Wir danken Mark Terasaki für Erstberatung mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop, um lokale Gewebeschäden, Kathy Joubin um Rat Halterung für Zeitraffer-Imaging und der Sagasti und Portera-Cailliau Labors für Diskussionen zu schaffen. Erste Versuche wurden von AS als Grass Foundation Fellow am Marine Biological Labs in Woods Hole, MA durchgeführt. Die Arbeit im Labor war Sagasti durch Zuschüsse aus dem Whitehall-Stiftung, die Klingenstein Foundation, und ein Burroughs Wellcome Fund Career Award in den biologischen Wissenschaften unterstützt.

Teil 1: Montieren Zebrafischembryonen für langfristige Bildgebung <ol><li> Bereiten Sie 1% niedrig schmelzende Agarose-Lösung für die Einbettung. Lösen Sie Agarose in DI-Wasser durch Erhitzen in der Mikrowelle, Aliquot in kleine Röhrchen und lagern in einem Heizblock bei 42 Grad Celsius. </li><li> Wählen Embryonen für die Bildgebung und entfernen ihre Chorion durch leichtes Ziehen des Chorion auseinander mit einer Pinzette. Embryonen können in eine 5% PTU Ringers Lösung bei 22-24 Stunden nach der Befruchtung (HPF) platziert werden, um die Bildung von Pigment zu hemmen. Dies verbessert die Klarheit der Bildgebung und ist essentiell für die Durchführung der Zwei-Photonen axotomies sensorischer Axone. Wenn das natürliche Pigment zu bilden erlaubt ist, verdeckt Autofluoreszenz Axone über die Zwei-Photonen-Mikroskop. Ringers Lösung für Zebrafisch enthält 116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, und 5 mM HEPES, pH 7,2. </li><li> Anesthetize Embryonen, die durch Zugabe von ~ 0,02% Tricaine der PTU Ringers. Stellen Sie sicher, Tiere sind nicht ansprechbar, bevor Sie fortfahren berühren. </li><li> Bereiten Sie die langfristige Bildgebung Kammer durch Anlegen von Vakuum Fett auf der einen Seite einer Glas-oder Teflon-Ring und Fixieren auf ein Deckglas. </li><li> Transfer eines Embryos in die 42 Grad Agarose-Lösung mit einer Glaspipette, dabei nicht zu viel von der PTU Ringers zu übertragen, dann Transfer des Embryos mit einem Tropfen Agarose auf eine vorbereitete Deckglas. </li><li> Position der Embryo wie gewünscht als die Agarose erstarrt. Denken Sie daran, dass die Bildgebung Kammer wird umgedreht, wenn Sie fertig sind, so dass das Deckglas wird die Oberseite werden. </li><li> Wenn Sie einen motorisierten Tisch und Bild mehrere Standorte auf einmal, wiederholen Sie die Schritte 1,4-1,6 für jeden Embryo. </li><li> Lassen Sie die Agarose vollständig erstarren, dann füllen Sie den Ring mit 0,02% Tricaine PTU Ringers. </li><li> Bewerben Vakuumfett auf die andere Seite des Rings (s), dann decken die Ring (e) mit einem Glasträger. Klappen Sie den verschlossenen Kammer (n) über. Diese Kammern können für die Bildgebung auf aufrechte oder inverse Mikroskope verwendet werden. </li></ol> Teil 2: Zwei-Photonen-Axotomie mit einem speziell angefertigten Zwei-Photonen-Mikroskop mit einer Chameleon Ti-Saphir-Laser <ol><li> Bereiten Sie für die Bildgebung. Setzen Sie den montierten Embryo (s) auf einem Objektträger-Halter unter dem Mikroskop. Konzentrieren Sie sich auf einen Embryo mit einem 40X (0,8 NA) Wasser Ziel. Schalten Sie den Laser. Wir konnten reproduzierbar zu visualisieren und zu Schäden GFP-exprimierenden Neuronen mit den folgenden Parametern. Zur Visualisierung Axone an einer nicht-schädigenden Kraft gesetzt Laser mit einer Wellenlänge von 910 Nanometern (nm) und einer Leistung von 30 Milliwatt (mW aufgeführt sind die Höhe der Leistung bei der Probe). Öffnen Sie die Imaging-Software. Wir verwenden scanimage Software in Karel Svoboda Labor 2, 3 entwickelt. </li><li> Drücken Sie den Fokus auf den Embryo mit der Zwei-Photonen-Laser-Scan, suchen Sie das Axon Sie wollen axotomize und Aufnehmen eines Bildes dieses Axon. Markieren Sie die erste und die letzte Z-Positionen, erwerben Sie das Bild, und eine maximale Projektion der Z-Stapel. </li><li> Zoom in 70X auf dem Ast des Axons Sie wollen axotomize und aufhören zu scannen. Erhöhen Sie die mW an der Probe, um die schädlichen Leistung von 180 mW, und führen Sie einen einzigen Scan mit dem Laser. Wir tun dies, indem die Anzahl der Z Scheiben auf 1 und drücken