Wir danken Renjie Song (Wadsworth Zentrum Durchflusszytometrie Core) für die Unterstützung bei Zellanalyse und Helen Johnson (Wadsworth Zentrum Tier Histopathologie Core) für die Herstellung von Paraffinschnitten. Wir danken Dr. Richard A. Cole (Wadsworth Zentrum Light Microscopy Core) für die Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie und Bild-Sammlung. Wir möchten Andy Bentley (Wadsworth Center Foto und Illustration) für die Unterstützung mit Animationen zu bestätigen. MDJ wird von der Life Sciences Research Foundation, Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Fellowship unterstützt. SA wird von einem Wadsworth Center-Health Research Inc. intramuralen Postdoc-Stipendium unterstützt. Diese Arbeit wurde zum Teil durch NIH Zuschüsse HD061916 und GM082978 unterstützt.

Die Tiere wurden unter konventionellen, specific pathogen-freien Bedingungen untergebracht und wurden in voller Übereinstimmung mit Institutional Tier des Wadsworth Center Care und Use Committee (IACUC) Richtlinien behandelt. Ein. Schlundsonde <ol><li> (Optional) Gavage Mausstamm der Wahl mit Antigen oder Mikroben von Interesse mit einem 22 G x1.5-in. blunt-end Fütterung Nadel (Popper Scientific, New Hyde Park, NY). Liefermengen nicht überschreiten sollte 400 ul pro Maus. </li></ol> 2. Isolierung von PP Cells für die Durchflusszytometrie <ol><li> Einschläfern Mäuse durch CO 2 Ersticken nach institutionellen Pflege der Tiere und die Nutzung Ausschuss (IACUC) Richtlinien. </li><li> Reinigen Sie die Bauch mit 70% Ethanol oder betadine vor der Operation. Durchführen einer Standard-Laparotomie, die einen einzelnen (1 cm) unter Verwendung chirurgischer Qualität Einschnitt Scheren entlang der Mittellinie Anfang etwa 1,5 cm von der Basis der dem Brustkorb verbunden ist. Setzen Sie das proitoneal Hohlraum und Identifizierung der Blinddarm. Snip das Terminal Dünndarm bei der Ileum-cecal Kreuzung und entfernen Sie vorsichtig den Darm in seiner Gesamtheit. Darauf, nicht das Darmgewebe überstreckt, während es aus der Bauchhöhle entfernt wird. </li><li> Legen Sie den Dünndarm auf einem Bett aus feuchtem Küchenpapier oder Kimwipes. Befeuchten Sie den Dünndarm vorsichtig mit Kochsalzlösung, um Gewebe Austrocknung zu verhindern. Visuell identifizieren einzelnen PPs auf die anti-mesenterialen Seite des Darms (Abbildung 1). Typischerweise hat ein einziges Maus 5 zu 10 sichtbaren PPs die gleichmäßig aus dem Duodenum (proximal) an Ileum (distalen) verteilt. Im Durchschnitt werden vier Mäuse Ausbeute 23 PPs. </li><li> Mit gebogenen chirurgischen Schere vorsichtig Verbrauchsteuern einzelnen PPs und legen Sie sie in Balanced Salt kalten Hanks Solution (HBSS). Hinweis, sollte die Schere curve-Seite platziert werden bis knapp oberhalb der PP und dann sanft auf das Gewebe aufgebracht. Excise nur die PP (nicht umlieng Gewebe) und Transfer zum kaltem HBSS. Hinweis: Alle Inkubationen und Zentrifugationsschritte ab diesem Zeitpunkt in Abschnitt 2 bei 4 erfolgen ° C, um die Zellviabilität zu bewahren. </li><li> Übertragen PPs in 5 ml Spleen Dissoziation Medium und Inkubation für 15-20 min bei 37 ° C unter kräftigem Schütteln bei 250 Umdrehungen pro Minute. Längere Inkubationszeit wird sich negativ auf die Lebensfähigkeit der Zellen. </li><li> Um eine einzelne Zellsuspension, erfolgt PPs auf einem sterilen (autoklaviert) 70 um Nylonnetz Zellsieb erzeugen und zwangsweise mahlen das Gewebe in das Netz mit Hilfe der Basis eines Kolbens aus einem 1 ml-Spritze. Alternativ Sandwich PPs zwischen zwei frosted sterile Objektträger aus Glas (autoklaviert in Umschläge) und schonend zu mahlen Geweben mit einer hin-und herbewegt. Verwenden Sie eine sterile Pipette, um die Zellsuspension in ein 5 ml-Falcon-Röhrchen übertragen. </li><li> Hinzufügen EDTA bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zu der Zellsuspension. Inkubieren auf einer