TLW wurde durch ein Marie-Curie-Fellowship International Eingehendes unterstützt. Diese Arbeit wurde auch von der Grundlagen institutionellen Förderung finanziert, Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) die Finanzierung und teilweise mit Unterstützung von Schwerpunktprogramm (SFB) 655 bis GK. Die Autoren bedanken sich bei Anne Karasinsky für die Pflege und Wartung aller in dieser Studie verwendeten Tiere und Odette Leiter, Susann Ruhwald, Fanny Böhme und Richard Wetzel für die Zellkultur und Mikroskopie Unterstützung danken.

1. Basic Setup und Vorbereitung von Kulturmedium <ol><li> Mindestens zwei Tage vor Beginn des Experiments vorbereitet Poly-D-Lysin (PDL) / Laminin beschichteten Platten für adhärente Monolayer-Kulturen. Zur Vorbereitung Wells / Kolben fügen Sie genug PDL (10 mg / ml in dH 2 O), um die Oberfläche und Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Lösung aus dem Gericht und dem Gericht waschen dreimal mit dH 2 O. An der Luft trocknen. In Laminin (5 mg / ml in kaltem DMEM: F12) und bei 37 ° C über Nacht. Entfernen Sie die Laminin und entweder die Platten sofort oder zu speichern mit dem Laminin bei -20 ° C, bis sie benötigt. </li><li> Bereiten feuerpolierte Pipetten mit &quot;mittel&quot; und &quot;klein&quot; Bohrungen durch rotierende Glaspasteurpipetten in einer Flamme, bis die Kanten abgerundet werden. Autoklav zu sterilisieren. </li><li> Am Tag der Präparation, bereiten Sie die entsprechende Menge an Kulturmedium durch Mischen Neural Basal Medium mit 2% B27, 1x Glutamax, 2 mg / ml Heparin, 50 Einheiten / ml Penicillin / Streptomycin, 20 ng / ml gereinigtem Maus-Rezeptor-Klasse epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und 20 ng / ml rekombinantem Rinder-Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF-2). Erwärmen des Kulturmediums auf 37 º C in einem Wasserbad. </li><li> Für die SVZ Dissoziation vorzubereiten 0,05% Trypsin-EDTA und 0,125 mg / ml Trypsin-Inhibitor, enthaltend 0,01 mg / ml DNaseI. Äquilibrieren dieser Lösungen auf 37 ° C </li><li> Eine Dissektionsmikroskop Set und bereiten die notwendigen Werkzeuge, um das Gehirn (Schere und kleinen Spatel) zu entfernen und für SVZ und der GD Dissektionen (Skalpell, 27 G-Nadel auf 1 ml Spritze befestigt, 1 x Nr. 7 Zange, 1 x # 5/45 Zange) durch Eintauchen in 70% Ethanol. </li></ol> 2. Die Ernte der erwachsenen Maus Brains und SVZ / DG Mikrodissektionen <ol><li> Anesthetize einzelnen Erwachsenen (8 Wochen alt)-Mäusen nach den entsprechenden Richtlinien des Instituts. Führen Genickbruch. </li><li> Sprühen Sie den Kopf mit 70% Ethanol, um den Bereich zu sterilisieren und die Menge von Pelz zu minimieren, dass eindHères der Schere und Gehirn. Mit einer scharfen Schere enthaupten das Tier an der Basis des Hirnstamms. </li><li> Halten Sie den Kopf an der Basis des Schädels, schneiden Sie den Schädel zwischen den beiden Riechkolben, indem Sie ein Blatt eines kleinen Schere in jede Augenhöhle und Schneid koronal. Als nächstes stellen zwei seitliche Schnitte an der Basis des Schädels, gefolgt durch einen Längsschnitt durch den Schädel entlang der Pfeilnaht. Vorsicht: sicherzustellen, dass der Winkel der Schere so flach wie möglich zu beschädigen die zugrunde liegende Gehirn ist. </li><li> Setzen Sie das Gehirn durch den Schädel zurück Peeling entweder mit der Klinge der Schere oder einem Paar von gebogenen Pinzette. Befreie das Gehirn aus dem Schädel mit einem kleinen Spachtel und Ort in kaltes PBS. </li><li> Spülen mit PBS Gehirn, Blut und Fell zu entfernen. </li><li> Übertragen Gehirn zu einer 10 cm Kunststoffpetrischale mit PBS </li><li> Zeigen Petrischale mit dem Gehirn unter einem Binokular bei geringer Vergrößerung und die Position der brain auf der Bauchseite. Mit feinen gebogenen Pinzette entfernen Sie die Riechkolben, während das Gehirn hält in Position durch das Kleinhirn. </li><li> Drehen Sie das Gehirn auf den dorsalen und mit einem Skalpell einen koronalen Schnitt durch das Gehirn auf der Ebene des Chiasma </li><li> Um die SVZ microdissect (detaillierte Anleitung dazu finden Sie auch Azari et al. 10), legen Sie den rostralen Teil des Gehirns, so dass der Schnitt koronalen Oberfläche nach oben zeigt und sich das Mikroskop auf eine höhere Vergrößerung. Entfernen und Entsorgen der Scheidewand mit feinen gebogenen Pinzette. </li><li> Präparieren Sie die SVZ (die dünne Schicht um den Ventrikel Gewebe), indem Sie die Spitze einer Klinge von einer feinen gebogenen Pinzette in der lateralen Ecke des lateralen Ventrikel unmittelbar unter dem Corpus callosum und den anderen etwa 1 mm in das Gewebe sofort angrenzend an den Ventrikel. Drücken Sie die Zange in Richtung der Basis der Schale und in Richtung der ventralen Aspekt der ventrkel, eine kleine dreieckige Stück Gewebe zu entfernen. Legen Sie die seziert SVZ in eine Petrischale auf Eis. </li><li> Um die DG microdissect (detaillierte Anleitung dazu finden Sie auch Hagihara et al. 11), legen Sie die Schwanz Teil des Gehirns, in der Petrischale und entlang der Längsspalte