Wir danken Drs.. Erez Eliyahu, Daniel Melamed, Ophry Pines und Doron Rapaport für Hilfe und Kommentare bei der Gründung dieses Protokolls. Diese Arbeit wird von der ISF (Grant-Nummer 1193-1109) finanziert.

1. Mitochondrien Reinigung Wiegen Sie das Pellet der Zellen. Etwa 0,6 g werden aus 100 ml Zellen erhalten. <ol><li> Wachsen 100-150 ml Hefezellen bei 30 OD 600 = 1-1,5 ° C auf einem Wachstumsmedium nichtfermentierbaren, wie Galactose-basierten Wachstumsmedium, um die für Mitochondrien zu bereichern. </li><li> Centrifuge Zellen bei 3.000 xg für 5 min bei Raumtemperatur und den Überstand verwerfen. </li><li> Wieder Waschen des Pellets mit doppelt destilliertem Wasser und Zentrifuge. Überstand verwerfen. </li><li> Das Pellet in 1 ml DTT-Puffer pro 0,5 g Zellen. Es ist wichtig, um die Zellen mit einem Reduktionsmittel, um die Disulfidbrücken innerhalb der Zellwand brechen zu behandeln, wodurch Hydrolyse zu verbessern. </li><li> Die Zellen für 10 min bei 30 inkubieren ° C unter leichtem Schütteln. Inzwischen wiegen 6 mg Zymolyase pro 1 g Zellen zu suspendieren und in Zymolyase Puffer. </li><li> Zentrifuge Zellen bei 3000 × g für 5 min eint Raumtemperatur und den Überstand verwerfen. </li><li> Das Pellet in 1 ml Puffer pro Zymolyase 0,15 g Zellen. Nicht mit dem Vortex. </li><li> Messen OD 600 von 10 &amp;mgr; l Aliquot der Zellen in 990 &amp;mgr; l Wasser. </li><li> Hinzufügen Zymolyase (Schritt 1.5), um die Zellen zu Glucosepolymeren auf die β-1 ,3-Glucan-Bindungen hydrolysiert und erzeugen Sphäroplasten. Von diesem Schritt sollte Sphäroplasten in einer isotonischen Lösung, um die Lyse zu vermeiden gehalten werden. </li><li> Zellen für 15 min Inkubation bei 30 ° C (für eine optimale Aktivität der Zymolyase) unter leichtem Schütteln. , Um eine Hydrolyse der Zellwand und Sphäroplasten Generation Verifizierung mischen 10 ul der Zellen mit 990 &amp;mgr; l Wasser. Sphäroplasten werden voraussichtlich durch osmotische Differenz lysieren, und die OD 600 sollte mindestens das 10-fache geringer ist als die im Schritt 1.9 bestimmt wird. Wenn nicht, weiterhin die Inkubation mit Zymolyase für weitere 15 min. </li><li> Zentrifuge Zellen bei 3000 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Dis vorsichtigKarte der Überstand, wie die Pellet könnte instabil sein. </li><li> Waschen Sie Spheroplasten mit Zymolyase Buffer und den Überstand verwerfen. </li><li> Resuspendieren Spheroplasten mit 100 ml Recovery-Medium. Übertragen Sphäroplasten in einen Erlenmeyerkolben und Inkubation für 1 Std. bei 30 ° C unter Schütteln. Diese Erholung Schritt ist notwendig, da bei der Behandlung Zymolyase Übersetzung wird verhaftet und mRNA-Lokalisierung ist gestört (Abbildung 1B). </li><li> Mit 0,1 mg / ml CHX und Transfer Sphäroplasten auf eine vorgekühlte 50 ml konischen Röhrchen. CHX hinaus ist wichtig, Verein Ribosomen &#39;mit mRNAs einfrieren. So wird Ribosomen-abhängigen mRNA Assoziation mit Mitochondrien gehalten. </li><li> Centrifuge Spheroplasten bei 3.000 xg für 5 min bei 4 ° C und den Überstand verwerfen. </li><li> Zweimal waschen mit kaltem Mannit Buffer. </li><li> Resuspendieren Spheroplasten mit 4 ml kaltem Puffer Mannit und sie auf einem Dounce Homogenisator von 15 ml Inhalt mit eng anliegenden ausgestattetStößel. Vorsichtig brechen Spheroplasten mit 15 Hüben und übertragen das Lysat auf eine 13 ml Tube. </li><li> Zentrifugieren des Lysats bei 1.500 × g für 6 Minuten bei 4 ° C pelletiert Kernen und aufgebrochene Zellen. </li><li> Vorsichtig den Überstand zu übertragen, um ein neues Röhrchen. Beiseite 1 ml (25%) der Probe als unfraktioniertes Probe (&quot;Total&quot;-Probe). Über 50 ml dieser Probe in ein neues Röhrchen und 15 ml 4X LSB für Western-Blot-Analyse. Niederschlag-RNA aus dem Rest der &quot;Total&quot;-Probe (siehe Protokoll Nr. 3, RNA Niederschlag). </li><li> Zentrifugieren des Überstands bei 10.000 × g für 10 min bei 4 ° C, um die Mitochondrien zu pelletieren. </li><li> Den Überstand (~ 3 ml) in ein neues Röhrchen und halten Sie es auf Eis. Dies ist die &quot;cytosolische&quot; Fraktion. Über 50 ml dieser Probe in ein neues Röhrchen und 15 ml 4x LSB für Western-Blot-Analyse. Niederschlag-RNA aus dem Rest der &quot;Cytosolic&quot; Probe (Siehe ProtOcol 3, RNA-Niederschlag). </li><li> Waschen des Pellets mit 3 ml Puffer Mannitol und Zentrifuge wieder bei 10.000 × g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Das Pellet mit 3 ml Mannit-Buffer. Dieses Beispiel enthält die Mitochondrien und als &quot;Mitochondrien&quot;-Fraktion. Über 50 ml dieser Probe in ein neues Röhrchen und 15 ml 4x LSB für Western-Blot-Analyse. </li></ol> 2. RNA-Extraktion <ol><li> In den jede Probe ein Volumen von 8 M Guanidinium-HCl und zwei Volumina 100% Ethanol. Vortex und Inkubation für mindestens 2 h bei -20 ° C. </li><li> Zentrifuge Proben bei 10.000 × g für 20 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen. Achten Sie darauf, wie das Pellet könnte instabil sein. </li><li> Mit 70% EtOH waschen des Pellets. </li><li> Das Pellet mit 400 ml RNase-freies Wasser zugeben und die Probe in ein neues Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Ausfällung der RNA wieder durch Zugabe von 0,1 Volumen 3 M Natrium-Acetate pH 5,2 und zwei Volumen 100% EtOH. Vortex und Inkubation für mindestens 2 h bei -20 ° C. </li><li> Zentrifuge Proben bei 20.000 × g für 20 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und waschen mit 70% EtOH. </li><li> Luft trocknen und das Pellet resuspendieren mit RNase-freiem Wasser. Shop-RNA-Proben bei -80 ° C. Die Proben können für die Northern-Analyse 19 oder 18 Mikroarray-Analyse (siehe Protokoll Nr. 3) verwendet werden. </li></ol> 3. Vorbereitung der RNA für die Microarray-Analyse <ol><li> Resuspendieren des mRNA aus Schritt 2.2 mit 650 ml RNase-freies Wasser. </li><li> Um jegliche Rest DNA oder Proteine ​​zu entfernen, fügen gleichen Volumen (650 ml) von saurem Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.7) und Vortex kräftig. Zentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit für 2 Minuten. </li><li> Übertragen 500 ml der oberen Phase (wässriger Phase) in ein neues Röhrchen. Vermeiden Sie, die Interphase, wie es DNA enthält. Seien Sie auch vorsichtig zu nehmen Phenol, die die reverse Transkriptionsreaktion hemmen können. &lt;/ Li&gt; <li> Die RNA-Probe eine signifikante Menge an Heparin, das ein potenter Inhibitor der reversen Transkriptase ist. So kann RT-PCR oder Mikroarray-Kennzeichnung es entfernt werden muss. Entfernen Heparin durch LiCl Niederschlag: add LiCl zu einer endgültigen Konzentration von 2 M und Heizen von Proben über Nacht bei -20 ° C. </li><li> Tauen Sie die Proben bei 4 ° C und Zentrifugation bei 20.000 × g für 20 min bei 4 ° C. </li><li> Vorsichtig den Überstand verwerfen und waschen das Pellet mit 80% Ethanol. Zentrifuge wieder wie in Schritt 3.5 beschrieben. </li><li> Überstand verwerfen, an der Luft trocknen und das Pellet in 150 ml RNase-freies Wasser. </li><li> Zum Entfernen Rest LiCl auszufällen erneut mit 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat pH 5,3 und 3 Volumina 100% Ethanol. Inkubation bei -20 ° C für mindestens 2 Stunden. </li><li> Zentrifuge bei Höchstgeschwindigkeit für 20 Minuten bei 4 ° C. Sorgfältig mit 80% Ethanol und Luft trocknen Waschen Sie die transparente Pellets. </li><li> Resuspendieren derPellet mit 25 ml RNase-freies Wasser und halten Sie die Proben bei -80 ° C. </li><li> Folgen Sie den Schritten für die RNA-Markierung und Hybridisierung in 18,20 beschrieben. </li></ol>

