Wir danken Drs.. Alex Gelbard und Willem Overwijk für Beratung in hydrodynamischen Gentransfer. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der NIH (AI098099, SSW), dem MD Anderson Cancer Center for Epigenetik, dem MD Anderson Center for Entzündung und Krebs (SSW) und der RE Bob Smith Education Fund (HSL) unterstützt.

Institutionelle Genehmigung ist im Voraus für alle hier beschriebenen experimentelle Manipulationen an Mäusen gewonnen werden. Diese umfassen die Verwendung von C57BL/6-Mäuse zur Isolierung von Knochenmarksvorläuferzellen, IFNAR - / - Mäusen als Empfänger für die adoptive Übertragung von hämatopoetischen Vorläuferzellen und der Verwendung von CGT für Zytokin-Überexpression in vivo. Entsprechende Gehäuse und Pflege der Tiere muss auch von dem Prüfer oder Institution gestellt werden. Darüber hinaus können institutionelle Zulassung für die in hydrodynamischen Gentransfer (dh rekombinante DNA-Zulassung) verwendeten Plasmide erforderlich. Die hier beschriebenen Untersuchungen wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss bei UT MD Anderson Cancer Center genehmigt. 1. Hydrodynamische Gentransfer (HGT) Dieser Schritt soll 2 Tage vor dem adoptiven Transfer von CDPs herbeigeführt werden, um zirkulierende Flt3L für DC-Expansion in vivo-5. Prepare mindestens 5 Empfänger Mäuse / Gruppe. <ol><li> Um eine effiziente HGT zu erreichen, die Blutgefäße des Empfängers IFNAR - / - sollte Mäusen (CD45.2 +), indem Mäusen zu einer Wärmelampe für 5-10 min erweitert werden. </li><li> Legen Sie die Maus in einem Rückhalteeinrichtung und zu desinfizieren sein Schwanz mit 70% Ethanol. </li><li> Injizieren 5 ug Plasmid kodierend Flt3L in 2 ml sterilem PBS in die Schwanzvene unter Verwendung einer 27 G-Nadel. Für die Steuerung Kohorte injizieren 5 ug leeren Vektor (PORF) über die Schwanzvene wie angegeben. </li><li> Überwachung der Mäuse 15-30 min, um sicherzustellen, gibt es keine nachteiligen Auswirkungen der Injektion in die Schwanzvene. Zurück Mäuse Wohnanlage für 2 Tage. </li></ol> 2. Isolierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen aus Knochenmark der Maus Dieser Schritt sollte 2 Tage nach HGT durchgeführt werden. Verwenden kongenen CD45.1 +-Mäusen als Quelle der Knochenmarkvorläuferzellen für Adoptiv-Transfer in Empfänger IFNAR - /- Tiere (CD45.2 +). In diesem Protokoll werden kongenen Stämmen erforderlich Spender und Empfänger abgeleiteten DCs unterscheiden, sowie Immunverarmung durch MHC-Fehlanpassung zu vermeiden. Ungefähr 10-20 Mäuse werden benötigt, um eine ausreichende Anzahl von hämatopoetischen Vorläuferzellen (10 5 Zellen / Empfängermaus) für die Transferexperimente liefern. <ol><li> Euthanize 10 kongenen CD45.1 + Mäusen durch CO 2-Erstickung und Genickbruch. </li><li> Platzieren Sie jede Karkasse auf einer Dissektion Tablett und sterilisieren Sie den Bauch und Beine mit 70% Ethanol. </li><li> Einen Einschnitt in der Mitte Bauch und Messer durch die Haut aus dem Bauch, um jedes Bein, Schneiden Haut nach unten der Länge des Beines. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Haut von jedem Bein, und schneiden und entfernen Sie die Beine von der Karkasse im Hüftgelenk mit einer scharfen Schere. </li><li> Die Muskeln vorsichtig aus Femur und Tibia von jedem Bein mit einer scharfen Klinge. </li><li> Entfernenbeide Enden des Oberschenkelknochens und des Schienbeins mit einem scharfen Skalpell und legen Knochen in einer Kulturschale mit komplettem RPMI (RPMI mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, 1% Penicillin / Streptomycin, 1 mM Natriumpyruvat und 50 uM β-Mercaptoethanol) . </li><li> Vorbereitung einer Spritze mit 1 ml vollständigem RPMI zu einer 27 G Nadel verbunden. </li><li> Legen Sie die 27 G-Nadel in ein Ende des Oberschenkelknochens oder Tibia. Spülen Sie das Knochenmark aus dem Femur oder Tibia durch leichtes Einspritzen des kompletten RPMI in den Knochen. Stellen Sie sicher, dass Knochenmarkzellen werden aus dem Knochen entfernt, dies kann durch visuelles Erfassen vertrieben Medien, die trüb erscheint geführt werden. </li><li> Wiederholen Spülung jeweils Femur und Tibia 3x gründlich zu entfernen, Knochenmarkszellen. </li><li> Bereiten Sie eine Einzelzellsuspension durch vorsichtiges Pipettieren Zellen