The authors would like to acknowledge support from Spinal Cord Injury Ontario, the Ontario-China Research and Innovation Fund, the Toronto General and Western Hospital Foundation, and Physicians&#8217; Services Incorporated Foundation. The authors thank Dr. Tasneem Zahir for expert advice in human spinal cord NSPC culture, and Drs. Cindi Morshead and Iris Kulbatski for their expert advice in rat spinal cord NSPC isolation.

Alle Tierverfahren werden von der Animal Care Committee der Universität Health Network, Toronto ON Kanada zugelassen, in Übereinstimmung mit den Richtlinien im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durch die Canadian Council on Animal Care vorbereitet etabliert. Für die Ernte der menschlichen Rückenmarksgewebe, wurde die Genehmigung der University Health Network Research Ethics Verwaltungsrat und von der Trillium-Gift of Life Foundation, die Organspende in Ontario, Kanada beaufsichtigt erhalten. 1. Herstellung von Dissection Puffer und Kultur Medien <ol><li> Für die Isolierung von Rattenrückenmark, bereiten 100 ml Dissektion Puffer (1x PBS + 0,6% Glucose + 2% Penicillin-Streptomycin) und im Kühlschrank lagern. Für den menschlichen Rückenmark vorbereiten 100 ml Dissektion Puffer (1x HBSS + 0,6% Glucose + 2% Penicillin-Streptomycin) und im Kühlschrank lagern. </li><li> Vorbereitung 100 ml serumfreies Medium (SFM) und warm bei 37 ° C. Um SFM vorzubereiten, fügen Sie 2 mM L-Glutamin, 100 ug / ml Penicillin-Streptomycin, 2% B27 und 10% Hormon Mix Neurobasal-A-Medium. Hormon-Mix anzusetzen, stellen eine 1: 1 DMEM / F12-Medium, das 0,6% Glucose, 3 mM NaHCO 3, 5 mM HEPES, 25 ug / ml Insulin, 100 ug / ml Apo-Transferrin, 10 &amp; mgr; M Putrescin, 30 nM Selen, und 20 nM Progesteron. </li><li> Bereiten Sie die EFH Wachstumsfaktor-angereicherten Plattenmedien (zum SFM mit 20 ng / ml EGF, 20 ng / ml bFGF und 2 ug / ml Heparin) und warm bei 37 ° C. Stellen Sie sicher, dass die menschliche EFH enthält humanen rekombinanten Wachstumsfaktoren (siehe Tabelle der Materialien). </li></ol> 2. Holzernte und Dissektion der erwachsenen Ratte Periventrikuläre Rückenmarksgewebe <ol><li> Sterilisieren Sezieren Instrumente in Ethanol und spülen in steriler Kochsalzlösung oder Autoklav Instrumente im Voraus. Geben rat (6-8 Wochen alt) eine tödliche Injektion von Natriumpentobarbital (1 cc bei 65 mg / ml) oder Überdosierung von Narkose (dh 4% Isofluran) nach einem Institut des genehmigten Tier Protokoll. DOuse die Rückseite der Ratte mit 70% Ethanol und entfernen Sie die Haut an der dorsalen Oberfläche mit großen Dissektion Schere. </li><li> Halten der Schere senkrecht zur dorsalen Fläche quer geschnitten die Wirbelsäule über die Hinterbeine. Verwenden Sie kleinere Schere längs geschnitten die Rückenmuskel über der Wirbelsäule in einem rostral Richtung, um die Dornfortsätze aus. </li><li> Beginnend an der exponierten kaudalen Ende, legen Sie Rongeure oder eine kleine stumpfe Knochenschneidinstrument extradural in der lateralen Seite des Spinalkanals in den Raum zwischen dem Rückenmark und Wirbelsäule. Machen Sie kleine Schnitte in die Lamina (knöcherne Bogen nach links und rechts von den Dornfortsätzen auf jeder Seite der Wirbel) und vorsichtig abziehen der Lamina des Rückenmarks (1A-D) aus. Stellen Sie sicher, der Winkel der Flügel flach ist und parallel zu der Schnur so die zugrunde liegende Rückenmark nicht beschädigt wird. </li><li> Weiter Laminektomie im rostralen Richtung Ausstellungene die Brust- und Halsmark. </li><li> Auszuschneiden vorsichtig das Rückenmark von der Wirbelsäule mit stumpfen Pinzette Gewebe und Nutzung Mikroschere, sorgfältig zu trennen, die Wurzeln, um das Kabel zu lösen. Legen Sie die ausgeschnittenen Rückenmark in eine Petrischale mit 4 ° C sterile Ratten Dissektion Puffer (oben in 1.1 beschrieben). Spülen Sie das Gewebe in frisch zubereiteten 4 ° C Sezieren Puffer und mit einer Schere schneiden das Rückenmark in Querrichtung in 1 cm Segmente (1E). </li><li> Für jedes Segment des Gewebes, mit einer Hand, um das Gewebe mit einer feinen Pinzette zu halten. Mit der anderen Hand, verwenden Mikroschere, um vorsichtig die darüberliegenden Hirnhäute, weiße Substanz, und die meisten von der grauen Substanz mit Hilfe einer Binokular. Alternativ können Sie feinen Pinzette (Dumont # 4), die meisten der grauen und weißen Substanz abziehen, so dass nur die periventrikuläre Region des Rückenmarks, die das Ependym und eine kleine Menge des umgebenden grauen Substanz (1F-H) umfasst.