Wir danken Melissa Griffin und Jenna Rozacky für ihre Fisch-Experte Pflege. PDM Dank für EGN schriftlich Unterstützung, Großzügigkeit und Geduld. Diese Arbeit wurde von NIH / NIDCR R01DE020884 zu JKE unterstützt.

1. Tierhaltung und Mutant Allele <ol><li> Heben und Zebrafisch zu züchten, wie beschrieben 21. </li><li> Zebrafisch-Mutante Allele in dieser Studie verwendet wurden, waren 16 PDGFRA B1059, B1100 Smad5 22 und 23 smo B577. Quellen für diese Zebrafisch-Stämme schließen ZIRC. </li></ol> 2. Herstellung von Lösungen und Werkzeuge Hinweis: Alle Lösungen und Geräte können im Voraus und für eine spätere Verwendung gespeichert werden. <ol><li> Machen Embryo Medien (EM), wie zuvor beschrieben 21. </li><li> Machen Sie 4 g / L MS-222 (Tricaine). Löse 4 g Natriummonohydrogenphosphat (Na 2 HPO 4) in 450 ml sterilem Wasser. 2 g MS-222 auf die Lösung. PH-Wert auf 7,0 bis 7,2 innerhalb. Hinzufügen sterilem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 500 ml. </li><li> Optional: Stellen Sie 4 g / L Nelkenöl. Wiegen 0,2 g reines Nelkenöl in einem 50 ml konischen Röhrchen. Hinzufügen EM auf ein Gesamtvolumen von 50 ml. Lagern bei 4 ° C </li><li> Machen Sie 3% methylcellulose. Bringt 50 ml EM + 0,1 M HEPES zum Kochen bringen. Vom Herd nehmen. Stir in 1,5 g Methylcellulose, bis die Lösung homogen ist. Lagern bei 4 ° C </li><li> Machen 0,2% Agarose. In 0,1 g Agarose auf 50 ml EM. Bringen EM zum Kochen in der Mikrowelle oder auf einer Heizplatte und überprüfen, dass die Agarose aufgelöst hat. Aliquot in 500 ul-Volumina in Mikrozentrifugenröhrchen und bei 4 ° C Anmerkung: Band kann nach Bedarf eingestellt werden. </li><li> Machen Kapillare Poker. Geben Sie einen Tropfen Superkleber in einem 0,9 mm ID Kapillare. Legen Sie eine 4-5 cm Länge von 6 lb-Test Monofile Angelschnur in der Kapillare, so dass etwa 3-4 mm Linie erstreckt sich über das Ende der Röhre. </li><li> Machen Sie zwei überbrückt Deckgläser pro Probe. Superkleber 22 x 22-1 Deckglas auf jedes Ende eines 24 x 60-1 Deckglas Verlassen der Mitte frei. Machen Sie Singles (1 kleines Deckglas pro Ende) Embryonen für weniger als einen Tag alt, Doppel (2 kleine Deckgläser auf der jeweils anderen pro-Ende) für Embryonen 03.59 days alt, oder Tripel (3 kleine Deckgläser auf der jeweils anderen pro-Ende) für Embryonen fünf Tage oder älter. </li><li> Füllen Sie eine 10 ml Spritze mit Hochvakuumfett. Hinweis: Vakuumfett dient als Dichtmittel, um eine Dehydratation der Proben über lange Zeiträume hinweg zu verhindern, und hat eine niedrige potentielle Toxizität gegenüber volatiler Dichtstoffe. </li></ol> 3. Montagezebrafischembryonen für konfokale Mikroskopie (Siehe Abbildung 1) <ol><li> Bereiten Betäubung Medium. Schmelzen Sie ein Aliquot 0,2% Agarose durch die Mikrowelle in 20 Sekunden-Intervallen, bis sie vollständig flüssig. Mischen 8 ul MS-222 in 192 ul 0,2% Agarose oder 5 &amp;mgr; l von 4 g / L Nelkenöl in 195 ul 0,2% Agarose. Pflegen Sie in einem 42 ° C Heizblock. Hinweis: Langzeitbelichtung zu MS-222 verursacht stärkere Entwicklungsverzögerungen als Nelkenöl hat in der embryonalen Zebrafisch-24. </li><li> Falls erforderlich: Manuell dechorionate unhatched transgenen Embryos, nur vor der Analyse analysiert werden. Mit einer Pinzette langsam tear das Chorion offen, bis der Embryo wird befreit. </li><li> Anesthetize das Zebrafisch-Embryonen. 1 ml einer 4 g / L Lager von MS-222 bis 24 ml Embryo Medien. Alternativ fügen 390 ul von 4 g / L Nelkenöl auf 24 ml Wasser 24 Fische. Hinweis: Nelkenöl wirkt langsam so mindestens 15-20 min vor Zeitraffer-Mikroskopie führen Sie diesen Schritt. </li><li> Platzieren einer Wulst aus Vakuumfett um die Mittelfläche von einer nach oben gerichteten Deck überbrückt. Langsam schieben Sie den Vakuumfett aus der Spritze, so dass eine glatte, durchgehende Raupe, die neben und innerhalb der Brücken und der Kante der Deckglas ist. </li><li> Verbreiten Sie einen Kreis von 4% Methylcellulose in der Mitte des Brückendeckglas mit einem Holz Applikator. </li><li> Übertragen des Embryos, die abgebildet werden. Wenn der Embryo wird betäubt ziehen Sie es in eine Glaspipette. Halten Sie die Pipette vertikal, damit der Embryo auf der Unterseite der Flüssigkeit in die Pipette zu versenken. Bewegen Sie die Pipette in die Agarose-Lösung und damit der Embryo zu fallenin der Agarose. Sie vertreiben die Flüssigkeit nicht. </li><li> Legen Sie die Probe. Zeichnen Sie eine Agarose-Lösung und den Embryo in die Pipette. Vertreibt den Embryo in einem Tropfen Agarose-Lösung auf der Oberseite der Methylcellulose. Verwenden Sie ein Kapillar-Poker um den Embryo nach unten auf die Methylcellulose schieben und richten den Embryo als für die Bildgebung gewünscht. </li><li> Verschließen Sie die Probe. <ol><li> Legen Sie eine überbrückt Deckglas auf der montierten ein, nach unten zeigt. Bewerben mäßigen Druck auf beiden Seiten der Deckgläser eingeklemmt, bis die Brücken machen den direkten Kontakt und die Agarose-Drop-Dichtungen an beiden Deckgläser. Stellen Sie sicher, dass der Embryo richtig ausgerichtet ist. </li><li> Reiben Sie eine Holz Applikator entlang der Glas zu glätten Risse und Lücken in der Vakuumfett Perle. Überschüssiges Fett von den Rändern. </li></ol></li></ol> 4. Zeitraffer-konfokale Imaging transgener Zebrafischembryonen (Dieses Protokoll wurde für eine Zeiss LSM 710 konfokalen Mikroskop uns optimierting ZEN Imaging Software und kann