nach oben und unten 3-5x in der Kulturschale. </li><li> Entfernen Sie Schmutz, indem die Knochenmarkszellen durch ein 40 uM Zellsieb, indem die Zellen ausgeschieden in eine neue culturE Gericht. Stören keine Zellklumpen, die auf dem Sieb durch sanften Druck mit dem Ende einer sterilen Spritzenkolben angezeigt. </li><li> Lyse der roten Blutzellen (RBC) an der Gesamtknochenmarkzellsuspension mit kommerziellen RBC Lyse-Puffer pro Anweisungen des Herstellers vor. Verwenden 2 ml RBC-Lyse buffer/4-6 x 10 7 Zellen (Zellen aus generell eine Maus) und einer Inkubationszeit von 5 min bei RT. </li><li> Waschen der Knochenmarkzellen durch Pelletieren Zellen durch Zentrifugation für 4 min bei 500 xg, sanft Absaugen des Kulturmediums resuspendiert in 10 ml FACS-Puffer (1 × PBS + 2 mM EDTA + 1% FBS), Pelletierung Zellen durch Zentrifugation und Absaugen von Wasch sanft Puffer. </li><li> Wiederholen des Wasch, wie in Schritt 2.13 beschrieben, für insgesamt 2 Wäschen. </li></ol> 3. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) zu isolieren CDPs Dieser Schritt erfordert Zugang zu einem MidiMACS Zellseparator und MACS LD Spalten für eine anfängliche negative Selektionsverfahren,sowie eine FACS-Maschine mit mindestens 3, um die Mehrfarben-Laser-Vorläufermenge nach Färbung mit fluoreszenz konjugierten Antikörper zu reinigen. <ol><li> Nach dem zweiten Waschen in Schritt 2.14, zählen die Knochenmarkszellen. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation in Schritt 2.13 beschrieben und resuspendieren in FACS-Puffer auf eine Endkonzentration von 4 x 10 7 Zellen pro 30 &amp;mgr; l FACS-Puffer zu erreichen. </li><li> Um Zellen für die FACS vorbereitet werden liniennegativen Zellen zuerst durch eine negative Selektionstechnik, die Linie-positiven Zellen aus dem Knochenmark Mischung mit magnetischen Kügelchen Säulenchromatographie entfernt angereichert. Für die negative Selektionsverfahren, fügen 1 ug jeder der folgenden Handels Ratte-Anti-Maus-Antikörper (Abs), die hämatopoetischen Linie Marker erkennen: CD3, CD19, CD11c, CD11b und Ter-119 Abs. Das ABS ist in einem Volumen von 2 ul / Ab zu den 30 &amp;mgr; l Zellsuspension in FACS-Puffer zugegeben werden. </li><li> Inkubieren der Zellsuspension bei 4 ° C für 30Minute Nach der Inkubation wurden die Zellen werden zweimal mit 10 ml FACS-Puffer, wie in Schritt 2.13 beschrieben. </li><li> Die Zellen in einer Endkonzentration von 4 × 10 7 Zellen/40 &amp;mgr; l FACS-Puffer zu erreichen. In 20 ul Ziege-anti-Ratte-IgG magnetischen Mikrokügelchen pro jeweils 40 ul Zellsuspension. Vorsichtig mischen und Inkubieren bei 4 ° C für 30 min. Waschen der Zellen mit 10 ml FACS-Puffer, wie in Schritt 2.13 beschrieben. </li><li> Resuspendieren bis 10 8 Knochenmarkzellen in 500 &amp;mgr; l FACS-Puffer. </li><li> Legen Sie eine MACS LD Spalte auf eine Zelle MidiMACS Trenn pro Anweisungen des Herstellers und Vorspülen der Säule mit 2 ml FACS-Puffer. </li><li> Gelten die Knochenmarkszellsuspension auf die Säule geladen bis 5 x 10 8 Zellen in 2,5 ml FACS-Puffer. Achten Sie auf eine Sammelröhrchen (15 ml konischen Röhrchen) wird unter der Spalte platziert. Die Säule 3x mit 2 ml FACS-Puffer / Waschanlage, und sammeln Sie die Zellen, die durch die Säule, die angereichert werden vergehenLineage-negativen Zellen. Zählen Sie die Zellen, die in dem Material eluiert (Wash-Through) von der Säule. </li><li> Um eine positive Selektion von hämatopoetischen Vorläufermengen durch FACS zuführen, Flecken Zellen mit dem folgenden fluoreszenz konjugierten Abs: IL-7R (Pacific Blue), Flt3-(PE), Sca-1 (PE.Cy7), CD115 (APC), c-kit (APC.Cy7) Abs, sowie eine Mischung von Linienmarker Abs gegen CD3, CD19, CD11c, CD11b, F4/80 und TER119 (alle mit PerCP Cy5.5 markiert) gerichtet ist. Verwenden 0,5-1 ul jeder Ab in einem Gesamtvolumen von 100 ul. Inkubieren Zellsuspension bei 4 ° C für 20-30 min. </li><li> Waschen der Zellen in einer Konzentration von 2-3 x 10 7 Zellen / ml wie in Schritt 2.13 und resuspendieren in FACS-Puffer angegeben. Filter-Zellen durch ein 35 uM Zellsieb Kappe Rohr Zellklumpen zu entfernen. Dieser letzte Schritt ist entscheidend, um ein Verstopfen zu vermeiden, die FACS-Maschine. </li><li> Legen Sie die Zellsuspension in einem FACS-Röhrchen auf der Bühne und sortieren FACS CDPs (lin - c-kit-lo CD115 + Flt3 +) auf derGrundlage der angegebenen Markerprofil. Sammeln gereinigten Zellen in einem 15 ml Röhrchen mit 5 ml vollständigem RPMI. </li><li> Erfassen die absolute Anzahl der sortierten Zellen am Ende der FACS laufen. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation in Schritt 2.13 und Resuspension in sterilem PBS für die adoptive Transferexperimente gezeigt. </li></ol> 4. Adoptiven Transfer von CDP Dieser Schritt wird typischerweise in der Tierhaltung, wo die Empfänger-Mäuse untergebracht sind, durchgeführt. Abhängig von der Lage des FACS-Maschine kann es Transport der gereinigten Vorläuferzellpopulationen in der Tierhaltung vor adoptive Übertragung beinhalten. Vorläuferzellsuspensionen sollten steril gehalten und auf Eis transportiert werden. <ol><li> Zellsuspensionen herzustellen Injektions durch Verdünnen von 10 5 gereinigte CDPs in einem Gesamtvolumen von 100 &amp;mgr; l steriler PBS. Zeigen Zellsuspension in einer Spritze zu einer 27 G Nadel. </li><li> Setzen Sie die Empfänger IFNAR - / - </sup&gt; Mäuse (CD45.2 +) zu einer Wärmelampe für 5-10 min auf effiziente Injektion über die Schwanzvene zu erreichen. </li><li> Legen Sie die Maus in einem Rückhalteeinrichtung und zu desinfizieren sein Schwanz mit 70% Ethanol. </li><li> Inject 10 5 FACS-gereinigte CDPs in 100 ul PBS in die Schwanzvene mit einer 27 G-Nadel. </li><li> Überwachung der Mäuse 15-30 min, um sicherzustellen, gibt es keine nachteiligen Auswirkungen der Injektion in die Schwanzvene. Zurück Mäusen zu Wohnmöglichkeiten. </li></ol> 5. Isolierung von PP und Messung der pDC Beträge <ol><li> Bei 7-10 Tage nach Adoptivtransfer, einschläfern die Empfängermäuse. Öffnen Sie vorsichtig die Maus durch Dissektion und setzen den Darm. </li><li> Entfernen Sie den gesamten Darm und legen Sie es auf PBS-getränkten Papierhandtücher. Sammeln Sie alle sichtbar PPs entlang der Wand des Dünndarms mit einer feinen Pinzette und Schere. C57BL6 und IFNAR - / - Mäuse haben in der Regel 5-10 PP / Maus, die sich von isolierten lymphatischen Follikel gefunden werden, sindentlang des Dünndarms 18. Beachten Sie, dass die PPs sind oft strukturell sogar innerhalb einer einzigen Maus, so sorgfältig sicherzustellen, dass alle PPs werden identifiziert und seziert. </li><li> Zeigen PPs in eine Petrischale mit PBS, und verwenden Pinzette Kot zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal zu reinigen PPs. </li><li> Digest PPs mit 1 mg / ml Collagenase IV in 10 ml 1x Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) in einem 50-ml-Kolben unter kräftigem Rühren für 1 h bei 37 ° C. </li><li> Legen Sie das verdaut PP im oberen Fach eines 40 um Zellsieb und Kraftzellen durch Sieb mit einer sterilen Spritzenkolben. Sammeln Sie die PP-Zellsuspension in einem 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Pellet gespannten PP Zellen durch Zentrifugation bei 500 xg für 5 Minuten und Resuspendieren in 6 ml 37% Percoll-Lösung (37% Percoll in RPMI Medium). Sanft Ort 6 ml 70% Percoll-Lösung (70% Percoll in RPMI-Medium) unterhalb der Zellsuspension, um eine Percoll Stufengradienten bilden. </li><li> Zentrifuge Zellen für 20 min einT 800 xg mit der Zentrifugen abbrechen. Mononuklearen Zellen werden dem 37/70%-Schnittstelle migrieren. Nach der Zentrifugation sollte die einkernigen Zellpopulation durch Pipettieren vorsichtig an der Schnittstelle Region gesammelt werden. Pellet durch Zentrifugation gesammelt und zweimal waschen Zellen in 50 ml RPMI / Waschgang. Ein großes Volumen wird verwendet, um die vollständige Entfernung Percoll gewährleisten. </li><li> Färben Sie die gesammelten PP-Zellen mit den folgenden Antikörpern gegen murine pDCs, die von den adoptiv übertragen Vorfahren (CD45.1 +) oder Empfängermäusen (CD45.2 +) ableiten zu erkennen: CD45.1 (APC.Cy7), CD45.2 (PE . Cy7), CD11c (Pacific Blue), CD11b (PerCP Cy5.5), B220 (APC), Siglec-H (PE) und PDCA-1 (FITC) Abs. Führen Durchflusszytometrie Analyse der PP-Zellen wie in den Schritten 3.9 und 3.10 angegeben. Identifizieren pDCs durch ihre CD11c + CD11b - B220 + Siglec-H + PDCA-1 +-Phänotyp. PDCs% x: Absolute pDC Zahlen können durch die folgende Gleichung bestimmt werdental PP-Zellzahl = PP pDCs. </li></ol>