Wippe5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Dekantieren Zellsuspension durch einen zweiten 70 um Zellsieb zu entfernen alle verbleibenden zellulären Aggregaten oder Gewebereste. Sammeln Sie Zellen in einer 15 oder 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Betreff Zellen sanfte Zentrifugation (5 min bei 500 xg). Dekantieren Überstand und resuspendieren Zellen in Strömungsrichtung Puffer, der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 1% fötalem Kälberserum (FCS) ist. </li><li> Um die Zellzahl und Lebensfähigkeit zu bestimmen, zu verdünnen Zellen 01.10 in Trypanblau und Sichtprüfung Zellen mit einem Lichtmikroskop und ein Hämozytometer. Alternativ kann ein Gräfin Zellenzähler (Invitrogen) oder ein ähnliches Instrument verwendet, um automatisch aufzuzählen Zellzahlen und Lebensfähigkeit werden. Beginnend mit 20-25 PPs, sollte dieses Protokoll Ausbeute&gt; 2,5 x 10 6 Zellen insgesamt. Dies entspricht ~ 0,8-1,2 x 10 6 Zellen pro Maus. </li></ol> Antibody Labeling der Zellen für die Durchflusszytometrie &lt;ol start = &quot;11&quot;&gt; <li> Verzichten Zellen (10 5 pro Vertiefung) in die Vertiefungen einer 96-well Rundboden Platten. </li><li> Betreff Platte sanfte Zentrifugation (5 min bei 1.000 xg) und dekantieren durch vorsichtiges Umdrehen der Platte. </li><li> Die Zellen in Fc Blockpuffer und inkubieren auf Eis für 15 min. Zwar gibt es eine Anzahl von kommerziell erhältlichen Fc Blockpuffer (zB Ratten-Anti-Maus-CD16/CD32, BD Biosciences) sind, verwenden wir einfach verbrauchte Medium aus einer Ratten-B-Zell-Hybridom (ATCC 2.4.G2), die einen monoklonalen IgG 1 absondert gegen murine Fcy-Rezeptoren für diesen Schritt. </li><li> Betreff Platte sanfte Zentrifugation (5 min bei 1.000 xg) wie oben, und dekantieren Überstand durch vorsichtiges Umdrehen der Platte. </li><li> Hinzufügen fluorophorkonjugierten Antikörper direkt an Zellsuspensionen an gewünschten Verdünnung und Inkubation auf Eis für 30 min unter ständigem Schaukelstuhl. </li><li> Betreff Platte sanfte Zentrifugation (5 min bei 1.000 xg), und dekantierenÜberstand durch vorsichtiges Umdrehen der Platte. </li><li> Waschen der Zellen mit 100 ul Flusspuffer. </li><li> Zentrifuge Platte bei 1.000 xg für 5 min und dekantieren durch vorsichtiges Umdrehen der Platte. </li><li> Die Zellen 400 ul Fixation Puffer, der von 300 ul der Strömung Puffer und 100 ul 1% Paraformaldehyd in PHEM Puffer (60 mM PIPES, 25 mM HEPES, 10 mM EGTA, 4 mM MgCl 2 bei pH 6) besteht. </li><li> Gegenstand Zellen Durchflusszytometrie unter Verwendung eines FACSCalibur oder gleichwertig. Analyse der Ergebnisse mit Cell Quest Pro Software Version 5.2. </li></ol> 3. Herstellung von PP Kryoschnitte <ol><li> Im Vorfeld des Gewebes Sammlung hinzuzufügen Optimal Cutting Temperature (OCT)-Verbindung zu 7x7x5 mm Kunststoff-Basis Formen. Bereiten auch einen Pool von flüssigem Stickstoff (&gt; 750 ml) in einem Dewar oder Eiskübel. </li><li> Euthanize Maus und führen eine laparotamy, wie oben beschrieben. Entfernen Darm und auf feuchten Papiertüchern. </li><li> Aufisolieren PPs für cyrosectioning, schneiden 0,5 cm quer Segmenten des Dünndarms mit einer einzigen PP und Transfer Gewebe bis zu einer Petrischale mit PBS. Vorsichtig spülen Lumen dieser Segmente mit PBS, um unerwünschte fäkale Verschmutzungen zu entfernen. </li><li> Zeigen Darmgewebe Segmente vertikal innerhalb Bodenformen enthalten Oktober Tauchen der Formen in flüssigem Stickstoff und erlauben Gewebe vollständig zu erstarren (1-2 min). Die Farbe des OCT wird von klar bis weiß wechseln, wenn das Gewebe vollständig gefroren ist. Für eine allmähliche Abkühlung (z. B. zu reduzieren Rissbildung des OCT), Hinweis tauchen Form in einem Bad von Isopentan mit flüssigem Stickstoff Dämpfe gekühlt:. Tragen Sie geeignete Schutzbrille bei der Arbeit mit flüssigem Stickstoff. </li><li> Entfernen