zur Verwendung mit anderen Systemen modifiziert werden.) <ol><li> Aktivieren Ausrüstung. Schalten Sie den konfokalen Mikroskop und externer Lasergeräte. Einschalten des Computers, um das konfokale Mikroskop verbunden. Offene konfokalen Imaging-Software und wählen Sie &quot;Start System&quot;, um die Bildaufnahme Kontrollen zu aktivieren. </li><li> Bereiten beheizten Bühne. Senken Sie die Testplattform des konfokalen Mikroskops und bewegen Sie die Objektive aus der Position. Ersetzen Sie den Standardstufe mit einer elektronischen beheizten Bühne. Schalten Sie den Controller für das erwärmte Bühne und die Temperatur 29,5 ° C </li><li> Positionieren der Probe in das Blickfeld. Legen Sie die Probe montiert auf der Bühne. Bewegen Sie den 20X Objektiv in Position und heben Sie die Testplattform. Aktivieren Sie den sichtbaren Lichtemitter und schauen durch die Okulare. Zentrieren Sie den Kopf des Embryos in das Blickfeld. </li><li> Definieren Sie die Testeinstellungen. <ol><li> Fluoreszenzkanäle aktivieren, indem Siedie Fluoreszenzwellenlänge erfasst werden, und wählen Farbnachschlagtabellen (LUT) für jeden Kanal. Falls erforderlich, verwenden Sie den manuellen Kontrollen in der Software, um auf die erforderlichen Laser (z. B. 561 nm für RFP) zu drehen. Für jeden Fluoreszenzkanal, stellen Sie die Laserintensität auf 10,0 und die Photomultiplier-Spannung (HV oder Verstärkung) zwischen 600-700. Stellen Sie die Mittelung bis 4 und die Bit-Tiefe auf 16 Bit. </li><li> Aktivieren Sie die Z-Stapel und Zeitreihen-Module. Stellen Sie die Lochblende für eine 5 um oder kleiner Z-Auflösung, und stellen Sie die Z-Intervall auf den vorgeschlagenen optimalen Abstand. Hinweis: Im Allgemeinen erlaubt 5 um Z-Auflösung jedes Bild Z-Stapel, um schnell genug für gesammelt werden eine &quot;Momentaufnahme&quot; des Embryos zu einem bestimmten Zeitpunkt, während auch die Lösung einzelner Zellen. Absenken des Mittel reduziert auch die Menge an Zeit pro Bild. </li><li> Definieren Sie das gewünschte Zeitintervall zwischen den Bildern (in der Regel 10 bis 20 Minuten) und die Gesamtlänge des Experiments. </li></ol></li><li> Stellen Sie PositionsInformationen. <ol><li> Schalten Sie die Kamera, um den Live-Modus. Stellen Sie den Fokus und Laserintensität erhöhen, wenn notwendig, um die Fluoreszenz zu sehen. Stellen Sie den digitalen Zoom bis 0,6 für eine größere Ansicht, wenn gewünscht. </li><li> Positionieren Sie die Bühne, so dass alle interessierenden Strukturen sichtbar sind und es gibt Platz im Sichtfeld für Auswuchs dorsal und ventral. Konzentrieren durch den Embryo an den oberen und unteren Grenzen der Fluoreszenz. Einstellen der ersten und der letzten Z-Stapel-Schichtpositionen mindestens 100 &amp;mgr; m oder mehr über diese Grenzen hinaus. </li></ol></li><li> Optimieren Fluoreszenzintensität. <ol><li> Stellen Sie die Display-Anzeige LUT zu reichen. Leuchtstoff-Strukturen sollte jetzt weiß, und der Rest des Sichtfeldes sollte blau (keine Erkennung) oder schwarz sein. </li><li> Steigern HV / Gewinn auf ein Niveau knapp unter dem gesättigten (rot) Pixel angezeigt. Falls erforderlich, versetzt, so eine Mehrheit der Hintergrund wird nicht erkannt (blau). Hinweis: Kleinere Lochblendendurchmesser und höhere Laserintensität sowohl Verbesserung der Bild definition, aber Laserintensität muss niedrig gehalten werden, um lebende Gewebe zu bewahren. Erhöhte HV / Gewinn-und Lochblendendurchmesser (&lt;5 um) sind in der Regel vorzuziehen, erhöhte Laserintensität. </li><li> Halten Sie den Lochblendendurchmesser breit genug, um Bilder in einer zeitgemäßen Weise zu sammeln, durchschnittlich bis 4 Sätze. Die Z-Intervall sollte immer auf die vorgeschlagenen optimalen Abstand für den Lochblendendurchmesser eingestellt werden. Führen kurzen Scans (Mittelwertbildung = 1) mit verschiedenen Einstellungen, und verwenden Sie die minimale Laserintensität, die gewünschte Auflösung erreicht. </li></ol></li><li> Abwicklung des Versuchs für die gewünschte Zeitdauer. Danach entfernen Embryo von der beheizten Bühne und trennt langsam die Deckgläser. Tauchen Sie das Deckglas und Embryo im EM in einer 30 mm Petrischale. Mit einer Glaspipette vorsichtig waschen, den Embryo aus der Deckglas und entfernen Sie das Deckglas aus der Petrischale. Setzen Sie den Embryo in eine 28,5 ° C Inkubator weiter zu entwickeln. </li><li> Wachstum vergleichen. Am Ende des Experiments, nehmen einzelne ZsKlebrigkeit Bilder Agarose montierten Geschwister Embryonen, die ähnlich zu den Proben zu Beginn des Versuchs aufgeführt wurden, wurden aber in EM in einem 28,5 ° C-Inkubator angehoben. </li><li> Messen Sie Schlundbögen, wie gebraucht. Die Messungen können in einigen konfokalen Software-Suiten durchgeführt werden. Die Messungen wurden hier durch Import und Z-ragt. Lsm-Dateien der einzelnen Frames unter Verwendung Fiji25. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Zeitraffer-konfokale Mikroskopie ist ein mächtiges Werkzeug für die Analyse der Entwicklung. Hier zeigen wir, Nützlichkeit der Methode bei der Untersuchung Pharyngealbogen Morphogenese in Zebrafisch-Mutante, die für wichtige Signalwege, die mit einem transgenen Neuralleistenzellen Etiketten sind. Neben Gewebe-Ebene analysiert, Zeitraffer Analysen sind auch auf zellulärer Ebene zu einem 28-Analysen. Viele verbreitete Zebrafisch Verfahren können auch in Zeitraffer-Mikroskopie Experimente, einschließlich ...