mit einem Skalpell geschnitten. </li><li> Unter einem Dissektionsmikroskop, entfernen Sie das Kleinhirn und Zwischenhirn mit einer Pinzette. </li><li> Refocus das Mikroskop, so dass die Ränder um das DG sind nun sichtbar. Um den Gyrus dentatus zu entfernen, führen Sie die Spitze einer 27 G-Nadel und entlang der Grenze zwischen der DG und Ammonshorn. Mit den feinen Pinzette, befreit das DG aus dem umgebenden Gewebe. </li></ol> 3. SVZ Gewebedissoziation <ol><li> Mince das Gewebe mit einem Skalpell für ca. 1 min bis keine großen Stücke bleiben. </li><li> Übertragen des zerkleinerten Gewebes mit einem 15-ml-Röhrchen mit 1 ml vorgewärmtes 0,05% Trypsin-EDTA und Inkubation für 7 min inein Wasserbad auf 37 ° C eingestellt </li><li> Um die enzymatische Reaktion zu stoppen, 1 ml Trypsin-Inhibitor enthält DNaseI und mischen Sie den Inhalt durch Schwenken des Rohres. </li><li> Pellet der Suspension durch Zentrifugation bei 300 g für 5 min und den Überstand verwerfen </li><li> Das Pellet in 1 ml Wachstumsmedium und distanzieren sich ausdrücklich von sanft und Abpipettieren ca. 7-10x mit einem P1000 Pipette. Vorsicht: über Verreiben kann zu erhöhten Zelltod führen und sich negativ auf die nachfolgenden Zellwachstum auswirken. </li><li> In Wachstumsmedium auf ein Gesamtvolumen von 5 ml und übergeben die Zellsuspension durch ein 40-mm-Sieb, um Schmutz und undissoziierten Gewebeklumpen zu entfernen. </li><li> Zentrifuge bei 300 × g für 5 Minuten, Verwerfen des Überstandes und Resuspendieren der resultierenden Pellets in 200 ml Wachstumsmedium. </li></ol> 4. DG Gewebedissoziation <ol><li> Hackfleisch das Gewebe unter Verwendung einer Skalpellklinge für etwa 1 min bis keine große Stücke bleiben und TransferPDD in vorgewärmtem Enzym-Mix (Papain 2,5 U / ml Dispase 1 U / ml DNase I 250 U / ml). Inkubation für 20 min bei 37 ° C, Mischen durch Umdrehen des Röhrchens alle 3-5 min. </li><li> Distanzieren das Gewebe mechanisch mit einer mittleren Bohrung, feuerpolierte, Pasteur-Pipette durch Auf-und Abpipettieren vorsichtig 10x. </li><li> Inkubation für weitere 10 min bei 37 ° C, Mischen durch Umdrehen des Röhrchens alle 3-5 min. </li><li> Weitere distanzieren das Gewebe mechanisch mit einer kleinen Bohrung, poliert Feuer Pasteur-Pipette durch Auf-und Abpipettieren vorsichtig 10x. </li><li> Zentrifugieren bei 130 × g für 5 min. </li><li> Entfernen des Überstandes und Resuspendieren des Pellets in 1 ml Pufferlösung (1x HBSS, 30 mM Glucose, 2 mM HEPES (pH 7,4), 26 mM NaHCO 3). Stellen Sie bis zu 10 ml mit Pufferlösung. </li><li> Zentrifugieren bei 130 × g für 5 min. </li><li> Überstand abnehmen und das Pellet in 5 ml 20% Percoll. (So ​​bereiten 90% Percoll, fügen Sie 4,5 ml 100% Percoll zu 0,5 ml 10x PBS verdünnen diese dann weiter auf 20%durch Zugabe von 1,1 ml 90% Percoll auf 3,9 ml 1x PBS). </li><li> Zentrifuge 450 g für 15 min. </li><li> Entfernen des Überstandes und Resuspendieren des Pellets in 10 ml Puffer. </li><li> Zentrifugieren bei 130 × g für 5 min. </li><li> Das Pellet in 200 ul Wachstumsmedium. </li></ol> 5. Erzeugung von adhärenten Monolayer-Kulturen <ol><li> Platte der dissoziierten SVZ oder DG Gewebe in einem einzigen PDL / Laminin Vertiefung einer 96-Well-Platte beschichtet und bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> Ungefähr 24 Stunden nach der Plattierung, wenn die Zellen an der beschichteten Oberfläche haftet, tauschen das Wachstumsmedium, um überschüssige Schmutz weiter zu entfernen. </li><li> Jeder weitere 3-4 Tage, Austausch Hälfte des Wachstumsmediums mit frischem Medium, um die Wachstumsfaktoren wieder aufzufüllen. </li><li> Wiederholen, bis die Zellen zu erreichen ca. 80% Konfluenz und sind bereit, agiert werden. Hinweis: die Zeit zwischen der Beschichtung und den ersten Durchgang kann bis zu 2-3 Wochen dauern. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 6. Die Passage von adhärenten Monolayer-Kulturen <ol><li> Wenn die Kulturen etwa 80% Konfluenz entfernen Sie das Medium aus dem Brunnen und waschen mit PBS. Hinweis: Nicht in die Zellen zu 90% Konfluenz überschreiten, da dies zur Ablösung von Zellen und Neurosphärenbildung und darüber hinaus führen, erhöhte Zelltod. </li><li> 50 ml Accutase und bei 37 ° C für 2-3 min (zu überprüfen, ob die Zellen sind gerundet und Haus). </li><li> Entfernen Sie die Zellen in ein 15-ml-Tube und waschen das auch einmal mit PBS und Transfer in das gleiche Rohr. </li><li> Verdünnte Zellen mit 5 ml PBS und Zentrifuge 300 × g für 5 min. </li><li> Für den ersten Durchgang, verdünnten Zellen auf 1 ml und die Platte in eine PDL / Laminin Vertiefung einer 24-Well-Platte überzogen. </li><li> Für die folgenden Passagen, Die Zellen in 200 ml Wachstumsmedium und Zahl mit einer Zählkammer. Teller mit 1 x 10 4 Zellen / cm 2 in der entsprechenden Größe und beschichtete oder Kolben. </l<html> i&gt; </ol> 7. Differenzierung von adhärenten Monolayer-Kulturen <ol><li> Die anhaftenden Monolayer-Kulturen, Platte proliferierenden Zellen auf PDL / Laminin beschichteten Deckgläschen in einer Dichte