</li><li> Pool Der seziert periventrikuläre Gewebe in eine 10 cm sterile Petrischale mit kaltem Ratte Dissektion Puffer. </li></ol> 3. Ernte und Dissektion der erwachsenen Menschen Periventrikuläre Rückenmarksgewebe Hinweis: Human Rückenmarksgewebe von erwachsenen Organtransplantation Spender geerntet (Spender waren im Alter von 2 bis 60 Jahre), nachdem die anderen Organe für Organtransplantation entfernt. Das Trillium-Gift of Life Programm erhält Zustimmung für die Entfernung von Gewebe für Forschungszwecke aus der Familie des Patienten und teilt unsere Ernteteam rechtzeitig, so dass wir in der Lage, um die Kabel innerhalb von 2 Stunden nach der Aorta Querspann ernten. Männlichen und weiblichen erwachsenen Spendern mit negativer Serologie und keine Infektionen werden akzeptiert. <ol><li> Ernte-Gewebe steril in den OP-Saal durch einen ventralen Zugang unter Verwendung der gleichen vorderen Exposition bereits für Organentnahme von der Orgel transp seziertlant Ernteteam. </li><li> Setzen die vordere Wirbelsäule durch Abfahren mit großen Rippenverteiler und große Paddel Retraktoren der übrigen Gewebe und Organe, einschließlich der großen Blutgefäße. </li><li> Verwenden eine Brustbeinsäge mit einer langen Klinge, um durch die Bandscheiben in den rostralen und kaudalen Enden der gewünschten Länge der Wirbelsäule geschnitten zu resezierenden montiert. Angle die Säge etwa 45 ° nach medial um eine dreieckige Trog von der Seitenteil der Wirbelkörper bis kurz vor den Wirbelkanal zu schneiden. </li><li> Entfernen Sie en bloc die medialen Aspekte der Wirbelkörper der gewünschten Segmente mit Hilfe von gekrümmten Osteotome und Hammer wobei darauf zu vermeiden, schneiden durch die Dura. Heben Sie dann vorsichtig die Dura gedeckt Rückenmark mit Zahnzange und scharf einzuschneiden rostralen und kaudalen Enden der Schnur. Verwenden Sie lange Schere und Pinzette auf bilateraler Ebene durchschneiden die einzelnen Wurzeln. </li><li> Legen Sie das ausgeschnittene Segment des Rückenmarks in 4 °; C sterile Puffer (1x HBSS + 0,6% Glucose + 2% Penicillin-Streptomycin) in einem großen Teströhrchen für den Transport zum Zellkulturraum. </li> <li> Hinweis: Im Allgemeinen wird eine 3-6 cm Segment des Rückenmarks von der oberen Brust- und / oder mittleren bis niedrigen Niveau des Brustraums wird im Operationssaal unter sterilen Bedingungen entfernt so schnell wie möglich nach Beendigung der Durchblutung und in kalten sterilen Puffer abgelegt . Die Zeit zwischen der Einstellung der Zirkulation und Entfernung des Rückenmarks verstrichenen Zeit variiert mit der Zeit, die erforderlich, um die gezielte Spenderorgane ernten und ist von 45 Minuten bis 2 Stunden reicht. Wenn das Herz und die Lungen wurden ebenfalls entfernt wurde, kann die Dissektion weit rostral genommen, um einen Teil des unteren Halsmark sowie zu ernten. </li><li> Sezieren des menschlichen Rückenmarksgewebe so bald wie möglich nach der Ernte in der Regel innerhalb von 3 Std. Entfernen Sie die Dura und andere Hirnhäute mit einer Pinzette. Spülen Sie die Rückenmarksgewebe in frisch zubereiteten 4 ° C Dissektion Puffer undSchnitt quer in 1 cm Segmente. </li><li> Mit Hilfe eines Binokular, Verbrauchs der darüberliegenden Hirnhäute, weiße Substanz, und die meisten von der grauen Substanz unter Verwendung von Gewebezange, feinen Pinzette und Mikroschere für jede Gewebesegment. Pool Der seziert periventrikuläre Gewebe, das Ependym und eine kleine Menge von umliegenden grauen Substanz, in eine sterile 10 cm Petrischale mit kaltem menschlichen Dissektion Puffer enthält. </li></ol> 4. Isolierung und Kultivierung von adulten Ratten und Human Spinal Cord NSPC <ol><li> Führen Sie folgende Schritte unter aseptischen Bedingungen in einer