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Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Technologische Fortschritte in der Bildgebung hatte hohe Auflösung Tools ergab mRNA-Lokalisierung zu studieren. Heute kann man die Bewegung auch nur eines einzigen mRNA-Molekül auf der ms-Zeitskala von 23 bis 26 zu messen. Doch herkömmliche biochemische Methoden, wie das oben beschrieben wurde, sind auch informative und sind in einigen Fällen bevorzugt. Biochemische Isolierung ermöglicht die Reinigung eines großen Repertoires von mRNAs und Proteine, und ist daher bevorzugt für die Genom-weite Studien. ...

Eukaryotische Zellen sind in verschiedene Abteile mit spezifischen Funktionen organisiert. Um ihre Funktion zu erfüllen, enthält jedes Kompartiment einen einzigartigen Satz von Proteinen, die für seine Aktivität sind. Ein möglicher Mechanismus, durch den diese Proteine ​​ihre Raum zu nähern, ist durch lokalisierte Übersetzung 1,2. Bei diesem Verfahren wird das Protein an seinem Ziel durch Ribosomen und mRNAs, die dort angeordnet sind, synthetisiert. Unter den wahrscheinlichen Vorteile der lokalisierten Übersetzung erhöht Effizienz der Protein Targeting, verringert müssen für die Protein Chaperone und ermöglicht somit eine gezielte Regulationsmechanismen. Auch können lokalisierte mRNAs und Ribosomen eine abgelegene Reservoir der Translationsmaschinerie in Fällen von zellulären Stress, wenn allgemeine Übersetzung wird gesperrt sein. Mitochondrien wurde in den letzten Jahren ein zentrales Modell, um lokalisierte Übersetzung zu studieren. Mitochondrien sind die meisten Proteine ​​in den Zellkern, in das Cytosol übersetzt codiert,und in den Organellen importiert. Verschiedene Beweislinien zeigen an, dass viele dieser Proteine ​​werden durch einen lokalen Übersetzungsverfahren hergestellt. Zunächst erfasst Elektronenmikroskopie und biochemische Fraktionierung Studien Ribosomen mit 3-5 Mitochondrien verbunden. Diese Studien, in denen dann in vivo durch die Arbeit an spezifischen mRNAs, die gefunden wurden, nur in einer Art und Weise cotranslationalen 6,7 importiert werden bestätigt. Genomweite Assoziationsstudien von mRNAs mit Mitochondrien zeigten, dass ein signifikanter Anteil der mRNAs zu den Mitochondrien lokalisiert Bereich 8-10. Einige dieser mRNAs wurden durch in vivo Fluoreszenzverfahren, wie z. B. Fisch oder MTag 9,11 gekennzeichnet. Eine geradlinige Auslegung des Vereins ist, dass diese mRNAs dienen als Vorlagen für die lokale Übersetzung. Die Mechanismen, mit denen diese mRNAs nähern sich den Mitochondrien sind unbekannt. Nicht-kodierende Bereiche (die meisten significantly 3 &#39;UTR) wurde gezeigt, dass in der mRNA-Assoziation zu den Mitochondrien 12 beteiligt werden. Diese Domains sind wahrscheinlich als eine Bindungsstelle an RNA-bindende Proteine, die ihre Transport vermitteln zu dienen. Studien in Hefe gezeigt, dass ein Mitglied der Familie von Proteinen PUM (Puf3) unterstützt mRNA Assoziation mit Mitochondrien 8,13. Eine plausible Rolle Puf3, die auf Funktionen der anderen Familienmitglieder basiert, ist die Translation hemmen, während die mRNA ist auf dem Weg 14. Somit kann in einer nicht-translatierte mRNAs Zustand transportiert werden, die durch RNA-bindende Proteine, die mit nicht-kodierenden Regionen interagieren. Alternativ kann eine große Menge an Arbeit schlägt vor, dass der Transport stattfindet, während das Protein synthetisiert wird. Insbesondere wurden Übersetzung Inhibitoren gezeigt mRNAs beeinflussen Verband 8,13. Darüber hinaus übersetzt Features wie die AUG mitochondriale Targeting-Sequenz (MTS) oder ORF Regionen wurde gezeigt, dass in der Lokalisierung 8,11,15 unterstützen. Hsp70-Proteinfamilie chaperone und Protein-Rezeptor auf der äußeren Mitochondrien-Membran wurde auch gezeigt, unterstützt mRNA Assoziation, ferner impliziert, dass codierte Protein-Funktionen sind wichtig für die mRNA-Lokalisierung 16. Dies steht im Einklang mit einem Modell, in dem die Schwellenribosomenprotein dient als Erkennungselement für das Targeting mRNA-Ribosom-Protein-Komplex zu den Mitochondrien 17. Lokalisierten Übersetzungs nahe der Mitochondrien wurde durch verschiedene Verfahren, einschließlich Elektronenmikroskopie (Ribosomen sichtbar) 3, FISH 9, grün-RNA (mRNA spezifisch zu erkennen) 11, und biochemische Fraktionierung (sowohl RNA und Ribosomen erkennen) 10,18 sucht. Während die früheren Methoden erfassen Lokalisierung in vivo und können Visualisierung der Verkehrsdynamik zu ermöglichen, letzteres ermöglicht den Nachweis von verschiedenen mRNAs in einem einzigen Experiment. Außerdem für biochemische Fraktionierung Codierung oder nicht-kodierenden Bereiche brauchen nicht zu alNamen daher ihren jeweiligen Rollen ausgewertet werden. Biochemische Fraktionierung wurde erfolgreich seit vielen Jahren verwendet, für die Isolierung von verschiedenen zellulären Kompartimenten. Seine Prinzipien und Grenzen sind gut etabliert, und man kann den bestehenden Protokollen für verschiedene Zwecke leicht ändern. Die notwendige Instrumentierung ist in vielen Labors Standard, daher ist es in der Regel die erste Methode der Wahl für die Untersuchung intrazelluläre Lokalisation. Wir beschreiben ein Protokoll, das für die Isolierung von mRNAs optimiert wurde, während Ribosomen sind mit Mitochondrien assoziiert. Dieses Protokoll ist daher optimal für die Untersuchung Faktoren in der Nähe von Mitochondrien lokalisiert Übersetzung beteiligt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="969">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BactoPeptone</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Galactose</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;">Do not autoclave Galactose</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Growth medium</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;">For mitochondrial enrichment, you should use any non- fermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1 M TrisHCl pH9.4</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30 mM TrisHCl pH7.6</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;10 mM DTT Buffer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;">0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1.2 M Sorbitol</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">4 mM KH2PO4</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">16 mM K2HPO4</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.2&#956;m filter</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;">Zymolyase Buffer&#160;</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;">1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this&#160; buffer (0.2&#956;m) and keep at room temperature for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Zymolyase 20T&#160;</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;">20,000 U/gr</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recovery medium</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;">Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1 mg/mL Cycloheximide (CHX)</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.6 M Mannitol</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mM MgAc</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100 mM KCl</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.5 mg/mL Heparin</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Mannitol Buffer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;">0.6 M Mannitol, 30 mM TrisHCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/mL Heparin, 0.1 mg/mL CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">8M Guanidinium-HCl</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;100% and 70% Ethanol (EtOH)</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;3 M Sodium Acetate pH5.2</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;10 M LiCl stock solution</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250 mM Tris HCl pH 6.8</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SDS</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Glycerol</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromophenolblue</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">&#160;4xLSB</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;">250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% &#946;-mercaptoethanol and 0.02% Bromophenol blue</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dounce homogenizer of 15-ml capacity equipped with tight- fitting pestle</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mrnas associated with yeast mitochondria to study mechanisms of localized translation