von 1 x 10 4 Zellen / cm 2 in Wachstumsmedium mit 20 ng / ml EGF und 10 ng / ml bFGF unterscheiden. </li><li> Wenn die Zellen etwa 80% Konfluenz (in der Regel 2 Tage) zu erreichen, ersetzen Sie das Wachstumsmedium mit Medium mit 5 ng / ml bFGF und 0 ng / ml EGF. </li><li> Nach 2 Tage 5 ng / ml bFGF Ersetzen des Mediums mit Wachstumsmedium in Abwesenheit von beiden Mitogene für weitere 3 Tage Anmerkung:. Während dieser Zeit eine signifikante Menge an Zelltod auftritt. </li><li> Nach insgesamt 5 Tage, waschen Sie die differenzierten Zellen mit PBS auf tote Zellen zu entfernen, dann fix mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Wieder mit PBS waschen, um alle PFA und speichern Deckgläser in Bohrlöchern in 1 ml PBS bei 4 ° C entfernen </li></ol>jove_title &quot;&gt; 8. Neurosphäre, Kultur und Quantifizierung <ol><li> Verdünnt das dissoziierte SVZ oder DG Gewebe von einem Tier in 20 ml Kulturmedium und der Platte 200 ml / Vertiefung in eine 96-Well-Platte unter Verwendung einer 10 ml Pipette Multidoser. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 6-7 Tage SVZ abgeleiteten Neurosphären und 10-12 Tage für DG abgeleiteten Neurosphären. Hinweis: Wachstum für mehr als diese empfohlenen Inkubationszeiten in Überwucherung führen und den Zelltod in der Mitte der Neurosphären und / oder spontane Anhaftung und Differenzierung führen. </li><li> Graf und messen den Durchmesser der Neurosphären mit einem Okular-Strichplatte in eine aufrechte Lichtmikroskop montiert </li></ol> 9. Passagieren der Neurosphären Nachdem die primären Neurosphären wurden gezählt und ihre Größe aufgezeichnet sie über mehrere Passagen beginnen entweder mit einem einzelnen oder einer Neurosphäre Groß Kultur erweitert werden. <ol><li> Massenkultur Neurosphäre Expansion <ol><li> Um Durchgang kombiniert Neurosphären als Massenkultur, entfernen Sie das Medium, das die Neurosphären von der Platte, Transfer in ein 15-ml-Tube und Zentrifuge bei 300 xg für 5 min. </li><li> Verwerfen des Überstandes und Resuspendieren der Neurosphären in 1 ml vorgewärmtes 0,05% Trypsin-EDTA und Inkubation bei Raumtemperatur für 3 min. </li><li> Gleiches Volumen von Trypsin-Inhibitor enthält DNaseI und gut mischen. </li><li> Zentrifuge für 5 min bei 300 g, der Überstand entfernt und 1 ml Wachstumsmedium. </li><li> Man reibt auf und ab etwa 10x mit einem P1000 Pipette, um die Neurosphären zu trennen. </li><li> Entfernen 10 ml der Zellsuspension und mit dem gleichen Volumen Trypanblau mischen und durchzuführen, eine Live-Zellzahl mit einer Zählkammer. </li><li> Reseed die Zellen in einer Dichte von 1 x 10 4 Zellen / cm 2 in der geeigneten Größe der Zellkultur gut oder Kolben. </li><li> Bei 37 ° Cmit 5% CO 2 bis sekundären Neurosphären bilden. </li></ol></li><li> Einzelneurosphäre Expansion <ol><li> Um einzelne Durchgang Neurosphären wählen Brunnen, die eine einzelne Neurosphäre enthalten und sorgfältig entfernen und entsorgen ca. 160 ul des Wachstumsmediums von jedem gut ohne die Neurosphäre zu stören. </li><li> 100 ml von 0,05% Trypsin-EDTA zu jeder Vertiefung zu agiert werden und bei Raumtemperatur für 3 min. </li><li> 100 l Trypsin-Inhibitor enthält DNAseI, um die Reaktion zu stoppen. </li><li> Man reibt etwa 10 mal nach oben und unten mit einer Pipette auf P200 brechen die Neurosphäre. </li><li> Übertragen Sie die 200 ml, der die dissoziierten Neurosphären zu einer neuen Vertiefung einer 24-Well-Platte mit 1,5 ml Wachstumsmedium. Bei 37 ° C mit 5% CO 2 bis sekundären Neurosphären bilden. Hinweis: Um langfristige Potenzial, einer der Kardinal Eigenschaften eines echten Nerven s bestimmenTEM-Zelle sollte Neurosphären für mindestens 5-10 Passagen agiert werden. Siehe auch die Literatur zum Teil umstrittene Interpretation solcher Ergebnisse 14.12. </li></ol></li></ol> 10. Differenzierung der Neurosphäre Kulturen Primär oder agiert Neurosphären unterschieden multipotentiality zu bestimmen. <ol><li> Neurosphären in Suspension entfernen von ihren Kulturplatte oder Kolben und sie auf einer 10 cm Petrischale aus Kunststoff. </li><li> Unter einem Dissektionsmikroskop entfernen ca. 15-20 Neurosphären aus dem Medium mit einer Pipette P20 und Transfer zu einer 24-Well-Platte, die die Kulturmedium ohne Wachstumsfaktoren und einer PDL / Laminin beschichteten Deckglas. </li><li> Differenzierung für etwa 7 Tage bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> Waschen Sie die differenzierten Neurosphären mit PBS auf tote Zellen zu entfernen, dann fix mit 4% PFA für 20 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Wieder mit PBS waschen rntfernen keine PFA und speichern Deckgläser in Bohrlöchern in 1 ml PBS bei 4 ° C </li></ol> 11. Immunfärbung von Neurosphäre und adhärenten Kulturen Hinweis: Für die Färbung mit dem Antikörper O4 weglassen Triton aus den Sperr-und Färbeschritte und denken Sie daran, eine geeignete IgM Sekundärantikörper zu verwenden. <ol><li> Inkubiere die Deckgläser mit den differenzierten Neurosphären oder adhärente Monolayer-Kulturen in Blockierungslösung (10% normalem Eselserum in PBS, enthaltend 0,2% Triton X-100) für 60 min bei Raumtemperatur. </li><li> Inkubation in frischem Blockierungslösung mit primären bIII-Tubulin, Map2a + b, saure Gliafaserprotein (GFAP) oder O4 Antikörper für 60min bei Raumtemperatur. </li><li> 3x Waschen mit PBS. </li><li> Inkubieren in frisch Blockierungslösung, die geeignete Fluoreszenz konjugierten sekundären Antikörpern und 4,6-Diamino-2-phenylindol (DAPI; 1:5000) für 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li&gt; mit PBS waschen dreimal. </li><li> Montieren Sie die Deckgläser auf Objektträger mittels Fluoreszenz-Eindeckmedium und an der Luft trocknen über Nacht im Dunkeln </li><li> Ansicht und Bild mit einem Fluoreszenzmikroskop. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieser Beitrag stellt ein ausführliches Protokoll für die Einleitung von neuralen Vorläufer Kulturen, sowohl als Monoschichten haft und Neurosphären, von den beiden großen neurogenen Regionen des adulten Gehirn der Maus. Es gibt eine Anzahl wichtiger Punkte, die, wenn versucht wird diesen beiden Kultursystemen gehalten werden müssen. Zum einen ist die Wahl der Dissoziation Verfahren sehr wichtig und ist gewebeabhängig. In unseren Händen, 0,05% Trypsin-EDTA sehr effektiv für die Dissoziation des SVZ Gewebe und führt zu einer höheren Anzahl von Neurosphären als bei Verwendung einer Papain-Spalttechnik basiert. Für die Dissoziation von DG Gewebe jedoch empfehlen wir dringend eine Papain-basierten Ansatz Dissoziation. Beim direkten Vergleich der beiden Methoden auf Dissoziation DG Gewebe beobachteten wir eine deutlich geringere Ausbeute der lebensfähigen Zellen und ca. 10-fach weniger Neurosphären bei der Verwendung von Trypsin. Dieser Unterschied in der Dissoziation kann durch den Unterschied in der Gewebe compositio seinn zwischen den beiden Regionen. Die kompakte Gewebe des DG ist durch umfangreiche Neuropil umgeben und umfangreiche Schäden zellulärer Prozesse während Dissoziation auftreten. Ein zweiter wichtiger Punkt ist, dass, während der Neurosphäre Assay kann sinnvoll sein, quantitative Aussagen über die Anzahl der Vorläuferzellen in einem bestimmten Gewebeprobe Gegenwart zu machen, einige Vorsicht ist jedoch bei der Interpretation dieser absoluten Zahlen verwendet werden. Fusion von Neurosphären kann ein wichtiger Störfaktor sein. Mehrere Studien haben gezeigt, dass Neuronen sind sehr beweglich und kann auch unter welche angeblich &quot;klonalen&quot; Bedingungen 7,19 verschmelzen. Die daraus resultierende Neurosphäre Frequenz kann sehr abhängig von Faktoren, einschließlich der mittelfristigen Komponenten, Verfahren der Präparation und der Dissoziation Prozess sein. Auch zwischen erfahrenen Hand gewisse Variation in der Anzahl der Neurosphären von angeblich identischen Proben erzeugt ist offensichtlich (siehe 1A.) Mehr nützlich, ist ein direkter Vergleich der Vorläuferfrequenz zwischen zwei gegebenen Proben (dh Steuer vs behandelt oder Wildtyp-vs-Knock-out) von der gleichen Person in einem einzigen Experiment behandelt, sondern als eine quantitative Aussage der Gesamt Vorläufer-Zellzahl. Bei der Entscheidung, welche der beiden Kulturverfahren am besten geeignet für ein bestimmtes Experiment ist es wichtig zu beachten, dass diese beiden Kultursysteme unterscheiden sich in der Homogenität der erzeugten Zelltypen. Im Vergleich zu vermehren adhärenten Zellkulturen, die eine ziemlich homogene Vorläuferzellpool (~ 98% der Zellen sind Sox2 +) zeigen 20 sind Neurosphären heterogener und enthalten sowie wuchernden Vorläuferzellen differenzierten Neuronen und Astrozyten 21,22. Es ist wichtig, dass die Neurosphären sind nicht für längere Zeiträume zwischen den Kanälen größer ist als die kultivierten Neurosphären werden, desto wahrscheinlicher ist es, um differenzierte Zelltypen in ihrem Kern zu finden. Wir initiieren traditionell adhärenten Mono neuralen Vorläuferkulturen aus dem DG Gewebe zwischen 5-8 Mäusen. Deshalb, wenn Sie versuchen, die adhärenten Monolayer-Kulturen von der DG oder SVZ von einem einzigen Mausklick zu etablieren, muss die Sorgfalt während der Gewebedissoziation Verfahren, um zu treffen, um übermäßigen Zelltod durch über Verreiben des Gewebes zu vermeiden, oder sich verlängert Zeit zwischen der Präparation und letzten Kultivierungsschritte. Dieses Protokoll beschreibt zum ersten Mal die Erzeugung von adhärenten Monovorläuferkulturen vor der SVZ und DG einzelner Tiere. Es gibt viele Fälle, in denen der Vergleich der Vorläufer Proliferation und Differenzierung muss auf einem einzigen Tier Basis erfolgen. Dazu gehören die Möglichkeit, direkt zu vergleichen, die DG und SVZ der einzelnen Tiere mit gepaart Statistiken und Daten zur Kultur mit individuellen Verhaltens-oder physiologische Daten 9 koppeln. Einzeltier Kulturen auch alNieder der Einsatz von transgenen Tieren selten, wo alterspass einen Pool von 5-8 Spendern pro Kultur nicht möglich ist, sowie einzigartige Tiere (zB F2 oder Kreuze aus gezüchteten Tieren) für genetische Assoziationsstudien.