Kraniofazialen Morphogenese ist ein komplexes mehrstufiges Verfahren, die koordinierte Wechselwirkungen zwischen mehreren Zelltypen erfordert. Die Mehrheit der kraniofazialen Skelett aus Neuralleistenzellen stammen, müssen von denen viele aus dem dorsalen Neuralrohr in transienten Strukturen genannt Pharyngealbögen 1 migrieren. Wie bei vielen Geweben ist Morphogenese des kraniofazialen Skeletts komplizierter, als durch statische Bilder von Embryonen in bestimmten Entwicklungszeitpunkten zu verstehen. Obwohl es zeitaufwendig durchzuführen, stellt in vivo Zeitraffermikroskopie einen kontinuierlichen Blick auf Zellen und Gewebe eines sich entwickelnden Embryos. Jedes Bild in einem Zeitraffer-Serie verleiht Kontext zu den anderen, und hilft, einen Ermittler bewegen sich abzuleiten, warum ein Phänomen tritt nicht abzuleiten, was zu dieser Zeit auftreten. In-vivo-Bildgebung ist somit ein leistungsfähiges Werkzeug für die experimentelle deskriptive Ansätze zurdekonstruieren die Wege, die Morphogenese zu führen. Der Zebrafisch Danio rerio ist eine beliebte genetische Modell für die Wirbel embryonalen Entwicklung und ist besonders gut für die in vivo-Abbildung von Morphogenese geeignet. Moderne, bequeme Methoden zur Transgenese und genomische Modifikation schnell voran die Anzahl der Werkzeuge zur Verfügung, Zebrafisch-Forscher. Diese Tools verbessern bereits robuste Methoden zur genetischen Manipulation und Mikroskopie. In-vivo-Bildgebung von fast jedem Gewebe in fast jeder gewünschten genetischen Zusammenhang ist näher an der Realität als Phantasie. Morphogenetischen Bewegungen der Schlundbögen werden durch Signal Wechselwirkungen zwischen der Neuralleiste und dem benachbarten Epithelien, sowohl Ektoderm und Entoderm geführt. Es gibt zahlreiche Signalmoleküle durch die Epithelien exprimiert, die notwendig sind, um die Morphogenese der Gesichtsschädelskelettelemente fahren. Unter diesen Signalmoleküle, Sonic Hedgehog (Shh) ist von entscheidender Bedeutung foder kraniofazialen Entwicklung 8.2. Shh wird sowohl durch die orale Ektoderm und Entoderm Rachen 2,6,9,10 ausgedrückt. Die Expression von Shh im Endoderm regelt morphogenetischen Bewegungen der Bögen 10, Strukturierung Neuralleiste in den Bögen 10, und das Wachstum des Gesichtsschädelskelett 11. BMP-Signal ist auch für die kraniofaziale Entwicklung 12 von entscheidender Bedeutung und kann Morphogenese der Schlundbögen ändern. Bmp Signalweg reguliert dorsalen / ventralen Musterbildung im Wappen der Schlundbögen 13,14. Störung der Smad5 im Zebrafisch führt zu schweren Gaumendefekte und ein Ausfall des Meckel-Knorpel, angemessen an der Mittellinie 15 zu verschmelzen. Darüber hinaus sind die Mutanten und Fusions Reduktionen in den ventralen Knorpelelemente mit der 2., 3., 4. und manchmal Pharyngealbogen Elemente an der Mittellinie 15 verschmolzen zeigen auch. Diese Fusionen stark vermuten, dass BMP-Signal leitet die Morphogenese dieser Rachen-Elemente. PDGF-Signalisierung ist für kraniofaziale Entwicklung notwendig, hat unbekannte Rollen in Pharyngealbogen Morphogenese aber. Sowohl Maus und Zebrafisch-Mutanten PDGFRA haben tiefgreifende Mittelgesichts clefting 16-18. Zumindest in dieser Zebrafisch Mittelgesichtsspaltbildung ist aufgrund eines Fehlers der richtigen Neuralleiste Zellmigration 16. Neuralleistenzellen weiterhin PDGFRA äußern, nachdem sie die Schlundbögen eingetragen. Zusätzlich werden PDGF-Liganden durch Gesichts Epithelien exprimiert und in den Kiemenbögen 16,19,20, damit PDGF-Signal könnte auch in der Morphogenese der Schlundbögen nach der Migration eine Rolle spielen. Allerdings Analysen der Morphogenese der Schlundbögen in PDGFRA Mutanten wurden nicht durchgeführt. In vivo-Konfokalmikroskopie pharyngul Hier zeigen wir,a-Phase transgenen Zebrafisch und beschreiben Sie die Morphogenese der Schlundbögen innerhalb dieses Zeitraums. Wir zeigen weiter, Gewebe Verhaltensweisen, die durch Mutationen, die die Bmp, PDGF, Shh und Signalwege zu stören betroffen sind.

