Dieses Protokoll ermöglicht es dem Benutzer, die Auswirkungen von invasiven chirurgischen Verfahren in der Klinik auf Tumorzellverhalten, wie Migration, Invasion, und Proliferation zu studieren. Diese Methode ermöglicht auf einzigartige Weise die Visualisierung desselben Tumors vor und nach einem invasiven Eingriff und bietet eine Einsicht, die bei einem nicht-längsförmigen Ansatz übersehen werden könnte. Nachdem Sie eine fehlende Reaktion auf Zehenkneifen in einer anästhesierten erwachsenen Maus bestätigt haben, montieren Sie die Maus auf einem stereotaktischen Rahmen und sichern Sie den Kopf mit einer Nasenklammer und zwei Ohrstangen.
Verwenden Sie eine Heizlampe, um die Körpertemperatur zu erhalten, und tragen Sie Salbe auf die Augen des Tieres auf. Mit einer scharfen Schere rasieren Sie das Fell auf dem Schädel von den Augen bis zur Schädelbasis und verwenden Sie 70% Ethanol, um die exponierte Haut zu sterilisieren. Schneiden Sie die Haut in einer kreisförmigen Weise, und verwenden Sie einen Wattestäbchen, um das exponierte Periost wegzukratzen.
Behandeln Sie den operationsfolgenden Bereich mit einem Tropfen von 1%Lidocain und einer 1:100, 000 Konzentration von Adrenalin für fünf Minuten, bevor Sie die überschüssige Lösung mit einem Wattestäbchen entfernen. Verwenden Sie Cyanoacrylatkleber, um die Ränder der Haut am Schädel zu haften, und legen Sie den stereotaktischen Rahmen unter ein Sezier-Stereomikroskop mit einer 4-fachen Vergrößerung. Als nächstes bohren Sie vorsichtig eine oberflächliche, fünf Millimeter Durchmesser, kreisförmige Nut über den rechten parietalen Knochen.
Und wenden Sie einen Tropfen Kortexpuffer auf die Nut an. Verwenden Sie dünne Zangen, um die Knochenklappe zu heben, um die Gehirnoberfläche zu visualisieren, und verwenden Sie gekrümmte, verjüngte, sehr feine Punktzange, um die Dura mater zu entfernen. Wenn Blutungen auftreten, verwenden Sie einen resorbierbaren Gelatineschwamm, um Hämostase zu erreichen.
Für die Tumorzellinjektion laden Sie etwa drei Mikroliter der Zellen in eine fünf Mikroliter gasdichte Spritze, die mit einer Punkt-Stil zwei Nadel ausgestattet ist. Befestigen Sie die Nadel am stereotaxic manipulator enarm, und entfernen Sie den Kortexpuffer aus dem freiliegenden Gewebe. Legen Sie die Spitze der Spritze in die Mitte der Kraniotomie und setzen Sie die Nadel in einer Tiefe von 0,5 Millimetern von der Schädeloberfläche ein.
Fügen Sie dann der Kraniotomie einen Tropfen Kortexpuffer hinzu und verwenden Sie einen Mikrospritzenpumpeninjektor, um die Zellen mit einer Rate von 250 bis 400 Nanoliter pro Minute zu liefern. Um das Cranial-Bildgebungsfenster vorzubereiten, ersetzen Sie den Kortexpuffer durch einen Tropfen Silikonöl an die Craniotomie-Stelle, um Luftblasen unter dem Fenster zu vermeiden. Versiegeln Sie das freigelegte Gehirn mit einem sechs Millimeter-Abdeckungsslip, und tragen Sie Cyanoacrylatkleber zwischen dem Coverslip und dem Schädel auf.
Dann verwenden Sie feine Pinzette, um den Deckelrutsch vorsichtig gegen den Schädel zu drücken. Platzieren Sie die Maus zum entsprechenden experimentellen Zeitpunkt in einer Bildbox und setzen Sie das 25-fache Wasserobjektiv auf die niedrigste Z-Position. Fügen Sie dem Objektiv einen großen Tropfen Wasser hinzu und übertragen Sie die Bildbox in die 37 Grad Celsius dunkle Klimakammer des Mikroskops.
Bringen Sie das Objektiv auf die Schädelbild-Fensterabdeckung, bis der Wassertropfen den Deckel berührt. Und mit dem Epifluoreszenz-Modus, beobachten Sie den Tumor durch das Okular, um die Zellen in den Fokus zu bringen. Stellen Sie den Laser auf die richtige Wellenlänge ein und wählen Sie den Live-Modus aus.