gefroren Bodenform aus dem flüssigen Stickstoff mit einer Pinzette und erlauben die Form bei Raumtemperatur gerade lang genug ist (~ 10-15 sec) erwärmen, damit sich die Ränder der OCT-Block zu erweichen. Um dann den gefrorenen Block Oktober ausdie Form, Invertzucker der Form und drücken Sie sanft auf den Rücken, um den Block auf ein sauberes 4 x 4 cm Stück Aluminiumfolie auszuwerfen. Unmittelbar wickeln Sie das Gewebe in der Folie und in einer markierten Probe Tasche in flüssigem Stickstoff oder mit Trockeneis gelagert. Alternativ zu übertragen Gewebe in einem Gefrierschrank (&lt;-20 ° C). Verwenden Sie das Gewebe innerhalb einer Woche, sonst werden die Blöcke spröde mit dem Alter. </li></ol> Kryoschneiden <ol start="6"><li> Kryoschnitt das Gewebe mit Hilfe eines Leica CM3050S cryomicrotome oder gleichwertig. Die Kammer Temperatur auf der Kryostat sollte bis -21 ° C eingestellt werden </li><li> Bemühen Sie sich um Abschnitte, die 12-14 um dick sind. </li><li> Sammeln Sie Schnitte auf Fisher SuperFrost Plus (oder gleichwertig) Objektträger aus Glas und Sichtprüfung mit einem Standard-Lichtmikroskop geringer Stärke. Wenn mehrere Abschnitte auf einer Folie gesammelt werden, sicherzustellen, dass sie gemeinsam für nachgeschaltete Färbung Anwendungen geclustert. </li><li> Shop trutscht er bei Raumtemperatur in einer Diashow box und im Idealfall nutzen sie innerhalb von ein paar Tagen. </li></ol> Antibody Labeling der Kryoschnitte und konfokale Mikroskopie Analyse <ol start="10"><li> Objektträger in Aceton (oder Methanol) in Gewebefärbung jar oder Racks für 2 min. Längerer Inkubation kann Gewebe vom Schlitten zu lösen. </li><li> Übertragen Folien neue Küvette überführen und 3 x waschen mit PBS-T (1X PBS mit 0,05% Tween-20) für 3 min je. </li><li> Umkreisen Sie die Abschnitte mit einem ImmEdge hydrophoben Stift. Dadurch wird sichergestellt, daß Reagenzien und Antikörper zu diesem Bereich werden während Inkubationen beschränkt bleiben. </li><li> Die Objektträger in Blockpuffer (2% Ziegenserum in PBS) für 30 min bei 37 ° C in einer feuchten Kammer, vor Licht geschützt. </li><li> Die Objektträger mit Fc-Block-Puffer (siehe oben) für 10 min bei 37 ° C. </li><li> Dip Slides in PBS-T und trocken Gegend um Abschnitte mit Kimwipes oder andere saugfähige Gewebe.Achten Sie darauf, die tatsächlichen Gewebeschnitten berühren. </li><li> Overlay Gewebeschnitte mit primärer Antikörperlösung, Inkubation 30 min bei 37 ° C in einer befeuchteten Kammer. Primärantikörper wird typischerweise in Blockpuffer zu einer Endkonzentration von 20 ug / ml verdünnt. Die Verwendung von direkt-markierten primären Antikörper ist wünschenswert, da so viele wie drei Antikörper auch direkt bei diesem Schritt kombiniert werden. Direkt-markierten Antikörpern auch die Notwendigkeit für zusätzliche Antikörperinkubation Schritte. </li><li> Waschen Sie die Slides 3 mal (5 min jeweils) durch Eintauchen in PBS. </li><li> Falls erforderlich, inkubieren mit relevanten Sekundärantikörper für 30 min bei 37 ° C in einer feuchten Kammer. </li><li> Waschen Sie die Slides 3 mal (5 min jeweils) durch Eintauchen in PBS. </li><li> Die Objektträger 4 min in 1% Paraformaldehyd in PHEM Puffer, wie oben beschrieben. </li><li> Objektträger mit PBS für 1 min. </li><li> Dry Umgebung Abschnitte mit Kimwipes oder andere absorbierenent Gewebe. Achten Sie darauf, die tatsächlichen Gewebeschnitten berühren. Mit einer Pipette oder Pipette vorsichtig einen Tropfen verlängern Gold-Eindeckmedium direkt auf den Abschnitt. Tragen Sie eine Deckglas auf dem Eindeckmedium kümmern, um Blasen zu vermeiden. Verwenden Löschpapier, um überschüssiges Eindeckmedium absorbieren. </li><li> Seal Deckgläsern auf Objektträger mit kommerziellen Nagellack und an der Luft trocknen. </li><li> Anzeigen Dias mit einem Leica TCS SP5 oder gleichwertig konfokalen Mikroskop. </li></ol>