Steril. <ol><li> Blatt vor den seziert Ratte oder des Menschen periventrikuläre Gewebe in 1 mm 3 Stück mit Mikroschere. </li><li> Enzymatisch dissoziiert des zerkleinerten Gewebes mit proteolytischen Enzymen unter Verwendung des Papain-Dissoziierung Kit wie in der Tabelle von Materialien / Reagenzien angegeben. Hinweis: Reagenz Komponenten umfassen 4 Durchstechflaschen; Vial 1: Earles Balanced Salt Solution (EBSS), Vial 2: Papain mit deg L-Cystein und EDTA, Vial 3: Deoxyribonuclease I (DNase), Vial 4: Ovomucoid Proteaseinhibitor mit Rinderserumalbumin (BSA). Hinweis: Hinweis: Papain ist ein Sulfhydryl-Protease, die breite Spezifität für Proteinsubstrate hat. Die Papain hier wird aus dem Latex aus der Carica papaya Pflanze gewonnen und verschlechtert die meisten Proteinsubstraten umfangreicher als Pankreas-Proteasen. Während der Dissoziation Prozess gibt es einige Zellschäden verursachen DNA in die Dissoziation Medium, Viskosität zu erhöhen und machen Pipettieren schwierig erscheinen. Somit wird DNase in der Zellisolierungsverfahren eingeschlossen, um die DNA, ohne die intakten Zellen zu verdauen. Ovomucoide sind Glykoprotein-Protease-Inhibitoren verwendet, um die Papain-Aktivität nach der Dissoziation Schritt hemmen. </li></ol></li><li> Beim ersten Gebrauch rekonstituieren das Albumin Ovomucoid Inhibitormischung (Fläschchen 4) mit 32 ml EBSS (Flasche 1), und dann bei 4 ° C und verwenden Sie für die anschließende Isolierungen.Anmerkung: Dies ergibt eine Lösung mit einer wirksamen Konzentration von 10 mg Ovomucoid-Inhibitor und 10 mg Albumin pro ml. </li><li> 5 ml EBSS (Gefäß 1) zu einer Papain Fläschchen (Ampulle 2), wodurch man eine Lösung mit 20 Einheiten Papain / ml in 1 mM L-Cystein mit 0,5 mM EDTA. Prüfen, ob der Papain-Lösung klar erscheint, wenn vollständig gelöst ist, da sonst die Küvette in einem 37 ° C Wasserbad für 10 Minuten, bis das Papain vollständig gelöst ist, um volle Aktivität des Enzyms zu gewährleisten. </li><li> Fügen Sie 500 ul EBSS (Flasche 1) zu einer DNase Fläschchen (Fläschchen 3) und vorsichtig mischen, wie DNase ist empfindlich gegenüber Denaturierung zu scheren. Man 250 ul der DNase-Lösung in das Fläschchen, das die Papain, was zu einer Endkonzentration von etwa 20 Einheiten / ml Papain und 0,005% DNase. Speichern Sie die Balance des DNase Fläschchen für die spätere Verwendung. </li><li> Legen Sie die gehackte Ratte oder menschlichen Gewebe in der Papain-Lösung, wie in Schritt 4.4 oben hergestellt. Für das menschliche Gewebe Isolierung, teilen Sie die zerkleinerte Gewebe gleichmäßig zwischen zweiPapain Fläschchen (etwa 0,2 g / Fläschchen). </li><li> Inkubieren bei 37 ° C unter konstantem Rühren auf einer Schüttelplattform, um das Gewebe in der aktivierten Papainlösung dissoziieren. Inkubieren Rattengewebe für 45 min bis 1 h und menschlichem Gewebe für 1 bis 2 Stunden in Abhängigkeit von der Menge an zerkleinertem Gewebe, etwa 0,2 bis 0,4 g. </li><li> Verreiben des Gemisches mit einer 10 ml-Pipette, um alle verbleibenden Gewebestücke zu trennen, um eine trübe Zellsuspension zu ergeben. Übertragen der Zellsuspension (keine Stücke undissoziierten Tissues) in einen sterilen 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugiert bei 300 g für 5 min bei RT. </li><li> Resuspendieren der pelletierten Zellen in Medium, das Ovomucoid, eine Papain-Inhibitor. <ol><li> Vorbereiten des Ovomucoids durch Mischen von 2,7 ml EBSS (Gefäß 1) mit 300 ul des rekonstituierten Albumin-Ovomucoid-Inhibitor (Fläschchen 4) in einem 15 ml konischen Röhrchen. Fügen Sie 150 ul DNase-Lösung (Fläschchen 3) in Schritt 4.4 oben gespeichert. </li><li> Überstand verwerfen ausDie pelletierten Zellen und unmittelbar Zellpellet im verdünnten DNase albuminInhibitorGemisch. </li></ol></li><li> Separate intakten Zellen aus Zellmembranen durch Zentrifugation durch einen einzigen Schritt diskontinuierlichen Dichtegradienten. <ol><li> Vorbereitung der diskontinuierliche Dichtegradient durch Zugabe von 5 ml Albumin-Inhibitorlösung (Flasche 4) in ein 15 ml-Röhrchen und unter Verwendung einer 5 ml-Pipette vorsichtig und langsam Schicht der