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Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die beschriebene Adoptivtransfertechnik hier beurteilt den Beitrag der CDP auf die PP pDC Bevölkerung in Empfängermäuse, die einen Mangel an PP pDCs sind (zB IFNAR - / - Mäuse). In zukünftigen Experimenten wird es wichtig sein, das Potenzial der anderen Vorläuferuntermengen bei der Erzeugung von PP pDCs bewerten, insbesondere darüber, ob PP pDCs von Flt3 + CLP abzuleiten. Diese Frage ist von Bedeutung, da es unklar bleibt, warum PP pDCs sind eindeutig empfindlich auf IFNAR-STAT1 Sig...

Hier zeigen wir ein Protokoll zu prüfen, ob gemeinsame dendritischen Vorläuferzellen (CDP) sind in der Lage, aus der die plasmazytoiden dendritischen Zellen (PDC) Bevölkerung in Peyer-Plaques (PP). Das übergeordnete Ziel der Verwendung dieser Methode war es, die Entwicklungsregulation von pDCs in Peyer-Plaques (PP pDCs) zu bewerten. Der Grund, warum dies wichtig ist, dass PP pDCs unterscheiden sich von pDCs in anderen Geweben, wie Knochenmark, Blut und Milz gefunden, und daher ist es unklar, ob PP pDCs pDC und andere Populationen sind entwicklungspolitisch und / oder funktionell verwandten. Insbesondere werden häufig für pDCs wobei der Haupt Typ I Interferon (IFN) Produzenten innerhalb der blutbildenden Systems, der Reaktion auf Toll-like Rezeptor 7 und 9 (TLR7 / 9) Stimulation durch schnelle IFN-Sekretion 3.1 bekannt. Allerdings sind PP pDCs mangelhaft in der Herstellung von Typ I IFN Antwort auf TLR-Agonisten-Stimulation 4,5. Darüber hinaus PP pDCs auch aus pDCs im Knochenmark und Milz gefunden unterscheidenSignale vom Typ I erfordert Interferon (IFN)-Rezeptor (IFNAR1) oder der IFN-Signalmolekül STAT1 für ihre Entwicklung und / oder Akkumulation 5. Diese Daten haben die Möglichkeit, dass verschiedene Regulationsmechanismen steuern PP pDCs gegen pDCs in anderen Organen (zB Knochenmark, Milz) 5 vorgeschlagen. Die Gründe, die zur Entwicklung dieser Methode führte, wurde über die jüngsten Fortschritte im Verständnis von dendritischen Zellen (DC)-Biologie. Die meisten, wenn nicht alle, abzuleiten DC Subsets von hämatopoetischen Vorläuferzellen, die das FMS-ähnliche Tyrosinkinase 3-Rezeptor (Flt3) 6-10 exprimieren, allerdings wird die DC-Entwicklung nicht zu den klassischen myeloiden und lymphoiden Wege beschränkt. Zum Beispiel Flt3 + gemeinsamen myeloischen Vorläuferzellen (CMPs, lin - IL-7R - Sca-1 - c-kit + CD34 + FcyR lo / -) Anlass zu CDPs (lin - c-kit + Flt3 lo CD115 +), which weiter zu differenzieren in pDCs und konventionelle DCs (cDCs) 9,10. Dagegen Flt3 + gemeinsamen lymphatischen Vorläuferzellen (CLP, lin - IL-7R + Sca-1 lo lo c-kit) entwickeln in erster Linie in pDCs 11. Deshalb vor pDCs Studien zeigen, ergeben sich aus mindestens 2 verschiedene hämatopoetische Vorläuferpopulationen unter der Regulierung der Flt3L, obwohl der typische Analyse wurde dem Knochenmark, Milz und / oder Blut pDC Teilmengen eingeschränkt. Somit ist die Vorläufer-Population (n), PP pDCs erzeugt Untersuchung erforderlich. Das Verständnis der Ursprünge der PP pDCs wird Licht auf, ob sie gemeinsame Entwicklungswege mit anderen Populationen pDC Schuppen, oder nutzen verschiedene Mechanismen während ihrer Generation in PP. Ein einzigartiger Vorteil des hier beschriebenen Ansatz ist die Verwendung von Mäusen, die einen schweren Mangel im PP pDCs als Empfänger für den adoptiven Transfer von hämatopoetischen Vorläuferzellen zeigen. Mäuse, die mit Gen-tic Deletion im Gen für IFNAR1 (IFNAR - / - Mäuse) oder STAT1 (Stat1 - / -) zeigte eine auffallende Abbau in PP pDCs 5. Daher sind diese Stämme eine Umgebung, in der PP pDCs reduziert werden, so dass die adoptive Übertragung Studien, in Abwesenheit von starken Zellablation Regime wie letalen Bestrahlung durchgeführt werden. Eine zusätzliche Festigkeit des hier vorgestellten Verfahrens ist die Verwendung von hydrodynamischen Gentransfer (HGT) erhöhten zirkulierenden Mengen an Flt3L stimulieren. Dies bietet eine kostengünstige Möglichkeit der Flt3L in vivo zu induzieren, gegen Injektion von rekombinanten Proteins. Zahlreiche Studien, einschließlich der in unserem Labor haben HGT verwendet, um Cytokin-Mengen in einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen 5,12,13 induzieren. Die Arbeitsteilung und präzise Immunfunktionen für DCs ist von großem Interesse in der Immunologie. Insbesondere pDCs sind wichtige Mediatoren der oralen Toleranz und systemischen antiviralenReaktionen, aber sie scheinen auch an der Entstehung und Aufrechterhaltung von Autoimmunität und Krebs 14-17 beitragen. Die hier beschriebene Protokoll ermöglicht es den Entwicklungsmechanismen Regel PP pDCs zu mehr vollständig erforscht. Darüber hinaus kann dieses Konzept ermöglichen Studien PP PDC-Funktion zu beurteilen und kann zum Verständnis der Regulation und Funktion von anderen Immun Populationen innerhalb PPs erweitert werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="867">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">C57BL/6J</td>
			<td style="width:201px;">JAX</td>
			<td style="width:177px;">664</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">B6.SJL</td>
			<td style="width:201px;">JAX</td>
			<td style="width:177px;">2014</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RPMI</td>