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	<li>Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+IgA's+complex+roles+in+immunity+and+mucosal+homeostasis+in+the+gut.">Secretory IgA's complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut.</a> Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).</li><li>Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaboration+of+epithelial+cells+with+organized+mucosal+lymphoid+tissue.">Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue.</a> Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).</li><li>Rescigno, M., Sabatino, A. D. i. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+intestinal+homeostasis+and+disease.">Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease.</a> J. Clin. Invest. 119, 2441-2450 (2009).</li><li>Suzuki, K., Kawamoto, S., Maruya, M., Fagarasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GALT:+organization+and+dynamics+leading+to+IgA+synthesis.">GALT: organization and dynamics leading to IgA synthesis.</a> Adv. Immunol. 107, 153-185 (2010).</li><li>Iwasaki, A., Kelsall, B. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peyer's+Patch+Dendritic+Cells+Sample+Antigens+by+Extending+Dendrites+Through+M+Cell-Specific+Transcellular+Pores.">Peyer's Patch Dendritic Cells Sample Antigens by Extending Dendrites Through M Cell-Specific Transcellular Pores.</a> Gastroenterology. 42, 592-601 (2011).</li><li>Lelouard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+bacteria+and+dead+cells+are+internalized+by+a+unique+subset+of+Peyer's+patch+dendritic+cells+that+express+lysozyme.">Pathogenic bacteria and dead cells are internalized by a unique subset of Peyer's patch dendritic cells that express lysozyme.</a> Gastroenterology. 138, 173-184 (2010).</li><li>Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. 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L., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+populations+of+dendritic+cells+are+present+in+the+subepithelial+dome+and+T+cell+regions+of+the+murine+Peyer's+patch.">Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer's patch.</a> J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).</li><li>Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+Mouse+Ligated+Peyer's+Patch+Intestinal+Loop+Assay+to+Evaluate+Bacterial+Uptake+by+M+cells.">Application of a Mouse Ligated Peyer's Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells.</a> J. Vis. Exp. (58), e3225 (2011).</li><li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Dendritic+Cells+and+Macrophages+from+the+Mouse+Intestine.">Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine.</a> J. Vis. Exp. (63), e4040 (2012).</li><li>Lopez-Guerrero, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotavirus+infection+activates+dendritic+cells+from+Peyer's+patches+in+adult+mice.">Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer's patches in adult mice.</a> J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

