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the ...