Sie &quot;Grab&quot;. Dies sollte ausreichen, um das Axon zu durchtrennen. Siehe die Diskussion für Methoden, um diesen Vorgang für Ihr Mikroskop und experimentelle Ziel zu optimieren. </li><li> Zoom, verringern Sie die Leistung auf 30 mW und der Aufnahme eines Bildes. </li></ol> Teil 3: Zwei-Photonen-Axotomie am Zeiss 510 konfokalen / Zwei-Photonen-Mikroskop <ol><li> Ort montiert Embryo auf die Bühne und bringen sie in den Fokus mit einem 25X Wasser objektiven oder einem anderen geeigneten Ziel. </li><li> Schalten Sie die Zwei-Photonen-(910 nm) und Argon (488 nm) Laser in einem Multi-Track-Einstellung, so dass es möglich ist, von einem zum anderen wechseln. Obwohl beide Laser verwendet werden, um GFP erkennen, ist die Zwei-Photonen-Emissions visualisiert mit roten, und der Argon-Laser-Emission mit grüner, die beiden zu unterscheiden. </li><li> Verwenden Sie den Argon-Laser zu einem Axon zu verletzen identifizieren. Unter Z-Einstellungen markieren Sie die erste und die letzte optische Schnitte. Werfen Sie einen konfokalen Bild und schaffen eine maximale Projektion der Z-Stack. </li><li> Wählen Sie die Region des Axons verletzt zu sein und bringen diese Region in den Fokus. Schalten Sie den Argon-Laser und schalten Sie den Zwei-Photonen-Laser. Scan der Probe mit der Zwei-Photonen in einem Laser-Intensität von ~ 9% Transmission um sicherzustellen, dass das Axon noch im Fokus ist. </li><li> Klicken Sie auf die &quot;Stop&quot;-Taste, so dass die Ernte-Tool zur Verfügung stehen. Verwenden Ernte heranzoomen auf den Bereich von Interesse. Normalerweise haben wir auf ~ 70X (Zoom kann im Rahmen der &quot;mode&quot;-Reiter kontrolliert werden) Zoom. Unter dem Reiter &quot;Kanäle&quot; ändern die Intensität der Zwei-Photonen von ~ 9% Transmission zu 15-20% Transmission. </li><li> Um sever ein Axon aktivieren Sie die &quot;schnellen XY&quot;-Taste für ca. 1 Sekunde und drücken Sie die Stopp-Taste, um überschüssige Schäden zu vermeiden. Das Axon ist als verstreute Trümmer zu sehen, wenn das Verfahren gearbeitet. </li><li> Um sicherzustellen, dass das Axonbeschädigt wurde wieder auf das 488 nm Argon-Laser, nehmen Sie ein anderes konfokale Abbildung, und erstellen Sie eine maximale Projektion. </li></ol> Teil 4: Konfokale Zeitraffer-Imaging am Zeiss LSM 510 <ol><li> Bereiten Sie für die Bildgebung. Wenn Sie mit einem beheizten Stadium befinden, sollten Sie es auf mindestens 30 Minuten einschalten, bevor die Einrichtung Ihres Zeitraffer-Film. Setzen Sie den montierten Embryo (s) auf einem Objektträger-Halter unter dem Mikroskop. Konzentrieren Sie sich auf einen Embryo mit den gewünschten Luft Ziel. Wir verwenden ein 20X, 0,5 NA Ziel. Öffnen Zeiss LSM 510 Imaging-Software. Schalten Sie auf den entsprechenden Laser und richten Sie die gewünschte Konfiguration. Wir beschreiben jetzt ein detailliertes Protokoll für die langfristige Bildgebung mit Zeiss LSM Multi Time Software. Diese Methoden können für die Verwendung auf Ihrem eigenen Mikroskop mit Ihrer Bildbearbeitungssoftware angepasst werden. </li><li> Definieren Sie die Position und die Konfiguration Ihrer ersten Embryo in der Multi Zeitfenster. Öffnen Sie die Scan-, Bühnen-und Multi Zeitfenster. Aktivieren schnellen Scan auf dem Scan-Fenster. Bewegen Sie die Bühne, um die gewünschte XY-Position. Markieren Sie die erste und die letzte Z-Positionen in der Scan-Fenster. Drücken Sie Stop, dann Mid, auch in das Scan-Fenster. Warten Sie, bis der Scan der Mitte Z Scheibe zu beenden, drücken Sie die markierte Position in der Bühne Fenster. Wenn Sie nur Bildgebung ein Embryo sind, auf der &quot;Single Location&quot;-Tab klicken Sie in der Multi Zeitfenster. Klicken Sie auf &quot;Ersetzen XYZ&quot; und dann auf &quot;Save Configuration&quot;. Zustimmen, wenn gefragt, um die vorherige Konfiguration zu überschreiben. Gehen Sie auf 4,4 Schritt. Wenn Sie eine mechanisierte Bühne haben, können Sie sich mehrere Standorte zu Bild mehrere Embryonen. In diesem Fall sollten Sie die &quot;Multiple Locations&quot; tab vor der Festlegung der XYZ und Konfiguration für Ihren ersten Standort zu wählen. Auch immer sicherstellen, dass die Pull-Down-Menü direkt