Zellsuspension (hergestellt wie oben in Stufe 4.8 beschrieben) auf der Oberseite das Albumin-Inhibitorlösung. </li><li> Zentrifugieren bei 70 × g für 6 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Anmerkung: Die Grenzfläche zwischen den beiden Schichten des Gradienten leicht sichtbar zu sein, aber nur minimale Vermischung an dieser Grenze wirkt sich nicht auf das Ergebnis. Membranfragmente verbleiben an der Grenzfläche und dissoziierte Zellen Pellet am Boden des Röhrchens. </li></ol></li><li> Für Rattenzellen, den Überstand verwerfen und Zellpellet in 1 ml Ratten EFH Medium (bei 37 ° C vorgewärmt).Graf Lebendzelldichte mit einem Hämozytometer und Platte die Zellen in einen T25 Kulturflaschen in einer Dichte von 10 Zellen / ul in EFH. Die typische Ausbeute an Zellen von Rattengewebe ist ungefähr 2 × 10 6 Zellen mit etwa 80% viability.If klonalen Kulturen erwünscht, Samenzellen in einer Dichte von weniger als 10 Zellen / ul. Die Kolben werden bei 37 ° C in 5% CO 2 und damit die Kulturen wachsen ungestört für 1 Woche, um die Aggregation von Kügelchen zu vermeiden. </li><li> Für menschliche Zellen, den Überstand verwerfen und Zellpellet in 10 ml menschlichen EFH Medium (bei 37 ° C vorgewärmt). Filtern der Zellsuspension durch ein 40 um Nylon Zellsieb anschließend mit 30 ml EFH Myelin und Zellmembranfragmente zu entfernen. Zentrifuge bei 300 × g für 5 Minuten und Resuspendieren des Zellpellets in 1 ml EFH Medium. </li><li> Graf Lebendzelldichte mit einem Hämozytometer und Platte die menschlichen Zellen in 6-Well-Kulturplatten in einer Dichte von 10 5 Zellen / Vertiefung in einem Gesamtvolumenvon 5 ml EFH / well. Die typische Ausbeute von Zellen, die aus menschlichem Gewebe beträgt ungefähr 1 × 10 6 Zellen mit ca. 70% Lebensfähigkeit. Vorstrich Vertiefungen mit einer haftenden Substrat, wie Matrigel (siehe Anmerkung unten). Verdünne in einem Verhältnis von 40 ul Matrigel: 1 ml SFM. </li><li> Anmerkung: Alternativ können andere adhärente Substrate, wie Poly-D-Lysin / Laminin, Fibronectin oder Kollagen verwendet werden. </li><li> Die Inkubation erfolgt bei 37 ° C in 5% CO 2 und damit die Kulturen für 1 Woche ungestört wachsen. </li></ol> 5. Passagieren von Adult Ratte und Mensch Rückenmark NSPC <ol><li> Rat NSPC werden kleine Neurosphären etwa 70 &amp; mgr; m im Durchmesser innerhalb 1 Woche nach anfänglichen Aussaat zu bilden; Passage Ratte NSPC wöchentlich durch das Sammeln der Zellsuspension, Zentrifugieren bei 300 xg für 5 min, und mechanisch Verreiben des Zellpellet, um die Neurosphären dissoziieren. </li><li> Samen der dissoziierten Zellen in T25-Kolben mit frischem Ratten EFH Medium. Alternativverwenden 50% konditioniert Ratte Medium für Passagieren. Die typische Ausbeute aus Ratten NSPC bei Passagierung etwa 5 x 10 6 Zellen, die exponentiell mit der Durchlaufhäufigkeit steigt. </li><li> Für die menschlichen Kulturen, eine Woche nach der ersten Beschichtung, ersetzen die Hälfte des Kulturmediums mit frischen EFH zweimal wöchentlich, um damit die Zellen an dem Substrat haften. Im Allgemeinen 1-2 Wochen später, wenn die Zellen an dem Substrat befestigt, ersetzen Sie das gesamte Volumen des Kulturmediums zweimal pro Woche mit frischen EFH. </li><li> Subculture Zellen vor Erreichen der Konfluenz zwischen 4 - 8 Wochen. <ol><li> Subkultur-Zellen durch Ablösen Zellen aus dem Substrat enzymatisch (siehe Tabelle der Materialien) mit 2 ml Enzym pro Well für ca. 10 min bei 37 ° C inkubiert. Sammeln Zellsuspension, Zentrifuge bei 300 xg für 5 min, und sanft Zellpellet in 1 ml frisch zubereitete EFH Medium. </li><li> Graf lebende Zellen mit einem Hämozytometer und Platte die Zellen in 6-Well-Kulturplatten (pre-coATED wie oben in Schritt 4.12) in einer Dichte von 10 5 Zellen / Well in einem Gesamtvolumen von 5 ml EFH / Vertiefung. Die typische Ausbeute an Human NSPC bei Passagierung etwa 2 x 10 6 Zellen und in der Regel wird dies mit dem Durchgang zu verdoppeln. Im Allgemeinen halten die Kulturen mit 50% konditioniertem Medium EFH 2-3 mal pro Woche zwischen Passagieren. </li></ol></li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

