Finanzielle Unterstützung für VECT-HORUS wird aus dem Fonds Einzigartige Interministériel (FUI / MEDUL Projekt) und VECT-HORUS und dem UMR7259 Labor von der Agence Nationale de la Recherche (ANR, TIMPAD, VECtoBrain, VEC2Brain, ADHOC und PREVENTAD Verbundprojekte) anerkannt . Die UMR7259 Labor bestätigt auch finanzielle Unterstützung von der CNRS und von Aix-Marseille Université.

1. Herstellung von Ratten Astrozyten Für jedes Präparat verwenden 10 Neugeborenen Wistar-Ratten beiderlei Geschlechts. <ol><li> Opfere die Ratten durch Schneidköpfe mit einer Schere und sofort übertragen sie in einem trockenen Petrischale unter einer Sterilbank. Entfernen Sie die Gehirn aus dem Schädel, ohne das Kleinhirn und sofort übertragen sie in eine Petrischale mit kaltem Dissektion Puffer: HBSS ergänzt mit 1% Rinderserumalbumin (niedrige Endotoxin-BSA), Penicillin 100 Einheiten / ml und Streptomycin 100 ug / ml. </li><li> Schneiden Sie die Gehirne in der Hälfte, die zwei Gehirnhälften zu trennen und sie in eine saubere Petrischale mit Dissektion Puffer auf Eis. Schneiden Sie den Sehnerv und entfernen Sie die Hirnhaut unter einem Stereomikroskop. </li><li> Ausführlich in 50 ml kaltem Dissektion Puffer waschen Rindenstücke. </li><li> Legen Sie die kortikale Stücke aus drei Gehirne in ein 15 ml-Falcon-Röhrchen und distanzieren sich ausdrücklich von Auf-und Abpipettieren einem Staatsstreichle Mal mit einer 10 ml Einmalpipette mit blauer Spitze ausgestattet in 6 ml 0,05% Trypsin - 0,02% EDTA für 5 min bei 37 ° C. </li><li> Hinzufügen von 24 ml DMEM, ergänzt mit 10% FBS und die Antibiotika Penicillin 100 Einheiten / ml Streptomycin und 100 &amp;mgr; g / ml, eine Medien genannt glialen Zellmedien (GCM) und Zentrifugieren bei 300 xg für 5 Minuten bei RT. FBS Chargen wurden ausgewählt und für das Wachstum und Überleben von Astrozyten cutures validiert. </li><li> Das Pellet, das die dissoziierten Zellen in 10 ml GCM und Platte in eine 75 cm 2-T-Kolben (T75). Ändern Sie das Medium am nächsten Tag, um die Zelltrümmer und DNA zu entfernen. Ersetzen Sie den Kulturmedien zweimal pro Woche. </li><li> Nach 1 Woche Proliferation, schütteln die Gliazellen mit einem Orbitalschüttler bei 60 Upm während 24 Stunden bei 37 ° C in GCM. Wenn die T75 nicht in einem Inkubator mit 5% CO 2/95% Luft bei 37 ° C befeuchteten Atmosphäre platziert werden, ergänzen das Medium mit 5 mM HEPES. Waschen Sie die Zellen zweimal remove das nicht haftende Mikrogliazellen. </li><li> Drei Wochen nach der Aussaat, wasche die Zellen zweimal mit DPBS ohne Calcium und Magnesium. In 3 ml warmem Trypsin-EDTA 0,05% 0,02%, bei 37 ° C und warten, bis die Zellschicht verteilt ist (in der Regel 5 min). Hemmen Trypsin-Aktivität durch Zugabe von 10 ml GCM, übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml-Falcon-Röhrchen und-Zentrifuge bei 120 g für 8 min. </li><li> Resuspendieren Sie das Pellet in Astrozyten 90% FBS - 10% DMSO, übertragen sie in Kryoröhrchen (2 x 10 6 Zellen pro Kryoröhrchen) und lagern in flüssigem Stickstoff. </li></ol> 2. Isolierung von Rattenhirn-Mikrogefäße Unsere experimentellen Verfahren werden von der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der Universität Marseille zugelassen und entsprechen den nationalen und europäischen Bestimmungen (EU-Richtlinie Nr. 86/609). Alle Anstrengungen wurden unternommen, um das Leiden der Tiere zu minimieren und reduzieren die Anzahl der verwendeten Tiere. <ol><li> Für jede Zubereitung und für eine experimenter, verwenden Sie 3 5 Wochen alten Wistar-Ratten. </li><li> Montag der ersten Woche, bereiten zwei T75-Flaschen durch Beschichtung mit Kollagen Typ IV und Fibronektin, sowohl bei 1 ug / cm 2 in sterilen Kultur Wasser (10 ml pro T75). Erlauben, bei 37 ° C bis microvessel