unter dem &quot;Multiple Locations&quot; Registerkarte auf Platz 1 ist, und dass die Pull-Down-Menü bei der Projektierung, sagt multi loc 1, bevor Sie klicken Sie auf Konfiguration speichern. </li><li> Definieren Sie die Position und die Konfiguration Ihres restlichen Embryonen in die Multi Zeitfenster. Suchen Sie Ihren nächsten Embryo, und drücken Sie dann schnell zu scannen, bewegen sich die Bühne in die gewünschte Position XY, und markieren Sie Ihre erste und die letzte Z-Positionen in der Scan-Fenster. Drücken Sie Stop, dann Mid, auch in das Scan-Fenster. Warten Sie, bis der Scan der Mitte Z Scheibe zu beenden, drücken Sie die markierte Position in der Bühne Fenster. Klicken Sie auf &quot;Ersetzen XYZ&quot;. Prüfen Sie, ob das Pull-Down-Menü direkt unter dem &quot;Mehrere Standorte&quot; auf die Registerkarte Standort 2 ist, und dass die Pull-Down-Menü in der Konfiguration Abschnitt multi loc 2 sagt, dann klicken Sie auf &quot;Save Configuration&quot;. Zustimmen, wenn gefragt, um die vorherige Konfiguration zu überschreiben. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die restlichen Embryonen. </li><li> Stellen Sie die Parameter für die Bildaufnahme in der Multi Loc Fenster. Wählen Sie die GR-GL-Option in der &quot;List of Blocks&quot; Abschnitt, und geben Sie dann die gewünschte Anzahl der Wiederholungen Gruppe. Dies ist die Anzahl, wie oft der konfokalen ein Bild an jedem Ort erwerben. Geben Sie die gewünschte Warteintervall im Abschnitt Parameter. Dies ist die Zeit, die von Anfang an von einem Imaging-Wiederholung zu Beginn der nächsten Wiederholung. Wählen Sie &quot;ZStackXY&quot; in der Konfiguration Abschnitt. Geben Sie Basisdateinamen im unteren Bereich. Klicken Sie auf &quot;Bild auswählen DB&quot; und wählen Sie Ihre mdb. Klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Optionen&quot;. Wählen Sie Ihre mdb Ordner temporäre Dateien zu speichern. Check &quot;zu halten endgültige Bild öffnen&quot;, &quot;save endgültige Bild&quot; und &quot;Mitte des z-Stapel&quot;. Wählen Sie warten Intervall. Klicken Sie auf OK, um die Optionen zu schließen. Klicken Sie auf &quot;Start time&quot;. Lassen Sie Multi Zeitfenster offen für die Dauer der Bildgebung. </li><li> Analysieren Sie Ihre Daten. Wenn der Zeitraffer-Imaging abgeschlossen ist, wird der Multi Time Software kompilieren alle temporären Dateien in eine zusammengefasste Datei für jeden Standort. Wenn Sie den Film stoppen, bevor es beendet ist möchten, müssen Sie auf &quot;Fertig stellen&quot; drücken, anstatt &quot;Stop&quot;, so dass eine Zusammenfassung erstellt werden. Die temporären Dateien und Zusammenfassung Dateien sollten automatisch an den bezeichneten mdb Ordner gespeichert werden. Von der LSM Software-Menü auf &quot;3D View&quot; klicken, dann &quot;Projektion&quot;. Mit Ihrer Zusammenfassung Datei im Pulldown-Menü ausgewählt wird, auf &quot;Apply&quot; klicken. Dies erzeugt maximale Projektionen der Z-Stack für jeden konfokalen Bild. Auf der LSM Software-Menü auf &quot;Datei&quot; klicken und dann &quot;Export&quot;. Speichern Sie die maximale Projektionen als eine Reihe von tif-Dateien. Sie können dann erstellen Sie einen Film aus der Reihe von tif-Dateien mit ImageJ oder QuickTime Pro. Axone in den LSM Bilder können in drei Dimensionen mit Bildanalyse-Software (zB Neurolucida aus MicroBrightfield), um detaillierte quantitative Informationen über Axon Morphologie erzeugen zurückverfolgt werden. </li></ol> Teil 5: Repräsentative Ergebnisse Ein erfolgreiches Experiment wird in eine genaue Darstellung der zellulären Dynamik Ergebniss von Axon Erholung von Verletzungen. Ihre Embryonen werden nach der Bebilderung gesund, ohne sichtbare Degeneration und eine starke Herzschlag. Die Axotomie sollte präzise Schäden führen, nur Durchtrennen des definierten Zweig der Axon. Es sollte keine Schäden am umliegenden Axonen und minimal Zelltod werden. Wir glauben, sehen wir den Tod eines einzigen Epidermiszelle direkt über die Website von Axotomie in ~ 50% der Experimente. Wenn Sie mehr Schaden zu beobachten, sollten Sie optimieren Ihre Zwei-Photonen-Protokoll wie in der Diskussion beschrieben.