Während der Präparation des Rattenrückenmarksgewebe sollte darauf geachtet nicht zu beschädigen das Rückenmark während der Durchführung der Laminektomie werden. Es ist einfacher, die periventricular Gewebe zu isolieren, wenn die Rückenmarksegmente intakt sind. Die Gewebesegmente sollten in Dissektion Puffer vollständig eingetaucht werden, und die darüberliegenden Hirnhaut und weißen Substanz weg als Längsstreifen mit Mikroschere geschnitten werden. Alternativ können feine Gewebe-Zange benutzt, um die weiße...

NSPC sind multipotente Zellen in das neuronale Abstammungslinie, die sich selbst erneuern kann und leicht in vitro auszuweiten. Wir bezeichnen diese Zellen als eine gemischte Population von neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen, da sie Eigenschaften von sich selbst erneuernden multipotenten Stammzellen und Vorläuferzellen beschränkt anzuzeigen. NSPC sowohl in der fötalen und adulten Gehirn und Rückenmark 1,2 gefunden. Beim Erwachsenen sind NSPC normale ruhende und aufzuhalten, in bestimmten Nischen einschließlich der Subventrikularzone entlang der Seitenventrikel 2-4, und der periventrikulären Region um den Zentralkanal des Rückenmarks 5,6. Typischerweise werden NSPC als freischwebende Neurosphären oder als adhärente Monolagen in serumfreien Medium mit EGF und bFGF supplementiert, Mitogene, die für die Stammzellen / Vorläuferzellpopulationen durch kultiviert. Neurosphäre Assay ursprünglich von Reynolds und Weiss 2 entwickelt, wird am häufigsten verwendet, und die KulturErweitern neuralen Stammzellen. NSPC zeigen Multipotenz, wenn sie in Wachstumsfaktor-haltigen serumfreien Medium ausplattiert, sich in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. Multi kann selbst erneuernden NSPC isoliert und kultiviert werden vom erwachsenen Nager Rückenmarks, wenn das gezüchtete Gewebe umfasst Regionen des Zentralkanals 6,7. Ein potentieller Vorteil der Verwendung NSPC des Erwachsenen Rückenmark und nicht zur Erstellung Zellen aus anderen Regionen erzeugt ist, dass diese gewebespezifischen Zellen am ähnlichsten Zellen im Rückenmark, die verloren gehen oder beschädigt werden, nach einer Verletzung oder Krankheit. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Neurosphären aus adulten menschlichen Rückenmark abgeleiteten nicht langfristig vermehrt oder passagiert, um eine ausreichende Anzahl von Zellen 8,9 erzeugen. Jedoch mit Modifikationen in Kultivierungsbedingungen berichteten wir über die Ausdehnung und die Transplantation von adulten menschlichen Rückenmark stamm NSPC, was zeigt, dass selbst erneuerndenund multi NSPC aus erwachsenen menschlichen Rückenmark von Organtransplantation Spender 10 isoliert werden. In erster Linie die Entfernung des größten Teils der weißen Substanz bei der Präparation und Kultivierung dieser Zellen auf einem haftenden Substrat in Wachstumsfaktor-angereicherten Medium für proliferierende menschliche Wirbelsäule NSPC Erwachsenen gewählt. In diesem Protokoll beschreiben wir die Ernte des Rückenmarks von erwachsenen Ratte und aus menschlichen Organtransplantation Spender, Dissektion der periventrikuläre Gewebe und der Isolierung, der Kultur und den Ausbau der NSPC.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#10010023</td>
			<td>Dissection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X HBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#14175095</td>
			<td>Dissection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># G-6152</td>
			<td>Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#15140-148</td>
			<td>Dissection buffer and culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal-A&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#10888-022</td>
			<td>Culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine, 200mM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#25030-081</td>
			<td>Culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#12587010</td>
			<td>Culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#11885084</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#21700-075</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># S-5761</td>
			<td>Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#H9136</td>
			<td>Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#I-5500</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#T-2252</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># P7505</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selenium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#S-9133</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P-6149</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF, mouse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#E4127</td>
			<td>Prepare 100 &#956;g/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF, human recombinant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#E9644</td>
			<td>Prepare 100 &#956;g/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF, human recombinant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#F0291</td>
			<td>Prepare 100 &#956;g/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin, 10000U</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#H3149</td>
			<td>Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain dissociation kit</td>
			<td>Worthington Biochemicals</td>
			<td>#LK003150</td>
			<td>Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pentobarbital</td>
			<td>Bimeda &#8211; MTC Animal Health Inc</td>
			<td>DIN 00141704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps: Addisons</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#11006-12&#160;</td>
			<td>Serrated standard tip; micro-tip also available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps: Dumont #4</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#11241-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#15024-10</td>
			<td>Round-handled Vannas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeurs</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>N1430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mm Petri dishes&#160;</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Culture flasks</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m nylon cell strainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA21008-949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>CA73520-906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, growth factor reduced (100X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 &#956;l Matrigel: 1 ml SFM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of neural stem/progenitor cells from the periventricular region of the adult rat and human spinal cord