Die meisten mitochondrialen Proteine ​​sind im Zellkern codiert und müssen in der Organelle eingeführt werden. Import auftreten können, während das Protein in der Nähe der Mitochondrien synthetisiert. Unterstützung für diese Möglichkeit wird von neueren Untersuchungen, in denen viele mRNAs mitochondriale Proteine ​​kodieren, wurden gezeigt, um in die Nähe Mitochondrien lokalisiert werden abgeleitet. Zusammen mit früheren Demonstrationen der Verein Ribosomen &#39;mit der äußeren Membran, legen diese Ergebnisse eine lokalisierte Übersetzungsprozess. Solche lokalisierten Übersetzung können Einfuhr Effizienz zu verbessern, bieten einzigartige Regelung Websites und Fälle von Eileiter Ausdruck zu minimieren. Wurden verschiedene Methoden verwendet, um die Faktoren und Elemente, die lokalisierte Übersetzung vermitteln zu charakterisieren. Norm unter diesen ist subzellulärer Fraktionierung durch differentielle Zentrifugation. Dieses Protokoll hat den Vorteil der Trennung von mRNAs, Ribosomen und Proteine ​​in einem einzigen Verfahren. Diese können dann durch verschiedene molekulare und Bi charakterisiert werdenochemical Methoden. Darüber hinaus können Transkriptomik und Proteomik Methoden, um das entstehende Material aufgebracht werden, dadurch zu ermöglichen, genomweite Einsichten. Die Nutzung von Hefe als Modellorganismus für solche Studien hat die Vorteile von Geschwindigkeit, Kosten und Einfachheit. Darüber hinaus sind die fortschrittlichen Werkzeugen und genetische verfügbar Deletionsstämmen erleichtern die Überprüfung der Kandidaten Faktoren.

Dieses Protokoll ermöglicht die Trennung einer Mitochondrien-enthaltende Fraktion von cytosolischen Komponenten. Der beste Weg, um den Erfolg zu prüfen ist, Northern-Analyse und Western-Analyse (Fig. 1), um Proben aus den verschiedenen Isolationsschritte durchzuführen. Drei Parameter für die Isolierung Qualität werden aus diesen Analysen abgeleitet. Erstens, ob die RNA oder Proteinen in den Proben intakt sind - diese werden als unterschiedliche Banden bei den Analysen nachgewiesen werden. Abbau Ver...

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Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

Viele mRNAs mitochondriale Proteine ​​kodieren, sind mit der äußeren Mitochondrien-Membran verbunden. Wir beschreiben eine subzellulärer Fraktionierung Verfahren auf Isolierung von Hefe-Mitochondrien mit den zugehörigen mRNAs und Ribosomen ab. Dieses Protokoll kann auf Zellen unter verschiedenen Bedingungen gezüchtet, um die Mechanismen der mRNA-Lokalisierung und Übersetzung lokalisiert in der Nähe der Mitochondrien zeigen angewendet werden.

Isolierung von mRNAs Verbunden mit Hefe-Mitochondrien Study Mechanismen der lokalisierten Übersetzung

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized ...

isolation-mrnas-associated-with-yeast-mitochondria-to-study

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K Aufrufe.  Technion - Israel Institute of Technology.  Viele mRNAs mitochondriale Proteine ​​kodieren, sind mit der äußeren Mitochondrien-Membran verbunden. Wir beschreiben eine subzellulärer Fraktionierung Verfahren auf Isolierung von Hefe-Mitochondrien mit den zugehörigen mRNAs und Ribosomen ab. Dieses Protokoll kann auf Zellen unter verschiedenen Bedingungen gezüchtet, um die Mechanismen der mRNA-Lokalisierung und Übersetzung lokalisiert in der Nähe der Mitochondrien zeigen angewendet werden. 