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	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">6 lb. test monofilament line</td>
			<td style="width:189px;">Cortland Line Company</td>
			<td style="width:185px;">SLB16</td>
			<td style="width:220px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Agarose I</td>
			<td style="width:189px;">Amresco</td>
			<td style="width:185px;">0710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Argon laser</td>
			<td style="width:189px;">LASOS Lasertechnik GmbH</td>
			<td style="width:185px;">LGN 3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">C8106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID</td>
			<td style="width:189px;">FHC</td>
			<td style="width:185px;">30-31-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Clove oil</td>
			<td style="width:189px;">Hilltech Canada, Inc.</td>
			<td style="width:185px;">HB-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">High vacuum grease</td>
			<td style="width:189px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:185px;">2021846-0807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Isotemp dry-bath incubator</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">2050FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Laser scanning microscope</td>
			<td style="width:189px;">Carl Zeiss AG</td>
			<td style="width:185px;">LSM 710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Magnesium sulfate hexahydrate</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Microscope cover glass, 22x22-1</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">12-542-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Microscope cover glass, 24x60-1</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">12-545-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">M-11321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">M-11624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">TempController 2000-2</td>
			<td style="width:189px;">PeCon GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Tricaine-S</td>
			<td style="width:189px;">Western Chemical, Inc.</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing craniofacial morphogenesis in zebrafish using 4d confocal microscopy