			<td style="width:201px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:177px;">11875-093</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">15 ml conical tubes</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">352095</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">50 ml conical tubes</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">352070</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Sterile surgical tweezers</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Sterile small pair scissors</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Sterile large pair scissors</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">40 &#956;m cell strainer</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">352340</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">35 &#956;m cell strainer cap tubes</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">352235</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RBC lysing buffer</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">R7757</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:260px;">FACS buffer</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;">PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, filter sterilized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Percoll</td>
			<td style="width:201px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:177px;">17089102</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">10XHBSS</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">H4641</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:201px;">Worthington</td>
			<td style="width:177px;">LS004188</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Goat ant-rat IgG microbeads</td>
			<td style="width:201px;">Milteyni Biotec</td>
			<td style="width:177px;">130-048-501</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">LD column</td>
			<td style="width:201px;">Milteyni Biotec</td>
			<td style="width:177px;">130-042-901</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Rat anti-D3</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">555273</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Rat anti-CD19</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">553783</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Rat anti-CD11b</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">553308</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Rat anti-CD11c</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">553799</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Rat anti-Ter119</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">553671</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD3 (PerCP)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">45-0031</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD19 (PerCP)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">45-0193</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD11b (PerCP)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">45-0112</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD11c (PerCP)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">45-0114</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-F4/80 (PerCP)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">45-4801</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-Ter119 (PerCP)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">45-5921</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-Sca-1 (PE.Cy7)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">25-5981</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD115 (APC)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">17-1152</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-c-kit (APC.Cy7)&#160;</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">47-1171</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-IL-7R (Pacific Blue)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">48-1271</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-Flt3 (PE)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">12-1351</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD45.1 (APC.Cy7)</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">560579</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD45.2 (PE.Cy7)</td>
			<td style="width:201px;">Biolegend</td>
			<td style="width:177px;">109830</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD11c (Pacific Blue)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">48-0114</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-B220 (APC)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">25-0452</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-Siglec-H (PE)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">12-0333</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-PDCA-1 (FITC)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">Nov-72</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Cell sorter</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;">e.g. BD Fortessa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Heat lamp</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Mouse restrainer</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">1 ml syringes</td>
			<td style="width:201px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:177px;">309602</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">27&#189; G needles (sterile)</td>
			<td style="width:201px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:177px;">305109</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the development of murine plasmacytoid dendritic cells in peyer's patches using adoptive transfer of hematopoietic progenitors