A correction was made to <a href="/video/51225">One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice</a>. Many micro symbols were changed into milli symbols by accident: In the Protocols, sections 1.1, 1.3, 3.6, 3.7, 6.2, 6.6, 8.1, 9.1.6, 9.2.2, and 9.2.5 need to be fixed, as does Figure 1 description in the Results section.
Protocol section 1.1 was changed from:
At least two days prior to commencing the experiment, prepare Poly-D-lysine (PDL)/Laminin coated plates for adherent monolayer cultures. To prepare wells/flasks add enough PDL (10 mg/ml in dH2O) to coat the surface and incubate overnight at room temperature. Remove the solution from the dish and wash the dish three times with dH2O. Allow to air dry. Add Laminin (5 mg/ml in cold DMEM:F12) and incubate at 37 &#176;C overnight. Remove the Laminin and either use the plates immediately or store with the Laminin at -20 &#176;C until required.
to:
At least two days prior to commencing the experiment, prepare Poly-D-lysine (PDL)/Laminin coated plates for adherent monolayer cultures. To prepare wells/flasks add enough PDL (10 &#181;g/ml in dH2O) to coat the surface and incubate overnight at room temperature. Remove the solution from the dish and wash the dish three times with dH2O. Allow to air dry. Add Laminin (5 &#181;g/ml in cold DMEM:F12) and incubate at 37 &#176;C overnight. Remove the Laminin and either use the plates immediately or store with the Laminin at -20 &#176;C until required.
Protocol section 1.3 was changed from:
On the day of dissection, prepare the appropriate amount of culture medium by mixing Neural Basal Medium with 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 &#181;g/ml heparin, 50 units/ml Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml purified mouse receptor-grade epidermal growth factor (EGF), and 20 ng/ml recombinant bovine fibroblast growth factor (FGF-2). Warm the culture medium to 37 &#176;C in a water bath.
to:
On the day of dissection, prepare the appropriate amount of culture medium by mixing Neural Basal Medium with 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 mg/ml heparin, 50 units/ml Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml purified mouse receptor-grade epidermal growth factor (EGF), and 20 ng/ml recombinant bovine fibroblast growth factor (FGF-2). Warm the culture medium to 37 &#176;C in a water bath.
Protocol section 3.6 was changed from:
Add growth medium to a total volume of 5 ml and pass the cell suspension through a 40 mm sieve to remove debris and undissociated tissue clumps.
to:
Add growth medium to a total volume of 5 ml and pass the cell suspension through a 40 &#181;m sieve to remove debris and undissociated tissue clumps.
Protocol section 3.7 was changed from:
Centrifuge at 300 x g for 5 min, discard the supernatant and resuspend the resulting pellet in 200 ml growth medium.
to:
Centrifuge at 300 x g for 5 min, discard the supernatant and resuspend the resulting pellet in 200 &#181;l growth medium.
Protocol section 6.2 was changed from:
Add 50 ml Accutase and incubate at 37 &#176;C for 2-3 min (checking to see if the cells are rounded and detached).
to:
Add 50 &#181;l Accutase and incubate at 37 &#176;C for 2-3 min (checking to see if the cells are rounded and detached).
Protocol section 6.6 was changed from:
For subsequent passages, resuspend cells in 200 ml growth medium and count using a hemocytometer. Plate at 1 x 104 cells/cm2 in the appropriate sized coated well or flask.
to:
For subsequent passages, resuspend cells in 200 &#181;l growth medium and count using a hemocytometer. Plate at 1 x 104 cells/cm2 in the appropriate sized coated well or flask.
Protocol section 8.1 was changed from:
Dilute the dissociated SVZ or DG tissue from one animal in 20 ml of culture medium and plate 200 ml/well across a 96-well plate using a 10 ml multidoser pipette.
to:
Dilute the dissociated SVZ or DG tissue from one animal in 20 ml of culture medium and plate 200 &#181;l/well across a 96-well plate using a 10 ml multidoser pipette.
Protocol section 9.1.6 was changed from:
Remove 10 ml of the cell suspension and mix with an equal volume of trypan blue and perform a live cell count using a hemocytometer.
to:
Remove 10 &#181;l of the cell suspension and mix with an equal volume of trypan blue and perform a live cell count using a hemocytometer.
Protocol section 9.2.2 was changed from:
Add 100 ml of 0.05% Trypsin-EDTA to each well to be passaged and incubate at room temperature for 3 min.
to:
Add 100 &#181;l of 0.05% Trypsin-EDTA to each well to be passaged and incubate at room temperature for 3 min.
Protocol section 9.2.5 was changed from:
Transfer the 200 ml containing the dissociated neurosphere to a new well of a 24-well plate containing 1.5 ml of growth medium. Incubate at 37 &#176;C with 5% CO2 until secondary neurospheres form.
to:
Transfer the 200 &#181;l containing the dissociated neurosphere to a new well of a 24-well plate containing 1.5 ml of growth medium. Incubate at 37 &#176;C with 5% CO2 until secondary neurospheres form.
Figure 1 description was updated from:
Figure 1. Adult mouse precursor cells can be cultured as adherent monolayer cultures (A) or as neurospheres (B: SVZ, C: DG). Scale bar is 50 mm.
to:
Figure 1. Adult mouse precursor cells can be cultured as adherent monolayer cultures (A) or as neurospheres (B: SVZ, C: DG). Scale bar is 50 &#181;m.