Aussaat haften. </li><li> Mittwochmorgen von der ersten Woche einschläfern die Ratten unter einer zunehmenden Fluss von CO 2 zu Schläfrigkeit führen, Verlust von Körperhaltung und Atemunterbrechung, dann durch einen Genickbruch folgte. Sprühen die Köpfe mit 70% Ethanol. Schneiden Sie die Köpfe mit einer Schere und übertragen Sie sie in eine trockene Petrischale unter einer Sterilbank. </li><li> Entfernen Sie die Gehirn aus dem Schädel, ohne das Kleinhirn und die Sehnerven, übertragen sie dann in eine Petrischale auf Eis gekühlt und mit kaltem Dissektion Puffer gefüllt (HBSS ergänzt mit 1% BSA, Penicillin 100 Einheiten / ml und Streptomycin 100 ug / ml) . </li><li> Schneiden Sie die Gehirne in Hälfte 2, um die Gehirnhälften und separate Mittelhirn aus für trennenebrain. Übertragen Sie die Vorderhirn in eine saubere Petrischale auf Eis mit Dissektion Puffer. </li><li> Nehmen Sie ein paar Halbkugeln in eine neue Petrischale mit kaltem Dissektion Puffer, um vorsichtig die Hirnhäute von den Vorderhirn unter einem Stereomikroskop mit N ° 5 gebogenen Pinzette. Dann reinigen Sie das Innere des Gehirns, um die Bettdecke von Myelin zu entfernen und eine Schale aus Kortex. Diese Schritte sollten nicht mehr als 2 Stunden für die Gewebeerhaltung und Überleben der Zelle. </li><li> Distanzieren die Rinde von 3 Gehirne in 6 ml kaltem Dissektion Puffer in einem 7 ml Dounce Homogenisator um 10 nach oben und unten Schläge mit jeweils 2 Stößel von verschiedenen Freigaben, um 71, gefolgt von 20 um. </li><li> Teilen die Suspension, um das Äquivalent von 1 Kortex in 1 ml einer 50 ml-Falcon-Röhrchen und Zentrifugieren bei 1.000 xg für 5 Minuten bei RT zu erhalten. Überstand verwerfen. </li><li> Verdauen die Suspension aus 1 Kortex mit 1 ml einer Enzymlösung, die eine Mischung aus Collage / Dispase (60 ug / ml R11; 0,3 U / ml), DNase Typ I (35 ug / ml - 20 K-Einheiten / ml) und Gentamicin (50 ug / ml) in einem Schüttler für 30 min bei 37 ° C. </li><li> Mischen Sie die 1 ml von 1 Kortex verdauen mit 10 ml 25% BSA / HBSS 1X und separate durch dichteabhängige Zentrifugation bei 3.600 g für 15 min bei RT. Die obere Scheibe (Myelin und Hirnparenchym) und der Überstand vorsichtig in ein sauberes 50 ml Falcon-Röhrchen übertragen und wiederholen Sie den Zentrifugieren. Halten Sie das resultierende Pellet, das die Gehirnmikrogefäßen bei 4 ° C. </li><li> Vorsichtig verwerfen die obere Scheibe und den Überstand. Resuspendieren beide resultierenden Pellets, die die Gehirnmikrogefäßen mit 1 ml kaltem HBSS 1X und übertragen in einen sauberen 50-ml-Falcon-Röhrchen. </li><li> Waschen der Mikrogefäße durch Zugabe von 20 ml kaltem HBSS 1X und Zentrifuge bei 1000 × g für 5 min. Überstand verwerfen. </li><li> Weitere verdauen die Mikrogefäße von 1 Kortex mit 1 ml des gleichen Enzymlösung, wie in Schritt 2.9 während 1 h bei 37 ° C in einem SH beschriebenAker. </li><li> Dann mischen Sie die verdaut Mikrogefäßen aus jeder der drei Kortex in eine Röhre und weiter in zwei 50 ml Falcon-Röhrchen zu trennen, um Mikrogefäße aus dem Gegenwert von einem und einem halben (1,5) pro Röhrchen extrahiert Kortex erhalten. 30 ml kaltem Dissektion Puffer und Zentrifugieren bei 1.000 xg für 5 Minuten bei RT. </li><li> Resuspendieren der Mikrogefäß Pellet in 10 ml DMEM/F12 mit 20% Rinderplättchenarmes Plasma abgeleiteten Serum, basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF, 2 ng / ml), Heparin (100 ug / ml), Gentamicin (50 ug / ml) ergänzt, und HEPES (2,5 mM), genannt endothelialen Zellmedien (ECM) mit Puromycin ergänzt war, bei 4 ug / ml. </li><li> Nehmen Sie die 2 beschichtet T75-Flaschen aus dem Brutschrank, saugen das überschüssige Beschichtung und Platte die Mikrogefäße aus jedem Röhrchen in einer T75-Flasche (Mikrogefäßen