Dieses Protokoll Details eine Methode, um die Fähigkeit der gereinigten hämatopoetischen Vorläuferzellen zu plasmazytoiden dendritischen Zellen (PDC) in Darm-Peyer-Plaques (PP) zu erzeugen, zu analysieren. Gemeinsame dendritischen Zellvorläuferzellen (CDPs, lin - c-kit lo CD115 + Flt3 +) wurden aus dem Knochenmark der C57BL/6-Mäuse durch FACS gereinigt und Empfängermäuse, die einen wesentlichen pDC Bevölkerung PP fehlt übertragen, in diesem Fall, IFNAR - / - Mäuse wurden als die Transferempfänger verwendet. In einigen Mäusen wurde die Überexpression der dendritischen Zellwachstumsfaktor Flt3-Ligand (Flt3L) vor der Übertragung von CDPs Adoptivdurchgesetzt, mit hydrodynamischen Gentransfer (HGT) von Flt3L-kodierenden Plasmid. Flt3L Überexpression erweitert DC-Populationen aus übertragen (oder endogenen) hämatopoetischen Vorläuferzellen stammen. Bei 7-10 Tage nach der Vorläufer Transfer wurden pDCs, die von den adoptiv übertragen entstehen aus Vorläuferzellen auf die Empfängerzellen unterschiedenGrundlage der Marker CD45 Expression mit pDCs aus übertragen CDPs als CD45.1 + und CD45.2 + als Empfänger. Die Fähigkeit der CDPs übertragen, um die Bevölkerung in pDC PP zu fördern und an Flt3L reagieren wurde mittels Durchflusszytometrie von PP-Einzelzellsuspensionen aus Empfängermäusen ausgewertet. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um zu testen, ob andere Vorläuferpopulationen der Lage ist, PP pDCs. Darüber hinaus könnte dieser Ansatz verwendet, um die Rolle von Faktoren, die voraussichtlich pDC Entwicklung PP beeinflussen, indem Vorläuferuntermengen mit einem geeigneten Zuschlags, KO oder Überexpression des mutmaßlichen Entwicklungsfaktor und / oder durch Manipulation einer zirkulierenden Cytokine über HGT untersuchen . Dieses Verfahren kann auch die eine Analyse der, wie PP pDCs beeinflussen die Frequenz oder die Funktion anderer Immunteilmengen in PPs. Ein einzigartiges Merkmal dieser Methode ist die Verwendung von IFNAR - / - Mäusen, die stark dezimiert pDCs PP im Vergleich zu Wildtyp-Tieren, so allowi zeigenng Rekonstitution von PP pDCs in Abwesenheit von Störfaktoren Effekte aus tödlichen Bestrahlung.