Zeitraffer-Bildgebung ist eine Technik, die für die direkte Beobachtung des Prozesses der Morphogenese ermöglicht, oder die Erzeugung der Form. Durch ihre optische Klarheit und Zugänglichkeit für genetische Manipulation hat der Zebrafisch-Embryos zu einem beliebten Modellorganismus, mit der Zeitraffer-Analyse der Morphogenese in lebenden Embryonen durchzuführen. Konfokale Bildgebung eines lebenden Zebrafischembryo erfordert, dass ein Gewebe von Interesse ist, die dauerhaft mit einem fluoreszierenden Marker markiert ist, wie einem Transgen oder Farbstoff injiziert. Der Prozess verlangt, dass der Embryo wird betäubt und an Ort und Stelle in einer Weise, dass eine gesunde Entwicklung normal verläuft statt. Parameter für die Bildgebung muss auf für dreidimensionale Wachstum Rechnung zu tragen und die Anforderungen der einzelnen Zellen zu lösen, während sich schnelle Schnappschüsse der Entwicklung auszugleichen. Unsere Ergebnisse zeigen die Fähigkeit, langfristige In-vivo-Bildgebung von Fluoreszenz-markierten Zebrafisch-Embryonen durchzuführen und abwechslungsreiches Gewebe Verhaltensweisen erkennendie Schädel Neuralleiste, die kraniofaziale Anomalien verursachen. Entwicklungsverzögerungen, die durch Anästhesie und Montage verursacht werden, sind minimal, und Embryonen sind unversehrt durch den Prozess. Time-lapse abgebildet Embryonen zu flüssigen Medium bei später Punkte in der Entwicklung zurückgebracht werden und anschließend abgebildet oder fixiert. Mit einer zunehmenden Fülle von transgenen Zebrafischlinien und gut charakterisierten Schicksal Mapping-und Transplantationstechniken, Imaging ist eine beliebige Gewebe möglich. Als solche Zeitraffer-in-vivo-Bildgebung kombiniert kraftvoll mit Zebrafisch-genetischer Methoden, einschließlich der Analyse von Mutanten und mikroinjizierten Embryonen.