In diesem Artikel, wir haben parallele Protokolle zur Herstellung PP Einzelzelle Zubereitungen für die durchflusszytometrische und Funktionsanalyse und Kryoschnitten zur Immunfärbung vorgesehen. Beide Methoden sind sehr gut reproduzierbar und ohne weiteres zugänglich, vorausgesetzt ein Durchflußzytometer und Kryostat zur Verfügung. Erstmals Ermittler es sei darauf hingewiesen, dass, wenn im Vergleich zur Milz, insgesamt Zellausbeuten von PPs relativ mager sind. Dennoch, das Protokoll skizzieren wir in der Regel Ren...

Peyer-Plaques (PP) sind makroskopische Aggregate der organisierten lymphatischen Follikel in der kleinen Darm von Menschen und Mäusen (Abbildung 1) und bilden die primären Standorten, an denen mukosalen Immunantworten gegen diätetische Antigene, symbiotischer Bakterien, mikrobielle Pathogene und orale Impfstoffe ausgelöst werden 1-4. Im Gegensatz zu anderen peripheren lymphatischen Gewebe wie den Mesenteriallymphknoten fehlt PPs afferenten Lymphgefäße. Als solche adaptive Immunantworten in PPs werden in Reaktion auf Antigene aus dem Darmlumen abgeleitet angetrieben. Die Abtastung wird die luminale Antigene durch den Follikel-assoziierten Epithel (FAE), die sowohl aus Enterozyten und Antigen-Sampling-Zellen als Zellen bekannt M besteht bewerkstelligt. Unterhalb des FAE im subepithelialen Kuppel (SED) Region liegt ein Netz von dendritischen Zellen (DCs) mit Makrophagen, B-Zellen und CD4 + T-Zellen 5-9 vermischt. Im Kern jedes PP lymphatischen follicle sind follikulären dendritischen Zellen (FDC) und einem B-Zell-reiche zentrales Keimzentrum, durch T-Zell-reichen Zonen interfollikulären flankiert. Antigen Abtasten durch PPs führt zur Entwicklung von IgA + B-Zellen und CD4 + Plasmablasten Effektorzellen und Gedächtniszellen dass Saatgut der umgebende Lamina propria und bereitzustellen Immunität gegenüber einem breiten Spektrum an mukosalen Eindringlinge. Sezieren die komplexen immunologischen Ereignissen mit Antigen Probenahme, Aufbereitung und Präsentation in PPs verbunden ist eine gewaltige Aufgabe, wenn man bedenkt, dass PP-Zellen nur einen winzigen Bruchteil der gesamten lymphatischen Zellen in der Darmschleimhaut bilden. Um in der in-vitro-Charakterisierung der Zellen in diesem Umfeld zu erleichtern, bieten wir ein Protokoll für die Vorbereitung insgesamt Maus PP-Zellen für die durchflusszytometrische und funktionelle Analyse, sowie ein Protokoll für die Vorbereitung PP Kryoschnitten für Immunfluoreszenz und Immunhistologie. Unser Protokoll für die Isolierung, Charakterisierung und Immunfärbung von mouse PP-Zellen ist an sich nicht neu, wie die Tatsache, dass es zahlreiche Hinweise aus mehr als 25 Jahren, dass diese Techniken zu nennen 5,6,9-11 belegt. Vielmehr bietet unser Protokoll eine optimierte (und visuelle)-Methode für Ermittler sammeln PPs für die erste Zeit. Die Techniken, die wir beschreiben, sind leicht zu beherrschen und leicht nachgeben große Anzahl von Zellen mit&gt; 90% der Lebensfähigkeit der Zellen. Die Kryoschneiden-Protokoll liefert reproduzierbare Schnittserien ideal für Immunfluoreszenzfärbung und konfokale Bildgebung eignet. Darüber hinaus ergänzt unser Protokoll zwei anderen kürzlich JoVE Artikel. Das erste, von Fukuda et al, beschreibt die Verwendung von ligierten ilealen Schleife Assays um die Aufnahme von pathogenen Bakterien, die durch M PP Zellen 12 zu beurteilen. Die andere, von Geem und Kollegen, beschreibt die Isolierung und Charakterisierung von DCs und Makrophagen aus der Maus Darmschleimhaut, sondern schließt ausdrücklich PPs aus ihrer Analyse 13.