<ol>
	<li>Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repulsive+interactions+shape+the+morphologies+and+functional+arrangement+of+zebrafish+peripheral+sensory+arbors.">Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors.</a> Curr Biol. 15, 804-814 (2005).</li><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2 (13), (2003).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Sacconi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multiphoton+nanosurgery+on+cortical+neurons.">In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons.</a> J Biomed Opt. 12, 050502-050502 (2007).</li><li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation.">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).</li><li>Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosurgery:+functional+regeneration+after+laser+axotomy.">Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432, 822-822 (2004).</li><li>Quinto-Su, P. A., Venugopalan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+laser+cellular+microsurgery.">Mechanisms of laser cellular microsurgery.</a> Methods Cell Biol. 82, 113-151 (2007).</li></ol>

Wir haben die Methoden beschrieben, um genau axotomize peripheren sensorischen Axonen und direkt zu beobachten Regeneration im lebenden Zebrafisch-Embryos verwendet. Langfristige Zeitraffer-konfokale Bildgebung in Zebrafisch kann verwendet werden, um viele Entwicklungsprozesse in vivo zu beobachten. Die Zwei-Photonen-Axotomie beschriebene Verfahren kann für viele verschiedene experimentelle Ziele modifiziert werden. Wir haben die gleiche allgemeine Verfahren zur gesamten Trigeminus sensorischen Neurons Zellkö...