In Wildtyp-Embryonen nach Neuralleiste Bevölkerung, länglichen die Schlundbögen entlang der anterior / posterior und dorsal / ventral Achsen während der Bewegung in einer Richtung rostral (Film 1). Bei 30 Stunden nach der Befruchtung (HPF) ist die vordere / hintere Länge des ersten Schlundbogen zwischen 1,8 bis 1,9-fache seiner dorsalen / ventralen Höhe. Rücken / Bauchdehnung schreitet stetig schneller als vorderen / hinteren Verlängerung bis 36,5 hpf. Von hier aus dorsal / ventrale Höhenplatea...

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Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Zeitraffer-konfokale Bildgebung ist eine leistungsstarke Technik zur Charakterisierung der embryonalen Entwicklung. Hier beschreiben wir die Methodik und zu charakterisieren kraniofazialen Morphogenese in Wildtyp-als auch PDGFRA, Smad5 und SMO mutierten Embryonen.

Analyse Craniofacial Morphogenese in Zebrafisch Mit 4D konfokale Mikroskopie

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.9K Aufrufe.  The University of Texas at Austin.  Zeitraffer-konfokale Bildgebung ist eine leistungsstarke Technik zur Charakterisierung der embryonalen Entwicklung. Hier beschreiben wir die Methodik und zu charakterisieren kraniofazialen Morphogenese in Wildtyp-als auch PDGFRA, Smad5 und SMO mutierten Embryonen. 