Unsere Ergebnisse zeigen die Gating-Strategie zur Isolierung von CDPs aus Mausknochenmarkszellen (Abbildung 1), in den Protokollen 2 und 3 beschrieben. CDPs enthalten etwa 0,1% des gesamten Knochenmarkzellen und etwa 4-6 x 10 4 CDPs kann von einer Maus isoliert werden. Bei Adoptivtransfer, unterscheiden CDPs in pDCs und cDCs 10. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51189/51189fig1highre...

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Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer&#039;s Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Dieses Protokoll beschreibt experimentelle Verfahren, die die Differenzierung von dendritischen Zellen in plasmazytoiden Peyer-Plaques aus gemeinsamen dendritischen Vorläuferzellen zu bewerten, mit Hilfe von Techniken mit FACS-vermittelten Zellisolierung, hydrodynamische Gentransfer und Flow-Analyse von Immunteilmengen in Peyer-Plaques.

Die Beurteilung der Entwicklung der Murine Plasmazytoide dendritischen Zellen in Peyer-Patches mit Adoptiv Übertragung von hämatopoetischen Vorläuferzellen

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

assessing-development-murine-plasmacytoid-dendritic-cells-peyer-s

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

11.1K Aufrufe.  The University of Texas MD Anderson Cancer Center.  Dieses Protokoll beschreibt experimentelle Verfahren, die die Differenzierung von dendritischen Zellen in plasmazytoiden Peyer-Plaques aus gemeinsamen dendritischen Vorläuferzellen zu bewerten, mit Hilfe von Techniken mit FACS-vermittelten Zellisolierung, hydrodynamische Gentransfer und Flow-Analyse von Immunteilmengen in Peyer-Plaques. 

Serie: Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into mouse tail veins and colonize in the lungs, thereby, resembling the last steps of tumor cell spontaneous metastasis: survival in the circulation, extravasation and colonization in the distal organs. From a therapeutic point of view, the experimental metastasis model is the simplest and ideal model since the target of therapies is often the end point of metastasis: established metastatic tumor in the distal organ. In this model, tumor cells are injected i.v into mouse tail veins and allowed to colonize and grow in the lungs. Tumor-specific CTLs are then injected i.v into the metastases-bearing mouse. The number and size of the lung metastases can be controlled by the number of tumor cells to be injected and the time of tumor growth. Therefore, various stages of metastasis, from minimal metastasis to extensive metastasis, can be modeled. Lung metastases are analyzed by inflation with ink, thus allowing easier visual observation and quantification.

An experimental lung metastasis and CTL immunotherapy mouse model for analysis of tumor cells-T cell interaction in vivo.

Experimentelle Metastasierung und CTL adoptiven Transfer Immuntherapie Maus-Modell

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Peyer's patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and homeostasis. Particulate antigens and microbes in the intestinal lumen are continuously sampled by PP M cells in the follicle-associated epithelium (FAE) and transported to an underlying network of dendritic cells (DCs), macrophages, and lymphocytes. In this article, we describe protocols in which murine PPs are (i) dissociated into single cell suspensions and subjected to flow cytometry and (ii) prepared for cryosectioning and immunostaining. For flow cytometry, PPs are mechanically dissociated and then filtered through 70 &mu;m membranes to generate single cell suspensions free of epithelial cells and large debris. Starting with 20-25 PPs (from four mice), this quick and reproducible method yields a population of &gt;2.5 x 106 cells with &gt;90% cell viability. For cryosectioning, freshly isolated PPs are immersed in Optimal Cutting Temperature (OCT) medium, snap-frozen in liquid nitrogen, and then sectioned using a cryomicrotome. Tissue sections (5-12 &mu;m) are air-dried, fixed with acetone or methanol, and then subjected to immunolabeling.