Serie: Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Testen visueller Sensibilität für die Geschwindigkeit und Richtung der Bewegung in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Forschung

Biologie

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

Reinigung von Mitochondrien aus Hefezellen

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

Isolierung und Reinigung von Drosophila Peripheren Neuronen durch Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

Visualisierung von endoplasmatischen Retikulum lokalisierte mRNAs in Säugerzellen

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

Die konfokale Bildgebung von Einzel Mitochondrial Super Blinkt Intact Herz oder<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally scales with the size of the cell, notably during embryogenesis when dramatic reductions in both cell and nuclear sizes occur. Mechanisms of nuclear size regulation are largely unknown and may be relevant to cancer where altered nuclear size is a key diagnostic and prognostic parameter. In vivo approaches to identifying nuclear size regulators are complicated by the essential and complex nature of nuclear function. The in vitro approach described here to study nuclear size control takes advantage of the normal reductions in nuclear size that occur during Xenopus laevis development. First, nuclei are assembled in X. laevis egg extract. Then, these nuclei are isolated and resuspended in cytoplasm from late stage embryos. After a 30 - 90 min incubation period, nuclear surface area decreases by 20 - 60%, providing a useful assay to identify cytoplasmic components present in late stage embryos that contribute to developmental nuclear size scaling. A major advantage of this approach is the relative facility with which the egg and embryo extracts can be biochemically manipulated, allowing for the identification of novel proteins and activities that regulate nuclear size. As with any in vitro approach, validation of results in an in vivo system is important, and microinjection of X. laevis embryos is particularly appropriate for these studies.

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

Mechanisms of cellular and intra-cellular scaling remain elusive. The use of Xenopus embryo extracts has become increasingly common to elucidate mechanisms of organelle size regulation. This method describes embryo extract preparation and a novel nuclear scaling assay through which mechanisms of nuclear size regulation can be identified.

Ein zellfreien Assay unter Verwendung von<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryo Extrahiert Mechanismen der Kerngröße Verordnung zum Studium

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally ...

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents in the treatment of several diseases. The development of new, innovative strategies for miRNA/siRNA therapy is based on an extensive knowledge of the underlying mechanisms. Recent data suggest that small RNAs are exchanged between cells in a gap junction-dependent manner, thereby inducing gene regulatory effects in the recipient cell. Molecular biological techniques and flow cytometric analysis are commonly used to study the intercellular exchange of miRNA. However, these methods do not provide high temporal resolution, which is necessary when studying the gap junctional flux of molecules. Therefore, to investigate the impact of miRNA/siRNA as intercellular signaling molecules, novel tools are needed that will allow for the analysis of these small RNAs at the cellular level. The present protocol describes the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) microscopy to elucidating the gap junction-dependent exchange of miRNA molecules between cardiac cells. Importantly, this straightforward and non-invasive live-cell imaging approach allows for the visualization and quantification of the gap junctional shuttling of fluorescently labeled small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution. The data obtained by 3D-FRAP confirm a novel pathway of intercellular gene regulation, where small RNAs act as signaling molecules within the intercellular network.

Here, we describe the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) for the analysis of the gap junction-dependent shuttling of miRNA. In contrast to commonly applied methods, 3D-FRAP allows for the quantification of the intercellular transfer of small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution.