Serie: Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Forschung

Biologie

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. For example, electroporation has been used with great success to study neural and retinal development in Xenopus, chicken and mouse 1-10. However, it is important to note that in all of these studies, investigators were not targeting soft tissues. Because we are interested in craniofacial development, we adapted a method to target facial mesenchyme.
When we searched the literature, we found, to our surprise, very few reports of successful gene transfer into cartilaginous tissue. The majority of these studies were gene therapy studies, such as siRNA or protein delivery into chondrogenic cell lines, or, animal models of arthritis 11-13. In other systems, such as chicken or mouse, electroporation of facial mesenchyme has been challenging (personal communications, Dept of Craniofacial Development, KCL). We hypothesized that electroporation into procartilaginous and cartilaginous tissues in Xenopus might work better. In our studies, we show that gene transfer into the facial cartilages occurs efficiently at early stages (28), when the facial primordium is still comprised of soft tissue prior to cartilage differentiation.
Xenopus is a very accessible vertebrate system for analysis of craniofacial development. Craniofacial structures are more readily visible in Xenopus than in any other vertebrate model, primarily because Xenopus embryos are fertilized externally, allowing analyses of the earliest stages, and facilitating live imaging at single cell resolution, as well as reuse of the mothers 14. Among vertebrate models developing externally, Xenopus is more useful for craniofacial analysis than zebrafish, as Xenopus larvae are larger and easier to dissect, and the developing facial region is more accessible to imaging than the equivalent region in fish. In addition, Xenopus is evolutionarily closer to humans than zebrafish (&tilde;100 million years closer) 15. Finally, at these stages, Xenopus tadpoles are transparent, and concurrent expression of fluorescent proteins or molecules will allow easy visualization of the developing cartilages. We anticipate that this approach will allow us to rapidly and efficiently test candidate molecules in an in vivo model system.

Craniofacial cartilages develop in close contact with other tissues and are difficult to manipulate in live animals. We are using electroporation to deliver molecular tools during growth of the craniofacial skeleton while bypassing early embryonic effects. This approach will allow us to efficiently test candidate molecules in vivo.

Elektroporation von Craniofacial Mesenchym

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Fluoreszenz-basierte Messung von Calcium-Shop-Eintrag in lebenden Zellen: aus kultivierten Krebszelle zu Skelettmuskelfaser

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

Visualisierung von Craniofacial Entwicklung in den sox10: kaede transgener Zebrafische Zeile mit Zeitraffer-konfokale Mikroskopie

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial for homeostatic control of physiological processes that include: protein, DNA and RNA synthesis, vesicular trafficking, cell growth and cell division. Alterations in cellular pH homeostasis can lead to detrimental functional changes and promote progression of various diseases2. Various methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of pH in the cytoplasm and in organelles. Here, we describe in detail a rapid and accurate method for the simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH by using confocal microscopy on living cells3. This goal is achieved with the use of two pH-sensing ratiometric dyes that possess selective cellular compartment partitioning. For instance, SNARF-1 is compartmentalized inside the cytoplasm whereas HPTS is compartmentalized inside endosomal/lysosomal organelles. Although HPTS is commonly used as a cytoplasmic pH indicator, this dye can specifically label vesicles along the endosomal-lysosomal pathway after being taken up by pinocytosis3,4. Using these pH-sensing probes, it is possible to simultaneously measure pH within the endocytic and cytoplasmic compartments. The optimal excitation wavelength of HPTS varies depending on the pH while for SNARF-1, it is the optimal emission wavelength that varies. Following loading with SNARF-1 and HPTS, cells are cultured in different pH-calibrated solutions to construct a pH standard curve for each probe. Cell imaging by confocal microscopy allows elimination of artifacts and background noise. Because of the spectral properties of HPTS, this probe is better suited for measurement of the mildly acidic endosomal compartment or to demonstrate alkalinization of the endosomal/lysosomal organelles. This method simplifies data analysis, improves accuracy of pH measurements and can be used to address fundamental questions related to pH modulation during cell responses to external challenges.