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer&#039;s Patches

There is an increasing interest in understanding the immunological functions of specific subpopulations of cells in Peyer's patches (PPs), the primary inductive sites of gut-associated lymphoid tissues. Here we outline parallel protocols for preparing PP single cell preparations for flow cytometric analysis and PP cryosections for immunostaining.

Isolierung und Immunfärbung Lymphozyten und dendritische Zellen aus Murine Peyer-Plaques

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of human Type 1 diabetes (T1D). Cell transfer studies in irradiated recipient mice have established that T cells are pivotal in T1D pathogenesis in this model. We describe herein a simple method to rapidly induce T1D by adoptive transfer of purified, primary CD4+ T cells from pre-diabetic NOD mice transgenic for the islet-specific T cell receptor (TCR) BDC2.5 into NOD.SCID recipient mice. The major advantages of this technique are that isolation and adoptive transfer of diabetogenic T cells can be completed within the same day, irradiation of the recipients is not required, and a high incidence of T1D is elicited within 2 weeks after T cell transfer. Thus, studies of pathogenesis and therapeutic interventions in T1D can proceed at a faster rate than with methods that rely on heterogenous T cell populations or clones derived from diabetic NOD mice.

We provide a reproducible method to induce type 1 diabetes (T1D) in mice within two weeks by the adoptive transfer of islet antigen-specific, primary CD4+ T cells.

Accelerated Typ 1 Diabetes Induktion in Mäusen durch adoptiven Transfer von CD4 + T diabetogene Cells

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

Beurteilung der Innate Sensing von HIV-1-infizierten CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zellen durch Plasmazytoide Dendritische Zellen unter Verwendung eines<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Co-Kultursystem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Die Induktion von Murine Darmentzündungen durch adoptiven Transfer von Effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoch</sup&gt; T-Zellen in immundefizienten Mäusen

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during inflammatory responses. Unfortunately, study of pDC function is hindered by their low frequency in lymphoid organs, and existing methods for in vitro DC generation predominantly favor the production of cDCs over pDCs. Here we present a unique approach to efficiently generate pDCs from common lymphoid progenitors (CLPs) in vitro. Specifically, the protocol described details how to purify CLPs from bone marrow and generate pDCs by coculturing with &#947;-irradiated AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand. A unique characteristic of this culture system is that the CLPs migrate underneath the AC-6 cells and become cobblestone area-forming cells, a critical step for expanding pDCs. Morphologically distinct DCs, namely pDCs and cDCs, were generated after approximately 2 weeks with a composition of 70-90% pDCs under optimal conditions. Typically, the number of pDCs generated by this method is roughly 100-fold of the number of CLPs seeded. Therefore, this is a novel system with which to robustly generate the large numbers of pDCs required to facilitate further studies into the development and function of these cells.

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

In-vitro-Erzeugung von Murine Plasmazytoide dendritischen Zellen aus Lymphoid Gemeinsame Vorläufern mit der AC-6-Feeder-System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Reinigung von Plasmazytoide dendritischer Zellen aus dem Knochenmark der Maus

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

Erzeugung einer großen Zahl von myeloischen Vorläuferzellen und dendritischen Zellen Vorstufen aus murinen Knochenmark mit einer neuartigen Zelle Sortieren Strategie

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

Entwicklung und Validierung eines empfindsamen Einzelmolekül Array digitale Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay für menschliche Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce efficient therapies have been proposed over the last decade. Among the promising candidates for designing novel therapeutic strategies, cellular immunotherapies have been targeted to eliminate highly invasive and chemo-radioresistant tumor cells, likely involved in a rapid and fatal relapse of this cancer. Thus, administration(s) of allogeneic GBM-reactive immune cell effectors, such as human V&#978;9V&#948;2 T lymphocytes, in the vicinity of the tumor would represents a unique opportunity to deliver efficient and highly concentrated therapeutic agents directly into the site of brain malignancies. Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a preclinical proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of these cellular immunotherapies that rely on stereotactic injections of allogeneic human lymphocytes within intrabrain tumor beds.

Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of intrabrain-delivered cellular immunotherapies.

Stereotaktische Adoptiv Übertragung von zytotoxischen Immunzellen in murinen Modellen der Orthotopen Human Glioblastoma Multiforme Xenotransplantate

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...