Analyse der Gap-Junction-abhängigen Übertragung von miRNA mit 3D-FRAP-Mikroskopie

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat metabolic syndrome. Thermogenic tissues such as brown and beige fats develop highly specialized mitochondria for heat production. Mitochondria of other tissues, which primarily produce ATP, also convert up to 25% of the total mitochondrial energy production into heat and can, therefore, have a considerable impact on the physiology of the whole body. Mitochondrial thermogenesis is not only essential for maintaining the body temperature, but also prevents diet-induced obesity and reduces the production of reactive oxygen species (ROS) to protect cells from oxidative damage. Since mitochondrial thermogenesis is a key regulator of cellular metabolism, a mechanistic understanding of this fundamental process will help in the development of therapeutic strategies to combat many pathologies associated with mitochondrial dysfunction. Importantly, the precise molecular mechanisms that control acute activation of thermogenesis in mitochondria are poorly defined. This lack of information is largely due to a dearth of methods for the direct measurement of uncoupling proteins. The recent development of patch-clamp methodology applied to mitochondria enabled, for the first time, the direct study of the phenomenon at the origin of mitochondrial thermogenesis, H+ leak through the IMM, and the first biophysical characterization of mitochondrial transporters responsible for it, the uncoupling protein 1 (UCP1), specific of brown and beige fats, and the ADP/ATP transporter (AAC) for all other tissues. This unique approach will provide new insights into the mechanisms that control H+ leak and mitochondrial thermogenesis and how they can be targeted to combat metabolic syndrome. This paper describes the patch-clamp methodology applied to mitochondria to study their thermogenic capacity by directly measuring H+ currents through the IMM.

This method article details the main steps in measuring H+ leak across the inner mitochondrial membrane with the patch-clamp technique, a new approach to study the thermogenic capacity of mitochondria.

Die Verwendung der Patch-Clamp-Technik zur Untersuchung der thermogenen Kapazität von Mitochondrien

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular mechanisms behind the beneficial effects of exercise are poorly understood. Many physical workouts, particularly those classified as aerobic exercises such as jogging and walking, produce impulsive forces at the time of foot contact with the ground. Therefore, it was speculated that mechanical impact might be implicated in how exercise contributes to organismal homeostasis. For testing this hypothesis on the brain, a custom-designed ''passive head motion'' (hereafter referred to as PHM) system was developed that can generate vertical accelerations with controlled and defined magnitudes and modes and reproduce mechanical stimulation that might be applied to the heads of rodents during treadmill running at moderate velocities, a typical intervention to test the effects of exercise in animals. By using this system, it was demonstrated that PHM recapitulates the serotonin (5-hydroxytryptamine, hereafter referred to as 5-HT) receptor subtype 2A (5-HT2A) signaling in the prefrontal cortex (PFC) neurons of mice. This work provides detailed protocols for applying PHM and measuring its resultant mechanical accelerations at rodents' heads.

The present protocol describes a custom-designed ''passive head motion'' system, which reproduces mechanical accelerations at rodents' heads generated during their treadmill running at moderate velocities. It allows dissecting mechanical factors/elements from the beneficial effects of physical exercise.

Anwendung der passiven Kopfbewegung zur Erzeugung definierter Beschleunigungen an den Köpfen von Nagetieren

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) system, which is regulated in response to cellular demands. The lipid molecule Coenzyme Q (CoQ) is essential in this process by transferring electrons to complex III in the electron transport chain (ETC) through constant oxidation/reduction cycles. Mitochondria status and, ultimately, cellular health can be assessed by measuring ETC oxygen consumption using respirometric assays. These studies are typically performed in established or primary cell lines that have been cultured for several days. In both cases, the respiration parameters obtained may have deviated from normal physiological conditions in&#160;any given organ or tissue.
Additionally, the intrinsic characteristics of cultured single fibers isolated from skeletal muscle impede this type of analysis. This paper presents an updated and detailed protocol for the analysis of respiration in freshly isolated mitochondria from mouse skeletal muscle. We also provide solutions to potential problems that could arise at any step of the process. The method presented here could be applied to compare oxygen consumption rates in diverse transgenic mouse models and study the mitochondrial response to drug treatments or other factors such as aging or sex. This is a feasible method to respond to crucial questions about mitochondrial bioenergetics metabolism and regulation.

Here, we describe a detailed method for mitochondria isolation from mouse skeletal muscle and the subsequent analysis of respiration by Oxygen Consumption Rate (OCR) using microplate-based respirometric assays. This pipeline can be applied to study the effects of multiple environmental or genetic interventions on mitochondrial metabolism.

Isolierung von Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus für respirometrische Assays

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...