<table border="1"><tbody><tr><td> Artikel </td><td> Firma </td><td> Cat. # </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Oktober Compound </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> 7x7x5 mm Bodenform </td><td> Fisherbrand </td><td> 22-363-552 </td><td></td></tr><tr><td> ImmEdge Pen </td><td> Vector Labs </td><td> H-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost Plus Objektträger </td><td> Thermo Scientific </td><td> 4951 </td><td></td></tr><tr><td> Edge-Rite Klinge </td><td> Thermo Scientific </td><td> 4280L </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Maus CD11c-PE </td><td> eBioscience </td><td> 17-0114-82</td><td></td></tr><tr><td> Anti-Mouse CD45R/B220-APC </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553092 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Maus CD3-FITC </td><td> BD Pharmigen </td><td> 561798 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Maus CD4-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553652 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Mouse CD8-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553032 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Mouse CD19-PerCP </td><td> BioLegend </td><td> 115531 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks balanced salt solution (HBSS) ohne Phenolrot </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14175-079 </td><td></td></tr><tr><td> 70 um Zellsieb </td><td> BD Falcon </td><td&gt; 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Spleen Dissoziation Medium </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 7915 </td><td></td></tr><tr><td> Ziegenserum </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-072 </td><td></td></tr><tr><td> FC-Baustein </td><td> ATCC 2.4.G2 </td><td> HB-197 </td><td> Supes von Zelllinie 2.4.G2 erhalten </td></tr><tr><td> Curved Scissor </td><td> FST </td><td> 14061-09 </td><td></td></tr><tr><td> Kryostat </td><td> Leica </td><td> 3050S </td><td></td></tr><tr><td> FACS Calibur </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gräfin Cell Counter </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hematoxylin </td&gt; <td> Richard Allan </td><td> 7211 </td><td></td></tr><tr><td> Eosin </td><td> Richard Allan </td><td> 71304 </td><td></td></tr><tr><td> Formalin </td><td> Starplex Scientific </td><td> 3661 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabelle 1. Reagenzien und Ausrüstung in dieser Studie verwendet. </td></tr></tbody></table>

isolating and immunostaining lymphocytes and dendritic cells from murine peyer's patches

Peyer-Plaques (PP) sind integraler Bestandteil der Darm-assoziierten lymphatischen Gewebe (GALT) und spielen eine zentrale Rolle in der intestinalen Immunüberwachung und Homöostase. Teilchenförmigen Antigene und Mikroben im Darmlumen werden kontinuierlich von PP M Zellen im Follikel-assoziierten Epithel (FAE) abgetastet und transportiert zu einer darunterliegenden Netz von dendritischen Zellen (DCs), Makrophagen und Lymphozyten. In diesem Artikel beschreiben wir, Protokolle, in denen murine PPs sind (i) dissoziiert in einzelne Zellsuspensionen und einer Durchflusszytometrie und (ii) für Kryoschneiden und Immunfärbung vorbereitet. Für Durchflusszytometrie, sind PPs mechanisch dissoziiert und dann durch 70 um Membranen zu Einzelzellsuspensionen frei von Epithelzellen und Großabfallfördereinrichtung erzeugen. Beginnend mit 20-25 PPs (von vier Mäusen), ergibt dies eine schnelle und reproduzierbare Methode eine Bevölkerung von&gt; 2,5 x 10 6 Zellen mit&gt; 90% der Lebensfähigkeit der Zellen. Für Kryoschneiden, frischely isolierten PPs werden in Optimal Cutting Temperature (OCT)-Medium, Snap-in flüssigem Stickstoff schockgefroren und anschließend geschnitten mit einem cryomicrotome eingetaucht. Gewebeschnitte (5-12 um) sind luftgetrocknet, fixiert mit Aceton oder Methanol, und dann zu Immunmarkierung unterziehen.

Die durchflusszytometrische Analyse von monodispersen Suspensionen von insgesamt PP Zellen zeigt eine klare Unterscheidung zwischen guten und schlechten Zellpräparaten. In guten Zellpräparationen mit über 80% Lebensfähigkeit zeigen die überwiegende Mehrzahl der Zellen mit hoher Vorwärtsstreuung (FSC), ein Indikator für eine hohe Zellvolumen und Low-Side-Scatter (SSC), ein Indikator für niedrige Zelle Granularität (Abbildung 2A). Bei diesem Experiment haben wir auch absichtlich eine &quot;schlec...

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Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer&#039;s Patches

Es gibt ein wachsendes Interesse für das Verständnis der immunologischen Funktionen von bestimmten Subpopulationen von Zellen in Peyer-Plaques (PP), die primären induktiven Seiten des Darm-assoziierten lymphatischen Gewebe. Hier beschreiben wir parallele Protokolle zur Herstellung PP Einzelzelle Zubereitungen für die durchflusszytometrische Analyse und PP Kryoschnitten für Immunfärbung.