A correction was made to <a href="/video/51225">One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice</a>. Many micro symbols were changed into milli symbols by accident: In Protocols, sections 1.1, 1.3, 3.6, 3.7, 6.2, 6.6, 8.1, 9.1.6, 9.2.2, and 9.2.5 need to be fixed, as does the Figure 1 description in Results.

Erratum: One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

Die Neurosphäre Assay 1,2 und die adhärenten Monolayer-Kultur 3,4, die beide in den frühen 1990er Jahren entwickelt, immer noch der Goldstandard in vitro neuronale Stammzellassays. In diesen Assays wird Primärgewebe Mikro von einer bestimmten Hirnregion seziert, dissoziiert in eine Einzelzellsuspension in Gegenwart von Mitogenen der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) und Fibroblastenwachstumsfaktor kultiviert-2 (FGF2) zu bilden, freischwimm Cluster (Neurosphären) oder adhärenten Monoschichten. Beide Systeme haben eine Reihe von Vor-und Nachteilen und reiflicher Überlegung sollte auf die Frage, die angesprochen werden, bevor eine oder das andere System gewählt wird, ist gegeben. Neurosphären ermöglichen eine einfache Auslesen der Unterschiede in der Vorläuferzellzahl und Potenzial. Darüber hinaus sind auch Neurosphären ein nützliches Werkzeug zur Festlegung der inneren Zellen zu untersuchen, wenn sie von ihrem normalen Außenumgebung entfernt. Extrinsic Signale können durch einfaches Hinzufügen der Faktor von Interesse in das Wachstumsmedium und zur Quantifizierung der Anzahl und Größe der erzeugten Neurosphären untersucht werden. Der Hauptnachteil der Neurosphären ist jedoch, dass sie ihre eigene Nische bilden, wobei die Zellen in der Mitte der Neurosphären (besonders großen Neurosphären) wobei differenzierter als die auf der Oberfläche 5. Neurosphären enthalten eine Mischung von Stammzellen, Vorläuferzellen gebunden und differenzierten Zellen und die Zell-Zell-Wechselwirkungen in den Neurosphären wirken der Wartung der Stammzellen. Deshalb Neurosphären enthalten nur eine geringe Anzahl von wahren Stammzellen 6-8. Adhärenten Monolayer-Kulturen bieten auch eine gute In-vitro-System, um in vivo die Proliferation zu modellieren. Adhärenten Kulturen, in denen die Zellen bleiben mehr getrennt und homogen ist, kann die heterogene Natur der Neurosphäre zu beseitigen. Unter diesen Wachstumsbedingungen die Vorläuferzellen vermehren rapidly und fast alle Zellen teilen und drücken die charakteristischen Marker Nestin neuralen Vorläufer, Sox2 und BLBP. Der Hauptnachteil der Monokultur-System im Vergleich zu der Neurosphäre Assay ist, dass einzelne Vorläufer abgeleitete Klone werden nicht beobachtet und quantifiziert werden. Ein Nachteil der meisten Protokolle für beide Arten von Kulturen war die Notwendigkeit, eine relativ große Anzahl von Tieren zu verwenden, da die Ausbeute der Isolation Strategien oft schlecht gewesen. Zur gleichen Zeit hat sich gezeigt, dass adulte Neurogenese trägt zur Individualisierung des Gehirns 9, was die Notwendigkeit für individuelle Ex-vivo-Modelle. Diese Bedürfnisse können durch &quot;One-Maus-ein-Kultur&quot; Protokolle wie in diesem Bericht beschrieben erfüllt werden. Die folgende Sicht Protokoll beschreibt die gleichzeitige Erzeugung von neuralen Vorläuferkulturen sowohl aus der SVZ und der GD der einzelnen Tiere entweder als haft monolayers oder als Neurosphären. Die Erzeugung von Kulturen von individuellen Tieren ist besonders nützlich, wenn Vergleiche zwischen den einzelnen behandelten Tier oder verschiedenen individuellen transgenen und Wildtyp-Mäusen erforderlich sind. Dieses Protokoll enthält detaillierte Anweisungen für die gleichzeitige Mikrodissektion der SVZ und der GD Regionen aus erwachsenen Mäusen, deren Dissoziation in einer Einzelzellsuspension, in-vitro-Kultur als entweder adhärenten Monolayer-Kulturen oder Neurosphären und Analyse von multipotentiality und langfristiges Potenzial, die zwei Kardinal Eigenschaften eines Knochen-fide-Stammzelle.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">CONSUMABLES</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">poly-D-lysine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P7280-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">laminin</td>
			<td style="width:179px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11243217001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">glass pastuer pipettes</td>
			<td style="width:179px;">Volac</td>
			<td style="width:119px;">BS5732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">DMEM:F12 (1:1) 1X</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">21331-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Neural Basal Medium (1X)</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">B27 supplements (50X)</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Glutamax</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Heparain</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Penacillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">EGF</td>
			<td style="width:179px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">bFGF</td>
			<td style="width:179px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">trypsin inhibitor</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">DNaseI</td>
			<td style="width:179px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Accutase</td>
			<td style="width:179px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">L11-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Papain</td>
			<td style="width:179px;">Worthington</td>
			<td>LS003120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Dispase</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Percoll</td>
			<td style="width:179px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">HBSS (with Calcium &#38; Magnesium)</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14025-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Glucose</td>
			<td style="width:179px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">X997.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">HEPES</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">K39347429847</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">1mL syringes&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">2016-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">27 Gauge needles</td>
			<td style="width:179px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">4657705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">scalpels (#22 disposable)</td>
			<td style="width:179px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">BA222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Dumont #7 forceps</td>
			<td style="width:179px;">FST&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Dumont 5/45 forceps</td>
			<td style="width:179px;">FST&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">scissors</td>
			<td style="width:179px;">FST&#160;</td>
			<td style="width:119px;">14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Iris spatula</td>
			<td style="width:179px;">FST&#160;</td>
			<td style="width:119px;">10093-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">70% ethanol</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">PBS</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td>14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">flasks/well plates</td>
			<td style="width:179px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;">92696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">PFA (4%)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">hemocytometer</td>
			<td style="width:179px;">Marienfeld</td>
			<td style="width:119px;">650010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">trypan blue (0.4%)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">NDS</td>
			<td style="width:179px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">TritonX-100</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse monoclonal bIII-tubulin antibody</td>
			<td style="width:179px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G712A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">rabbit polyclonal glial fibrillary acidic protein antibody</td>
			<td style="width:179px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">20334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">O4&#160;</td>
			<td style="width:179px;">R &#38; D systems</td>
			<td style="width:119px;">MAB1326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Map2a+b</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M1406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">donkey anti-mouse Cy3 antibody&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">715-505-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey anti-rabbit Alexa488&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Dianova</td>
			<td style="width:119px;">711-545-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">861405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Aqua Polymount</td>
			<td style="width:179px;">Polysciences Inc</td>
			<td style="width:119px;">18606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">10 ml Combi tips</td>
			<td style="width:179px;">eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">30089677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">plastic 10ml and 25mL serological pipettes</td>
			<td style="width:179px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">4488/4489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Pipetboy</td>
			<td style="width:179px;">Integra biosciences</td>
			<td style="width:119px;">521942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">multidoser pipette</td>
			<td style="width:179px;">eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">37C waterbath</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">dissecting microscope</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">37C:5%Co2 incubator</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">centrifuge</td>
			<td style="width:179px;">eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice

Die Neurosphären Assay und die anhaftende Monoschichtkultur-System sind wertvolle Werkzeuge, um das Potential (Proliferation oder Differenzierung) von adulten neuralen Stammzellen in vitro zu bestimmen. Diese Assays können verwendet werden, um das Potenzial der Vorläuferzellen von genetisch unterschiedlichen oder unterschiedlich behandelten Tieren isoliert zu vergleichen, um die Wirkung von exogenen Faktoren auf neurale Vorläuferzellproliferation und Differenzierung zu bestimmen und um neurale Vorläuferzelllinien, die auf kontinuierliche Passagen untersucht werden können, zu erzeugen. Die Neurosphäre Assay wird traditionell für die post-hoc-Identifizierung Stammzellen verwendet, vor allem wegen der mangelnden endgültigen Marker, mit denen sie von primärem Gewebe isoliert werden und hat den großen Vorteil, dass eine schnelle Schätzung der Vorläuferzellzahlen im Hirngewebe von einzelnen Tieren. Adhärenten Monolayer-Kulturen hingegen sind nicht traditionell verwendet, um die Proliferation zwischen den einzelnen Tieren zu vergleichen, Da jede Kultur wird im Allgemeinen aus dem kombinierten Gewebe zwischen 5-8 Tieren begonnen. Allerdings haben sie den großen Vorteil, dass, anders als Neurosphären, einer überwiegend homogenen Population von Vorläuferzellen bestehen, und sie sind nützlich für die nach der Differenzierung in einzelne Zellen. Hier beschreiben wir im Detail die Erzeugung von Neuro Kulturen und zum ersten Mal, adhärenten Kulturen einzelner Tiere. Das hat viele wichtige Auswirkungen einschließlich gepaart Analyse der Proliferation und / oder Differenzierungspotenzial sowohl in der Subventrikularzone (SVZ) und Gyrus dentatus (DG) der behandelten oder genetisch unterschiedlichen Mauslinien, sowie eine signifikante Reduktion in der Tiernutzung.