Erwachsenen Ratte und menschlichen Rückenmarks neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen (NSPC) in Wachstumsfaktor-angereicherten Medium kultiviert ermöglicht die Proliferation von multipotenten, selbst erneuernden und erweiterbar neuralen Stammzellen. Im Serum Bedingungen wird diese multi NSPC unterscheiden, Erzeugen Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. Das geerntete Gewebe wird enzymatisch in einer Papain-EDTA-Lösung dissoziiert und dann mechanisch dissoziiert und in einem diskontinuierlichen Dichtegradienten getrennt, um eine Einzelzellsuspension, die in Neurobasalmedium mit dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) ergänzt, basischen Fibroblastenwachstumsfaktor plattierende Ausbeute (bFGF ) und Heparin. Erwachsenen Ratte Rückenmark NSPC sind als freischwebende Neurosphären und menschlichen Rückenmark NSPC Erwachsenen kultiviert werden als adhärente Kulturen angebaut. Unter diesen Bedingungen Erwachsenen Rückenmarks NSPC proliferieren express Marker von Vorläuferzellen, und kann kontinuierlich beim Durchgang ausgedehnt werden. Diese Zellen können be suchten in vitro als Reaktion auf verschiedene Reize, und exogene Faktoren können verwendet werden, um Linienbeschränkung zu fördern, um neuronale Stammzelldifferenzierung zu untersuchen. Multi NSPC oder deren Nachkommen können auch in verschiedenen Tiermodellen transplantiert werden, um Wiederaufbaureparatur zu bewerten.

