Unser Verständnis der Augenmorphogenese stammt aus früheren festen Gewebestudien. Diesen Studien fehlte es jedoch an Zell- und Gewebedynamik. MitHilfe von Zeitraffer-Imaging sind wir in der Lage, diesen gesamten Prozess zur Visualisierung und Analyse zu erfassen.
Unsere Methode, die sich die externe Entwicklung der optischen Klarheit von Zebrafischembryonen zunutze macht, die Live-Bildgebung erleichtert, und verwendet die konfokale Laserscanning-Mikroskopie, die auf den meisten Forschungscampussen leicht verfügbar ist. Forscher, die mit dieser Methode noch nicht ein paar Versuche und Irrtümer rechnen müssen, bevor sie einen verwendbaren Datensatz erhalten. Viele Schritte, insbesondere die Injektionen und das Einbetten, müssen gut gehen, um erfolgreich zu sein, also haben Sie Geduld.
Sobald der Zebrafisch zu brüten beginnt, während er 15 bis 20 Minuten wartet, um sicherzustellen, dass die Eier befruchtet werden, verwenden Sie eine P10-Pipette und P10-Mikroliterspitzen, um eine gezogene Glaskapillar-Mikroinjektionsnadel mit 2,5 bis 5 Mikrolitern der interessierenden RNA-Verdünnung zurückzuladen. Wenn die Eier fertig sind, verwenden Sie eine Transferpipette und ein Seziermikroskop, um die Eier vorsichtig in die Spritzform zu laden, und rollen Sie die Embryonen mit einer Zette so, dass die einzelne Zelle bei Bedarf sichtbar ist. Injizieren Sie dann alle Embryonen im Einzelzellstadium und zielen Sie auf die Zelle und nicht auf das Eigelb ab, um eine einheitliche Kennzeichnung des sich entwickelnden Embryos zu gewährleisten.
Etwa 11 Stunden nach der Befruchtung ein Aliquot von 1,6% niedriger Schmelzagarose in E3-Medium in einem 42-Grad-Celsius-Wärmeblock platzieren und mit einem Fluoreszenzmikroskop nach erfolgreich injizierten Embryonen mit einer Gesamthelligkeit von Blütenständen suchen. Zählen Sie die Somiten, um die Embryonen richtig zu inszenieren. 11 Stunden nach der Befruchtung sollten drei Somiten beobachtet werden.
Eine ideale Probe hat starke EGFP- und mCherry-Signale und befindet sich im richtigen Entwicklungsstadium. Legen Sie die Embryonen vor der Montage in eine mit Agar beschichtete Schale und entfernen Sie mit einer Zette den Chorion von jedem Embryo. Wenn alle Embryonen entkernt wurden, verwenden Sie eine Glasrollenpipette, um einen Embryo zu aspirieren.
Werfen Sie so viel E3 wie möglich aus, so dass der Embryo an der Spitze der Pasteur-Pipette aus Glas sitzt und lassen Sie den Embryo aus dem Wärmeblock in die Agaroseröhre fallen. Lassen Sie die Embryonen für einige Sekunden in die Agarose sinken, bevor Sie zusammen mit dem Embryo ein kleines Volumen Agarose absaugen, wobei darauf geachtet wird, dass der Embryo an der Spitze der Pipette bleibt. Werfen Sie den Embryo und die Agarose in ein Agarose-Tröpfchen in einer Glasbodenschale aus und verwenden Sie schnell, aber vorsichtig eine Zette, um den Embryo dorsal mit der Seite nach unten zu orientieren, bevor das Agarose-Tröpfchen aushärtet.
Nachdem Sie 10 bis 12 Embryonen auf die gleiche Weise montiert haben, fügen Sie genügend Agarose hinzu, um den Boden der Schüssel vollständig zu bedecken und alle Tröpfchen in einer einzigen Agarosescheibe zu umhüllen. Wenn die Agarose ausgehärtet ist, schichten Sie E3 über die Agarose, um die Proben hydratisiert zu halten. Nachdem Sie das laserscannende konfokale Mikroskop auf die entsprechenden Parameter für die Zeitrafferbildgebung gesetzt haben, beschichten Sie die Unterseite der Glasbodenschale großzügig mit einem Tauchmedium, das dem Brechungsindex des Wassers entspricht, achten Sie darauf, Luftblasen zu vermeiden, und tragen Sie einen kleinen Tropfen Tauchmedium auf das 40X-Wasserobjektiv auf.