Obwohl die beiden neurogenen Regionen des adulten Maushirn enthalten beide neuralen Vorläuferzellen können diese Zellen sehr unterschiedlich verhalten, wenn sie in vitro kultiviert. Die adhärenten Monolayer-Kulturen von beiden Regionen erzielt erscheinen morphologisch (1A), aber die SVZ abgeleiteten adhärenten Kulturen vermehren sich schneller und müssen agiert werden im Durchschnitt 1-2 Tage früher als die von dem DG abgeleitet. Als Neurosphären, die SVZ abgeleiteten Vorläuferzellen schneller proliferieren und auch größer Neurosphären zu bilden (Fig. 1B) als die DG-abgeleiteten Vorläuferzellen (Fig. 1C). Während SVZ abgeleiteten Neurosphären werden in der Regel nach 6-7 Tagen in Kultur gezählt werden abgeleitet DG-Neurosphären in der Regel nach 10 bis 12 Tagen quantifiziert. Zusätzlich ist eine weit größere Anzahl von neuronalen Vorläuferzellen in der SVZ liegen im Vergleich zu der DG, wie durch die nahezu 10-fach höhere Anzahl von Neurosphären, die Gattungen sein kann bewiesenten aus der Region (SVZ: 1.173 ± 74,9 vs DG: 145,3 ± 26,4, p = &lt;0,0001, n = 10 Tiere pro Gruppe; 2A). Studien haben gezeigt, dass die Vorläuferzellen innerhalb des SVZ und DG reagieren auf verschiedene Reize. Die Vorläuferzellen in der DG durch bestimmte Typen von räumlichen Lernen und durch Reize wie Umwelt Anreicherung und Bewegung aktiviert, während die SVZ Vorläuferzellen werden durch Lernen und olfaktorische Geruchs Anreicherung aktiviert. In Übereinstimmung damit, einer von uns (TLW) zuvor gezeigt, dass die GD enthält eine Population von latenten Stamm-und Vorläuferzellen, die durch die Erregung aus 15-18 aktiviert werden können. Im Gegensatz dazu fanden wir, dass die SVZ Vorläuferzellen reagieren sehr unterschiedlich auf diesen Reiz, mit einer Abnahme der Neurosphäre Nummer in Reaktion auf depolarisierenden Stufen von KCl 17. Hier haben wir dieses Experiment wiederholt, Überzug Hälfte der isolierten Zellen aus der SVZ und der GD ind abgeleitetividual Tiere in depolarisierende Ebenen der KCl und die andere Hälfte in Steuer KCl Ebenen. Wir zeigen, wie früher, dass, während die DG-Vorläuferzellen werden durch Depolarisation (101,2 ± 17,4 vs 184,8 ± 12,5, p = 0,005, n = 5 Tiere) aktiviert ist, ist die Verbreitung der SVZ-abgeleiteten Zellen in der Tat deutlich gesunken ( 368,0 ± 62,9 vs 266,6 ± 41,6, p = 0,02, n = 5 Tiere; 2B). Um langfristige Potenzial, einer der Kardinal für einen wahren Stammzelle, Einzelneurosphären oder adhärenten Monolayer-Kulturen bestätigen muss in der Lage erweiterte Expansion dh über mindestens 10 Passagen sein. Bei jedem Durchgang nach der Herstellung einer Einzelzellsuspension, die Anzahl der Zellen wird gezählt, und die Falte Expansion berechnet. Die theoretische Gesamt Zelle wird dann durch Multiplikation des fache Expansion in diesem Durchgang durch die theoretische Gesamt aus dem vorherigen Durchgang berechnet. Dies ist disp<html> als Liniendiagramm mit der Anzahl Durchgang gelegt aufgetragen gegen den log10 der theoretischen Gesamtzellzahl (siehe Beispiel 3). Um multipotentiality bestätigen können beide Monolayer-Kulturen und Neurosphären durch Mitogen Rückzug differenziert und gezeigt Vorrücken in beiden Neuronen geben, und Glia (Abbildung 4). <img alt="Figur 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/51225/51225fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51225/51225fig1.jpg" /> .. Abbildung 1 Erwachsener Maus Vorläuferzellen können als adhärente Monolayer-Kulturen (A) oder als Neurosphären (: SVZ, C: B DG) kultiviert werden. Maßstabsleiste ist 50 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51225/51225fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> load/51225/51225fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51225/51225fig2.jpg &quot;/&gt; Abbildung 2. Deutlich mehr Neurosphären werden von der SVZ erzeugt im Vergleich zu der DG von einzelnen Mäusen (A). Die SVZ und die GD-Vorläuferzellen reagieren unterschiedlich auf die in-vitro-Depolarisation (B). <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51225/51225fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51225/51225fig3.jpg" /> 3. Um Langzeitpotenzierung bestätigen, werden Neurosphären über 10 Passagen erweitert. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51225/51225fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51225/51225fig4.jpg" /> Abbildung 4. Neurosphären kann in bIII-rohr differenziert werdenlin + Neuronen (A: rot), GFAP + Astrozyten (A: grün), O4 + Oligodendrozyten (B: rot) und MAP2ab + Neuronen (C: rot). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51225/51225fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a>

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One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

Hier beschreiben wir eine detaillierte Protokoll für die gleichzeitige Erzeugung von neuralen Vorläuferzellkulturen, entweder als Mono-oder haftNeuroSphären, aus der Subventrikularzone und Gyrus dentatus der einzelnen erwachsenen Mäusen.

Eine Maus, zwei Kulturen: Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus dem Zwei Neurogene Zonen der einzelnen Mäuse

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

one-mouse-two-cultures-isolation-culture-adult-neural-stem-cells-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

37.5K Aufrufe.  Technische Universität Dresden.  Hier beschreiben wir eine detaillierte Protokoll für die gleichzeitige Erzeugung von neuralen Vorläuferzellkulturen, entweder als Mono-oder haftNeuroSphären, aus der Subventrikularzone und Gyrus dentatus der einzelnen erwachsenen Mäusen. 