Several methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH. Here, we describe in detail a rapid and accurate methodology to simultaneously measure cytoplasmic and vesicular pH by ratiometric imaging of living cells.

Gleichzeitige pH-Messung in endozytischen und Cytosolic Fächer in lebenden Zellen mittels konfokaler Mikroskopie

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

4D Microscopy of Yeast

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments in yeast are dynamic, and a full understanding of their properties requires time-lapse imaging. Multi-color 4D confocal fluorescence microscopy is a powerful method for tracking the behavior and composition of an intracellular compartment on a time scale of 5-15 min. Rigorous analysis of compartment dynamics requires the capture of thousands of optical sections. To achieve this aim, photobleaching and phototoxicity are minimized by scanning rapidly at very low laser power, and the pixel dimensions and Z-step intervals are set to the largest values that are compatible with sampling the image at full resolution. The resulting 4D data sets are noisy but can be smoothed by deconvolution. Even with high quality data, the analysis phase is challenging because intracellular structures are often numerous, heterogeneous, and mobile. To meet this need, custom ImageJ plugins were written to array 4D data on a computer screen, identify structures of interest, edit the data to isolate individual structures, quantify the fluorescence time courses, and make movies of the projected Z-stacks. 4D movies are particularly useful for distinguishing stable compartments from transient compartments that turn over by maturation. Such movies can also be used to characterize events such as compartment fusion, and to test the effects of specific mutations or other perturbations.

This protocol describes the analysis of fluorescently labeled intracellular compartments in budding yeast using multi-color 4D (time-lapse 3D) confocal microscopy. The imaging parameters are chosen to capture adequate signals while limiting photodamage. Custom ImageJ plugins allow labeled structures to be tracked and quantitatively analyzed.

4D-Mikroskopie der Hefe

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are strategically interposed in the path of the lymphatic vessels, allowing intimate contact of tissue antigens with all resident immune cells in the LN. Thus, understanding the cellular composition, distribution, location and interaction using ex vivo whole LN imaging will add to the knowledge on how the body coordinates local and systemic immune responses. This protocol shows an ex vivo imaging strategy following an in vivo administration of fluorescent-labeled antibodies that allows a very reproducible and easy-to-perform methodology by using conventional confocal microscopes and stock reagents. Through subcutaneous injection of antibodies, it is possible to label different cell populations in draining LNs without affecting tissue structures that can be potentially damaged by a conventional immunofluorescence microscopy technique.

This protocol describes a technique to image different cell populations in draining lymph nodes without alterations in the organ structure.

Visualisierung der Lymphknotenstruktur und Zelllokalisierung mittels Ex-Vivo Konfokalmikroskopie

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Analyzing the &alpha;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. Despite the development of multiple differentiation protocols, the generation of iPSC cardiomyocytes resembling an adult-like phenotype remains challenging. One major aspect of cardiomyocytes maturation involves the formation of a well-organized sarcomere network to ensure high contraction capacity. Here, we present a super resolution-based approach for semi-quantitative analysis of the &#945;-actinin network in cardiomyocytes. Using photoactivated localization microscopy a comparison of sarcomere length and z-disc thickness of iPSC-derived cardiomyocytes and cardiac cells isolated from neonatal tissue was performed. At the same time, we demonstrate the importance of proper imaging conditions to obtain reliable data. Our results show that this method is suitable to quantitatively monitor the structural maturity of cardiac cells with high spatial resolution, enabling the detection of even subtle changes of sarcomere organization.

Analyzing the &amp;#945;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

The formation of a proper sarcomere network is important for the maturation of iPSC-derived cardiomyocytes. We present a super resolution-based approach that allows for the quantitative evaluation of the structural maturation of stem cell derived cardiomyocytes, to improve culture conditions promoting cardiac development.

Analyse des α-Actinin-Netzwerks in humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten mittels Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. ...