Befestigen Sie die Glasbodenschale im Bühneneinsatz und fügen Sie zusätzliches E3-Medium hinzu, um die Embryonen über Nacht feucht zu halten. Verwenden Sie Modelliermasse, um den Kunststoffdeckel über der Schüssel zu versiegeln und das Ziel zu erhöhen, mit der Schüssel in Kontakt zu treten. Klicken Sie unter der Positionsüberschrift der Mikroskopsoftware auf Hinzufügen, um die XYZ-Informationen der ersten Probe zu speichern, die im Zeitraffer aufgefordert wurde, und wählen Sie eine Probe mit starker Fluoreszenz und optimaler Montage aus.
Suchen Sie auf der Registerkarte Suchen nach dem nächsten Beispiel, klicken Sie auf Position und Hinzufügen, um das Beispiel wie gezeigt auszuwählen. Wenn alle Beispiele ausgewählt wurden, markieren Sie die erste Position und klicken Sie auf Verschieben nach. Richten Sie beim kontinuierlichen Scannen das optische Vesikel innerhalb des Rahmens aus und lassen Sie viel Platz im vorderen und distalen Bereich relativ zum optischen Vesikel und Gehirn.
Um die ersten und letzten Z-Slices zuzuweisen, wählen Sie Set zuerst und Set Last, während Sie sich mit dem Feinfokusknopf durch die Z-Richtung bewegen, wobei eine Gesamtscheibenzahl von etwa 63 beibehalten wird, um das Wachstum des optischen Bechers aufzunehmen. Fügen Sie zusätzlichen Platz auf der ventralen Seite des optischen Vesikels ein, um Platz für Wachstum zu bieten. Sobald die ersten und letzten Z-Slices festgelegt wurden, klicken Sie auf C, um zur Mitte des Z-Stacks zu wechseln und die Laserleistung und -verstärkung für beide Laser anzupassen.
Wenn die Laserleistung und -verstärkung eingestellt wurden, stoppen Sie den Scanvorgang und klicken Sie auf Aktualisieren, um die Positionsinformationen zu aktualisieren. Um zur nächsten Position zu wechseln, klicken Sie auf Position zwei. Sobald sowohl das erste als auch das letzte Z-Slice wie demonstriert definiert wurden, öffnen Sie die Zeitreihenüberschrift und setzen Sie die Anzahl der Zyklen auf 300 und das Zeitintervall auf 2,5 Minuten.
Nachdem Sie die Einstellungen überprüft haben, um sicherzustellen, dass alles abgeschlossen ist, klicken Sie auf Start, um den Zeitraffer zu starten und zu bestätigen, dass die erste Bildrunde korrekt erfasst wurde, bevor Sie den Zeitraffer über Nacht laufen lassen. Für eine gleichmäßige Markierung und eine robuste Fluoreszenz ist eine direkte Injektion in die Einzelnezelle notwendig. Beim Eintauchen in Agarose sollten die Embryonen gleichmäßig in der schüssel verteilt sein.
Wenn die Embryonen korrekt inszeniert, ausreichend fluoreszierend und ausreichend montiert sind, verbleiben sie während des Zeitraffers im Bildrahmen, so dass das gesamte Organ abgebildet werden kann. Proben, die nicht entlang der Dorsalachse ausgerichtet sind, z. B. horizontale oder diagonale, wachsen im Laufe des Zeitraffers aus dem Bildrahmen heraus und können nicht für weitere Analysen verwendet werden. Ein Embryo, der überdreht wird, führt zu einem hinteren Zeitraffer.
Ein Unterrotiertes Embryo lässt nur das vorderste Gewebe beobachten. Darüber hinaus ergeben Proben, die in Bezug auf die Ausrichtung des Rahmens montiert werden, eher einen erfolgreichen Zeitraffer. Diese Verzerrung zur ventralen Seite bietet zusätzlichen Raum für das Gewebewachstum in ventraler Richtung, was zu einem optimalen Zeitraffer führt.
Wenn diese Kriterien nicht erfüllt sind, erfasst der Zeitraffer nicht mehr das gesamte 3D-Volumen des Gewebes, während es sich entwickelt, und kann nicht für weitere Analysen verwendet werden. Diese informationsreichen Datensätze können auf vielfältige Weise analysiert werden, einschließlich 4D-Zellverfolgung mit Zellgeschwindigkeits- und Trajektorienquantifizierungen, Zell- und Gewebevolumenmessungen sowie 3- und 4D-Visualisierungen.