Serie: One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

Isolation und Expansion der erwachsenen Maus Neural Stem Cells mit dem Neurosphäre Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Forschung

Neurowissenschaften

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a well-characterized niche for adult stem cells1. This segment of the outer root sheath contains a number of different types of stem cells, including epithelial stem cells2, melanocyte stem cells3 and neural crest like stem cells4-7. Hair follicles represent an accessible and rich source for different types of human stem cells. We and others have isolated neural crest stem cells (NCSCs) from human fetal and adult hair follicles4,5. These human stem cells are label-retaining cells and are capable of self-renewal through asymmetric cell division in vitro. They express immature neural crest cell markers but not differentiation markers. Our expression profiling study showed that they share a similar gene expression pattern with murine skin immature neural crest cells. They exhibit clonal multipotency that can give rise to myogenic, melanocytic, and neuronal cell lineages after in vitro clonal single cell culture. Differentiated cells not only acquire lineage-specific markers but also demonstrate appropriate functions in ex vivo conditions. In addition, these NCSCs show differentiation potential toward mesenchymal lineages. Differentiated neuronal cells can persist in mouse brain and retain neuronal differentiation markers. It has been shown that hair follicle derived NCSCs can help nerve regrowth, and they improve motor function in mice transplanted with these stem cells following transecting spinal cord injury8. Furthermore, peripheral nerves have been repaired with stem cell grafts9, and implantation of skin-derived precursor cells adjacent to crushed sciatic nerves has resulted in remyelination10. Therefore, the hair follicle/skin derived NCSCs have already shown promising results for regenerative therapy in preclinical models.
Somatic cell reprogramming to induced pluripotent stem (iPS) cells has shown enormous potential for regenerative medicine. However, there are still many issues with iPS cells, particularly the long term effect of oncogene/virus integration and potential tumorigenicity of pluripotent stem cells have not been adequately addressed. There are still many hurdles to be overcome before iPS cells can be used for regenerative medicine. Whereas the adult stem cells are known to be safe and they have been used clinically for many years, such as bone marrow transplant. Many patients have already benefited from the treatment. Autologous adult stem cells are still preferred cells for transplantation. Therefore, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin/hair follicles are a valuable source for regenerative medicine.

This article presents a robust protocol for isolation and culture of neural crest stem cells from human hair follicles.

Isolation und Kultur von Neural Crest Stem Cells aus menschlichen Haarfollikeln

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

Erkennung von mikroregionale Hypoxie in Maus-Großhirnrinde Zwei-Photonen-Imaging von endogenen NADH Fluoreszenz

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the adult brain. However, the mechanisms these normally quiescent cells employ to ensure proper functioning of neural networks, as well as their role in recovery from injury and mitigation of neurodegenerative processes are little understood. These cells reside in regions referred to as &#34;niches&#34; that provide a sustaining environment involving modulatory signals from both the vascular and immune systems. The isolation, maintenance, and differentiation of CNS SCs under defined culture conditions which exclude unknown factors, makes them accessible to treatment by pharmacological or genetic means, thus providing insight into their in vivo behavior. Here we offer detailed information on the methods for generating cultures of CNS SCs from distinct regions of the adult brain and approaches to assess their differentiation potential into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes in vitro. This technique yields a homogeneous cell population as a monolayer culture that can be visualized to study individual SCs and their progeny. Furthermore, it can be applied across different animal model systems and clinical samples, being used previously to predict regenerative responses in the damaged adult nervous system.

Neural stem cells harvested from the adult brain are increasing utilized in applications ranging from the basic research of nervous system development to exploring potential clinical applications in regenerative medicine. This makes rigorous control in the isolation and culturing conditions used to grow these cells critical to sound experimental outcomes.

Wachsende neuronale Stammzellen aus konventionellen und Nonconventional Regionen der Volks Nagetier Gehirn

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result of chemical inputs to its synapses. However, neurons can also be excited by an imposed electric field. In particular, recent clinical applications activate neurons by creating an electric field externally. It is therefore of interest to investigate how the neuron responds to the external field and what causes the action potential. Fortunately, precise and controlled application of an external electric field is possible for embryonic neuronal cells that are excised, dissociated and grown in cultures. This allows the investigation of these questions in a highly reproducible system.
In this paper some of the techniques used for controlled application of external electric field on neuronal cultures are reviewed. The networks can be either one dimensional, i.e. patterned in linear forms or allowed to grow on the whole plane of the substrate, and thus two dimensional. Furthermore, the excitation can be created by the direct application of electric field via electrodes immersed in the fluid (bath electrodes) or by inducing the electric field using the remote creation of magnetic pulses.

Neuronal cultures are a good model for studying emerging brain stimulation techniques via their effect on single neurons or a population of neurons. Presented here are different methods for stimulation of patterned neuronal cultures by an electric field produced directly by bath electrodes or induced by a time-varying magnetic field.

Externe Anregung von Neuronen mittels elektrische und magnetische Felder in One- und Zweidimensionale Kulturen

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus der Maus subcallosa Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

Isolation und Kultur der embryonalen Maus neurale Stammzellen

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic mechanisms have been intensively studied. 5-hydroxymethylcytosine displays dynamic features during embryonic and postnatal development of the brain, plays a regulatory function in gene expression, and is involved in multiple neurological disorders. Here, we describe the detailed methods including immunofluorescence staining and&#160;DNA dot-blot to detect 5-hydroxymethylcytosine in cultured cells and brain tissues of mouse.

Here, we present a protocol to detect 5-hydroxymethylcytosine in cells and brain tissues, utilizing immunofluorescence staining and DNA dot-blot methods.

Der Nachweis von 5-Hydroxymethylcytosin in neuralen Stammzellen und Gehirnen von Mäusen

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal (P1&#8722;3) Mouse Neurogenic Niches

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including proliferation, self-renewal and multipotency. In the postnatal and adult brain, NSPCs are mainly present in two neurogenic niches: the subventricular zone (SVZ) lining the lateral ventricles and the subgranular zone of the hippocampal dentate gyrus (DG). The isolation of the neurogenic niches from postnatal brain allows obtaining a higher amount of NSPCs in culture with a consequent advantage of higher yields. The close contact between cells within each neurosphere creates a microenvironment that may resemble neurogenic niches. Here, we describe, in detail, how to generate SVZ- and DG-derived neurosphere cultures from 1&#8722;3-day-old (P1&#8722;3) mice, as well as passaging, for neurosphere expansion. This is an advantageous approach since the neurosphere assay allows a fast generation of NSPC clones (6&#8722;12 days) and contributes to a significant reduction in the number of animal usage. By plating neurospheres in differentiative conditions, we can obtain a pseudomonolayer of cells composed of NSPCs and differentiated cells of different neural lineages (neurons, astrocytes and oligodendrocytes) allowing the study of the actions of intrinsic or extrinsic factors on NSPC proliferation, differentiation, cell survival and neuritogenesis.

In this article, we describe, in detail, a protocol for the generation of neurosphere cultures from postnatal mouse neural stem cells derived from the main mouse neurogenic niches. Neurospheres are used to identify neural stem cells from brain tissue allowing the estimation of precursor cell numbers. Moreover, these 3D structures can be plated in differentiative conditions, giving rise to neurons, oligodendrocytes and astrocytes, allowing the study of cell fate.

Isolierung und Expansion von Neurosphären aus postnatalen (P1-3) Maus neurogenen Nischen

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including ...