Erwachsenen Ratte Rückenmark-Zellen in Suspensionskultur in EFH Medium gezüchtet werden kleine Neurosphären (Kolonien von undifferenzierten Zellen) innerhalb 1 Woche nach anfänglichen Plattierung zu bilden. In Primärkulturen, die meisten Zellen ausplattiert sterben und Wachstumsfaktor-responsive Stammzellen proliferieren und werden in der EFH Medium ausgewählt. Durch den Durchgang 3, wird es zahlreiche frei schwebenden Neurosphären etwa 100 &amp; mgr; m im Durchmesser (2A) sein. Neurospheres sind...

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Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

Isolierung von Neural Stamm- / Vorläuferzellen aus dem Periventrikuläre Region der erwachsenen Ratte und Human Spinal Cord

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

isolation-neural-stemprogenitor-cells-from-periventricular-region

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.1K Aufrufe.  Toronto Western Research Institute and Krembil Neuroscience Center. The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors. 

Serie: Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

Isolierung und Expansion von mesenchymalen Stamm- / Stroma-Zellen aus humanen Placenta Gewebe gewonnen

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Isolation and Expansion of Adult Canine Hippocampal Neural Precursors

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural intermediacy between the rodent and human hippocampi, is therefore a valuable model in which to study adult neurogenesis. In vitro culture assays are an essential component of characterizing neurogenesis and adult neural precursor cells, allowing for precise control over the cellular environment. To date however, culture protocols for canine cells remain under-represented in the literature. Detailed here are systematic protocols for the isolation and culture of hippocampal neural precursor cells from the adult canine brain. We demonstrate the expansion of canine neural precursor cells as floating neurospheres and as an adherent monolayer culture, producing stable cell lines that are able to differentiation into mature neural cell types in vitro. Adult canine neural precursors are an underused resource that may provide a more faithful analogue for the study of human neural precursors and the cellular mechanisms of adult neurogenesis.

The canine brain is a valuable model in which to study adult neurogenesis. Presented here are protocols for isolating and expanding adult canine hippocampal neural precursor cells from primary brain tissue.

Isolierung und Expansion von adulten Canine Hippocampus Neural Precursors

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

Isolierung und Charakterisierung von mesenchymalen Stromazellen aus Nabelschnur und Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. Currently, efforts are being made to regenerate damaged cartilage with ex vivo expanded chondrocytes or bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs). However, the restricted viability and instability of these cells limit their application in cartilage reconstruction. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have received scientific attention as a new alternative for regenerative applications. With unlimited self-renewal ability and multipotency, hiPSCs have been highlighted as a new replacement cell source for cartilage repair. However, obtaining a high quantity of high-quality chondrogenic pellets is a major challenge to their clinical application. In this study, we used embryoid body (EB)-derived outgrowth cells for chondrogenic differentiation. Successful chondrogenesis was confirmed by PCR and staining with alcian blue, toluidine blue, and antibodies against collagen types I and II (COL1A1 and COL2A1, respectively). We provide a detailed method for the differentiation of cord blood mononuclear cell-derived iPSCs (CBMC-hiPSCs) into chondrogenic pellets.

Here, we propose a protocol for chondrogenic differentiation from cord blood mononuclear cell-derived human induced pluripotent stem cells.

Chondrogene Pelletbildung aus Cord Blut-induzierten induzierten pluripotenten Stammzellen

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and colleagues1. Later, others documented the existence of similar types of EPCs originating from bone marrow2,3. More recently, Yoder and Ingram showed that EPCs derived from umbilical cord blood had a higher proliferative potential compared to ones isolated from adult peripheral blood4,5,6. Apart from being involved in postnatal vasculogenesis, EPCs have also shown promise as a cell source for creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs7,8. Various isolation protocols exist, some of which involve the cell sorting of mononuclear cells (MNCs) derived from the sources mentioned earlier with the help of endothelial and hematopoietic markers, or culturing these MNCs with specialized endothelial growth medium, or a combination of these techniques9. Here, we present a protocol for the isolation and culture of EPCs using specialized endothelial medium supplemented with growth factors, without the use of immunosorting, followed by the characterization of the isolated cells using Western blotting and immunostaining.

The goal of this protocol is to isolate endothelial progenitor cells from umbilical cord blood. Some of the applications include using these cells as a biomarker for identifying patients with cardiovascular risk, treating ischemic diseases, and creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs.