Nachdem Sie mehrere Positionen ausgewählt haben, die für die Bildgebung von Interesse sind, notieren Sie ihre Koordinaten in der Software. Definieren Sie einen Z-Stack für jede Position, um das maximale Volumen von Tumorzellen zu erfassen, ohne die Auflösung der Tumorzelle zu beeinträchtigen, wobei die Schrittgröße zwischen den Bildern auf drei Mikrometer festgelegt ist. Erfassen Sie dann Bilder des Tumorvolumens an verschiedenen Positionen alle 20 Minuten für zwei Stunden, wobei sie dem Objektiv vor jeder Bildaufnahme Wasser hinzufügen.
Nachdem das letzte Bild aufgenommen wurde, übertragen Sie die Maus auf ein Heizkissen mit Überwachung bis zur vollständigen Wiederherstellung. Sichern Sie einen Tag nach der ersten Bildgebungssitzung die anästhesierte Maus im stereotaxic-Rahmen, wie gezeigt, und wischen Sie mit einem acetongetränkten Wattestäbchen die Ränder des Deckels ab, bis der Kleber aufgeweicht wird. Schieben Sie eine 25-Spur-Nadel unter den Deckelund verwenden Sie dünne Punktzangen, um sie zu heben, und hydratisieren Sie die Kraniotomie mit frischem Kortexpuffer.
Punktieren Sie den Tumor mit einer 25-Meter-Nadel auf eine Tiefe von einem Millimeter, stoppen Sie Blutungen mit einem sterilen Gelatineschwamm und versiegeln Sie die Oberfläche des Gehirns mit frischem Silikonöl. Dann kleben Sie einen neuen sechs Millimeter Abdeckungslip über die Wunde. Öffnen Sie für die Bildanalyse die Zeitraffer-LIF-Datei im Mikroskop-Softwareprogramm, und wählen Sie die Registerkarte Prozess, Prozesswerkzeuge und Zusammenführen aus.
Wählen Sie das erste Bild der Zeitsequenz aus, und klicken Sie zuerst. Wählen Sie das zweite Bild der Zeitsequenz aus, und klicken Sie auf Sekunde. Wählen Sie unter Dimensionen zusammenführen die Option t für die Zeit aus, und klicken Sie dann auf Anwenden.
Es wird eine neue Datei mit zwei Zeitpunkten generiert. Nachdem Sie jede Zeitrafferserie für drei aufeinander folgende Z-Stacks separat verfolgt haben, ziehen Sie den Ordner mit den Zeitrafferbildern auf ImageJ. Wählen Sie die Registerkarte Plugins, Tracking und MtrackJ aus.
Um jede einzelne Zelle zu verfolgen, wählen Sie Hinzufügen aus und klicken Sie zu jedem Zeitpunkt auf jede Zelle. Klicken Sie dann auf Messen, und speichern Sie die Datei, um das Maß der Spuren zu extrahieren. Die Migration einzelner Tumorzellen kann bestimmt werden, indem der Migrationspfad im Laufe der Zeit in verschiedenen xy-Ebenen des Z-Stacks verfolgt und als Prozentsatz der Migrationszellen vor und nach der Biopsie dargestellt wird.
Die Proliferationsrate der Tumorzellen kann auf der Grundlage der Mitg.-D.-H2-markierten Dendra2-Kondensation bei Mitose quantifiziert und als Prozentsatz der Teilzellen vor und nach der Biopsie dargestellt werden. Vergleicht man die Verteilung der Migrationsgeschwindigkeit vor und nach der Biopsie im selben Tumor, so zeigt sich, dass die Anzahl der Wanderzellen nach der Intervention zunimmt, mit einer damit verbundenen Abnahme der Anzahl der langsamen bis nicht wandernden Zellen. Im Durchschnitt pro Tumor wird ein 1,75-facher Anstieg des Prozentsatzes der Wanderzellen beobachtet, wenn eine biopsieähnliche Verletzung durchgeführt wird, im Vergleich zu kontrollierbaren, nichtbiopsied Mäusen.
Obwohl der Anteil der wandernden Tumorzellen schließlich sowohl bei Kontroll- als auch bei biopsied Mäusen abnimmt, weisen biopsied Mäuse immer noch eine höhere Migrationskapazität auf als Kontrollmäuse insgesamt. Tumorzell-proliferatives Verhalten zeigt auch eine 1,52-fache Zunahme der Anzahl der mitotischen Ereignisse bei der Biopsie im Laufe der Zeit, im Vergleich zu nichtbiopsied Kontrollmäusen. Bemerkenswert ist, dass keine Induktion der Tumorzellmigration oder -proliferation nach einem hirnbildenden Fensteraustausch ohne Biopsie beobachtet wird, was darauf hindeutet, dass der Anstieg der Tumorzellproliferation und der Migrationsraten speziell durch die biopsieähnliche Verletzung ausgelöst wird.
Es ist wichtig, mit hoher Präzision und chirurgischen Fähigkeiten während der Schädelbildgebung, Implantation und Ersatzschritte zu arbeiten. Umfangreiche Spractice kann notwendig sein.