Isolierung und Immunfärbung Lymphozyten und dendritische Zellen aus Murine Peyer-Plaques

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

isolating-immunostaining-lymphocytes-dendritic-cells-from-murine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

32.4K Aufrufe.  New York State Department of Health. Es gibt ein wachsendes Interesse für das Verständnis der immunologischen Funktionen von bestimmten Subpopulationen von Zellen in Peyer-Plaques (PP), die primären induktiven Seiten des Darm-assoziierten lymphatischen Gewebe. Hier beschreiben wir parallele Protokolle zur Herstellung PP Einzelzelle Zubereitungen für die durchflusszytometrische Analyse und PP Kryoschnitten für Immunfärbung.

Serie: Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

Erzeugung und Kennzeichnung von Murine Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen mit Qdot Nanokristalle für Tracking-Studien

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

Isolierung von Maus Lung Dendritischen Zellen

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

Isolierung von myeloider dendritischer Zellen und Epithelzellen Menschliche Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal Peyer&#39;s patch (PP). Common dendritic cell progenitors (CDPs, lin- c-kitlo CD115+ Flt3+) were purified from the bone marrow of C57BL6 mice by FACS and transferred to recipient mice that lack a significant pDC population in PP; in this case, Ifnar-/- mice were used as the transfer recipients. In some mice, overexpression of the dendritic cell growth factor Flt3 ligand (Flt3L) was enforced prior to adoptive transfer of CDPs, using hydrodynamic gene transfer (HGT) of Flt3L-encoding plasmid. Flt3L overexpression expands DC populations originating from transferred (or endogenous) hematopoietic progenitors. At 7-10 days after progenitor transfer, pDCs that arise from the adoptively transferred progenitors were distinguished from recipient cells on the basis of CD45 marker expression, with pDCs from transferred CDPs being CD45.1+ and recipients being CD45.2+. The ability of transferred CDPs to contribute to the pDC population in PP and to respond to Flt3L was evaluated by flow cytometry of PP single cell suspensions from recipient mice. This method may be used to test whether other progenitor populations are capable of generating PP pDCs. In addition, this approach could be used to examine the role of factors that are predicted to affect pDC development in PP, by transferring progenitor subsets with an appropriate knockdown, knockout or overexpression of the putative developmental factor and/or by manipulating circulating cytokines via HGT. This method may also allow analysis of how PP pDCs affect the frequency or function of other immune subsets in PPs. A unique feature of this method is the use of Ifnar-/- mice, which show severely depleted PP pDCs relative to wild type animals, thus allowing reconstitution of PP pDCs in the absence of confounding effects from lethal irradiation.

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer&#039;s Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol describes experimental procedures to assess the differentiation of plasmacytoid dendritic cells in Peyer&#8217;s patch from common dendritic cell progenitors, using techniques involving FACS-mediated cell isolation, hydrodynamic gene transfer, and flow analysis of immune subsets in Peyer&#8217;s patch.

Die Beurteilung der Entwicklung der Murine Plasmazytoide dendritischen Zellen in Peyer-Patches mit Adoptiv Übertragung von hämatopoetischen Vorläuferzellen

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

T-Zellen erfassen Bakterien durch Transinfection von dendritischen Zellen

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during inflammatory responses. Unfortunately, study of pDC function is hindered by their low frequency in lymphoid organs, and existing methods for in vitro DC generation predominantly favor the production of cDCs over pDCs. Here we present a unique approach to efficiently generate pDCs from common lymphoid progenitors (CLPs) in vitro. Specifically, the protocol described details how to purify CLPs from bone marrow and generate pDCs by coculturing with &#947;-irradiated AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand. A unique characteristic of this culture system is that the CLPs migrate underneath the AC-6 cells and become cobblestone area-forming cells, a critical step for expanding pDCs. Morphologically distinct DCs, namely pDCs and cDCs, were generated after approximately 2 weeks with a composition of 70-90% pDCs under optimal conditions. Typically, the number of pDCs generated by this method is roughly 100-fold of the number of CLPs seeded. Therefore, this is a novel system with which to robustly generate the large numbers of pDCs required to facilitate further studies into the development and function of these cells.

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

In-vitro-Erzeugung von Murine Plasmazytoide dendritischen Zellen aus Lymphoid Gemeinsame Vorläufern mit der AC-6-Feeder-System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

Isolierung und Durchflusszytometrie Charakterisierung von murinen Dünndarms Lymphozyten

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

Isolation und Aktivierung von murinen Lymphozyten

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Herstellung von menschlichen Monozyten abgeleiteten Dendritischen Zellen aus Vollblut

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

Isolieren von Lymphozyten aus der Maus kleinen intestinalen Immunsystems

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...