Isolierung der endothelialen Vorläuferzellen aus menschlichen Nabelschnurblut

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and neurite outgrowth; and later stages characterized by axon/dendrite outgrowth and synapse formation. In neurodevelopmental disorders, often one or more of these processes are disrupted, leading to abnormalities in brain formation and function. With the advent of human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology, researchers now have an abundant supply of human cells that can be differentiated into virtually any cell type, including neurons. These cells can be used to study both normal brain development and disease pathogenesis. A number of protocols using hiPSCs to model neuropsychiatric disease use terminally differentiated neurons or use 3D culture systems termed organoids. While these methods have proven invaluable in studying human disease pathogenesis, there are some drawbacks. Differentiation of hiPSCs into neurons and generation of organoids are lengthy and costly processes that can impact the number of experiments and variables that can be assessed. In addition, while post-mitotic neurons and organoids allow the study of disease-related processes, including dendrite outgrowth and synaptogenesis, they preclude the study of earlier processes like proliferation and migration. In neurodevelopmental disorders, such as autism, abundant genetic and post-mortem evidence indicates defects in early developmental processes. Neural precursor cells (NPCs), a highly proliferative cell population, may be a suitable model in which to ask questions about ontogenetic processes and disease initiation. We now extend methodologies learned from studying development in mouse and rat cortical cultures to human NPCs. The use of NPCs allows us to investigate disease-related phenotypes and define how different variables (e.g., growth factors, drugs) impact developmental processes including proliferation, migration, and differentiation in only a few days. Ultimately, this toolset can be used in a reproducible and high-throughput manner to identify disease-specific mechanisms and phenotypes in neurodevelopmental disorders.

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs

Neurodevelopmental processes such as proliferation, migration, and neurite outgrowth are often perturbed in neuropsychiatric diseases. Thus, we present protocols to rapidly and reproducibly assess these neurodevelopmental processes in human iPSC-derived NPCs. These protocols also allow the assessment of the effects of relevant growth factors and therapeutics on NPC development.

Schnelle Erkennung von Entwicklungsstörungen Phänotypen in menschlichen neuronalen Vorläuferzellen (NPCs)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

Die Isolation und die Kultur der primären Epicardial Zellen aus menschlichen Erwachsenen und fetalen Herzens Exemplare

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally isolated and characterized from bone marrow (BM), then acquired from tissues including adipose tissue, synovium, skin, dental pulp, and fetal appendages such as placenta, umbilical cord blood (UCB), and umbilical cord (UC). MSCs are a heterogeneous cell population with the capacity for (1) adherence to plastic in standard culture conditions, (2) surface marker expression of CD73+/CD90+/CD105+/CD45-/CD34-/CD14-/CD19-/HLA-DR- phenotypes, and (3) trilineage differentiation into adipocytes, osteocytes, and chondrocytes, as currently defined by the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Although BM is the most widely used source of MSCs, the invasive nature of BM aspiration ethically limits its accessibility. Proliferation and differentiation capacity of MSCs obtained from BM generally decline with the age of the donor. In contrast, fetal MSCs obtained from UC have advantages such as vigorous proliferation and differentiation capacity. There is no ethical concern for UC sampling, as it is typically regarded as medical waste. Human UC starts to develop with continuing growth of the amniotic cavity at 4-8 weeks of gestation and keeps growing until reaching 50-60 cm in length, and it can be isolated during the whole newborn delivery period. To gain insight into the pathophysiology of intractable diseases, we have used UC-derived MSCs (UC-MSCs) from infants delivered at various gestational ages. In this protocol, we describe the isolation and characterization of UC-MSCs from fetuses/infants at 19-40 weeks of gestation.

Human umbilical cord (UC) can be obtained during the perinatal period as a result of preterm, term, and postterm delivery. In this protocol, we describe the isolation and characterization of UC-derived mesenchymal stem cells (UC-MSCs) from fetuses/infants at 19-40 weeks of gestation.

Isolierung und Charakterisierung der menschlichen Nabelschnur gewonnenen mesenchymalen Stammzellen aus Frühgeborenen und Kleinkindern Begriff

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

Generation von 3D Haut organoide aus Cord Blood-abgeleitete induzierte pluripotente Stammzellen

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a differentiation state to sustain demands of the blood formation. However, it has been difficult to analyze the metabolic status (mitochondrial respiration and glycolysis) of HSPCs due to their limited numbers and lack of optimized protocols for non-adherent, fragile HSPCs. Here, we provide a set of clear, step-by-step instructions to measure metabolic respiration (oxygen consumption rate; OCR) and glycolysis (extracellular acidification rate; ECAR) of murine bone marrow-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs. This protocol provides a higher amount of LSK HSPCs from murine bone marrow, improves the viability of HSPCs during incubation, facilitates extracellular flux analyses of non-adherent HSPCs, and provides optimized injection protocols (concentration and time) for drugs targeting oxidative phosphorylation and glycolytic pathways. This method enables the prediction of the metabolic status and the health of HSPCs during blood development and diseases.

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) transition from a quiescent state to a differentiation state due to their metabolic plasticity during blood formation. Here, we present an optimized method for measuring mitochondrial respiration and glycolysis of HSPCs.