two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafische sind seit langem verwendet, um die zellulären und molekularen Mechanismen der Entwicklung von Zeitraffer-Bildgebung des lebendigen transparent Embryo zu studieren. Hier beschreiben wir eine Methode zur Zebrafisch-Embryos für die langfristige Bildgebung montieren und zu demonstrieren, wie die Erfassung von Zeitraffer-Aufnahmen mit einem konfokalen Mikroskop zu automatisieren. Wir beschreiben eine Methode, um den kontrollierten, präzisen Schäden an einzelnen Zweigen der peripheren sensorischen Axone im Zebrafisch mit dem Schwerpunkt Kraft eines Femtosekunden-Laser auf einem Zwei-Photonen-Mikroskop montiert erstellen. Die Parameter für eine erfolgreiche Zwei-Photonen-Axotomie muss für jedes Mikroskop optimiert werden. Wir werden Zwei-Photonen-Axotomie sowohl auf custom built Zwei-Photonen-Mikroskop und einem Zeiss 510 konfokalen / Zwei-Photonen auf zwei Beispiele geben zu demonstrieren. Zebrafisch Trigeminus sensorischen Neuronen können in einer transgenen Linie, die GFP durch ein sensorisches Neuron spezifischen Promotor 1 angetrieben visualisiert werden. Wir haben diese Zebrafisch Trigeminus-Modell angepasst, um direkt zu beobachten sensorischen Axonregeneration in lebenden Zebrafisch-Embryonen. Die Embryonen werden betäubt mit Tricaine positioniert und in einem Tropfen Agarose als sie erstarrt. Immobilisierte Embryonen werden in einem bildgebenden Kammer mit Phenylthioharnstoff (PTU) Ringers gefüllt versiegelt. Wir haben festgestellt, dass Embryonen kontinuierlich in diesen Kammern werden für 12-48 Stunden abgebildet. Ein einziger konfokalen Bild wird dann erfasst, um die gewünschte Stelle des Axotomie bestimmen. Die Region von Interesse ist auf der Zwei-Photonen-Mikroskop durch die Abbildung der sensorischen Axone bei niedrigen, nicht-schädliche Macht entfernt. Nach dem Zoomen in die gewünschte Stelle des Axotomie, wird die Leistung erhöht und einen einzigen Scan des definierten Bereichs ist ausreichend, um das Axon zu durchtrennen. Mehrere Lage Zeitraffer-Imaging wird dann auf einem konfokalen Mikroskop direkt beobachten axonalen Erholung von Verletzungen gesetzt.

Watch this Scientific Journal Video about Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos at JoVE.com

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Montage Zebrafischembryonen für langfristige Bildgebung, Zwei-Photonen-Imaging-und Gewebe-Schaden Techniken und Zeitraffer-konfokale Bildgebung.

Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

two-photon-axotomy-time-lapse-confocal-imaging-live-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K Aufrufe.  University of California, Los Angeles. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Montage Zebrafischembryonen für langfristige Bildgebung, Zwei-Photonen-Imaging-und Gewebe-Schaden Techniken und Zeitraffer-konfokale Bildgebung.

Serie: Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Forschung

Biologie

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Live-Imaging von Zellbewegung und Aktin-Zytoskelett von einzelnen Neuronen und Zellen der Neuralleiste in Zebrafisch-Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Zwei-Photonen-Based Photoaktivierung in Live Zebrafischembryonen

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

Die Transplantation von GFP-exprimierenden Blastomeren für Live Imaging von Retinal und Entwicklung des Gehirns in Chimäre Zebrafischembryonen

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

Multicolor Zeitraffer-Imaging transgener Zebrafische: Visualisierung von Retinal Stammzellen durch gezielte Nervenzellen Ablation Activated

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Fluoreszenz-basierte Messung von Calcium-Shop-Eintrag in lebenden Zellen: aus kultivierten Krebszelle zu Skelettmuskelfaser

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

Verwendung von Zeitraffer-Mikroskopie zur Anoxie-induzierten Suspended Animation in Visualisieren<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryonen

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

Langfristige, High-Resolution Konfokale Zeitraffer Bildgebung<em&gt; Arabidopsis Cotyledon</em&gt; Epidermis während der Keimung

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

Visualisierung von Craniofacial Entwicklung in den sox10: kaede transgener Zebrafische Zeile mit Zeitraffer-konfokale Mikroskopie

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...