von 1,5 Kortex pro T75-Flasche entnommen). </li></ol> 3. Reinigung und Proliferation von RBEC Primocultures <ol><li> Reinigung: Mittwoch bis Freitag, fügen puromycin bei 4 ug / ml zum Kulturmedium. Ändern Sie das Medium am Donnerstag. Am Freitag, waschen Sie die Zellen und fügen Puromycin bei 2 pg / ml bis Montag. </li><li> Proliferation: Am Montag der zweiten Woche, waschen Sie die Zellen, und fügen Sie Insulin, Transferrin und Natriumselenit Ergänzung zu den Kulturmedien, bis die Kulturen bis zu 90% Konfluenz am Mittwoch der zweiten Woche. </li></ol> . 4 Differenzierung: Einrichten der In-vitro-Modell BBB <ol><li> Montag der zweiten Woche, Filter (Polyethylen, 12 Brunnen, Porengröße 1,0 um) vorzubereiten durch Beschichtung mit einer Mischung aus Kollagen Typ IV und Fibronektin sowohl auf 0.5μg/cm 2 in sterilen Kultur Wasser (500 ul der Mischung in der oberen Kammer und 1,5 ml sterile Kultur Wasser in der unteren Kammer). Erlauben, bei 37 ° C bis RBEC Aussaat haften. </li><li> Montag der zweiten Woche, fünf Tage vor der Gründung der Co-Kultur-tauen Sie die Astrozyten aus Kryoröhrchen bei 37 ° C und Transferin einem 15 ml Falcon mit 10 ml GCM. Zentrifugieren der Suspension bei 120 · g für 8 min bei RT. </li><li> Resuspendieren des Pellets in Astrozyten GCM und Platte bei einer Dichte von 30 x 10 3 Zellen pro cm 2 in 12-Well-Platten. </li><li> Mittwoch der zweiten Woche, kurz vor Dissoziation RBEC mit Trypsin, waschen zweimal die Pre-beschichtete Filter mit DMEM/F12-Medium. Pre-füllen die Kammern mit ECM: 1,5 ml in der unteren Kammer und 0,5 ml im oberen Fach. </li><li> Mittwoch der zweiten Woche, waschen doppelt so RBEC mit DPBS ohne Calcium und Magnesium. 4 ml warmem Trypsin 0,05% - 0,02% EDTA-Lösung bei 37 ° C pro T75-Flasche während 30 Sekunden genau. Dann entfernen Sie 3,5 ml Trypsin-Lösung und beobachten unter dem Mikroskop. Wenn die Zellschicht beginnt, sich von der Matrix zu trennen, damit sie durch leichtes Antippen der Kante des T75-Kolben, bis alle Zellen schwimmen. </li><li> In 9 ml ECM pro T75-Flasche und Überführung in ein 15 ml-Falcon-Röhrchen. Sehr sanft distanzieren die ZelleSuspension durch Auf-und Abpipettieren 4 mal mit einer 10 ml Pipette mit einer gelben Spitze ausgestattet (vermeiden Sie die Produktion von Luftblasen in der Lösung). Zählen der Zellen in der Suspension (etwa 3 x 10 6 cells/T75) und unmittelbar auf der Platte vorbeschichtet und Fertig Filter mit hoher Dichte (160 x 10 3 Zellen / Filter somit etwa 18 filters/T75) (Abbildung 8 ). Am folgenden Tag (Donnerstag), ändern zweimal das Medium der oberen Kammer, um die Zelltrümmer zu entfernen. </li><li> Donnerstag der zweiten Woche, dem Tag vor der Gründung der Co-Kultur, ersetzen Sie die Astrozyten Kulturmedien von 1,5 ml Differenzierungsmedien (ECM mit Hydrocortison bei 500 nM), die mit 1/3 konditionierten Medium von der basalen Fach ergänzt werden einer früheren Co-Kultur (3 Tage des Kontakts zwischen Endothelzellen und Astrozyten). </li><li> Freitag der zweiten Woche als Tag 0 der Differenzierung definiert; ersetzen Sie den Kulturmedien aus dem Filter containing der RBEC Differenzierung mit Medien. Übertragen Sie die RBEC Filter in die Vertiefungen, die die Astrozyten. Unter diesen Bedingungen in vitro-Modelle unterscheiden und Express-Übergang-verwandten Proteinen innerhalb von 3 Tagen. </li><li> Die Modelle halten ihre optimale Differenzierung während der drei Tage, zwischen Montag und Mittwoch der dritten Woche. </li></ol>

Michel Khrestchatisky is director of the UMR7259 laboratory, co-founder and scientific counsel of VECT-HORUS biotechnology company.

Wir beschreiben die Umsetzung eines Wochen reproduzierbare Protokoll für die Isolierung und Beschichtung von Mikrogefäßen des Gehirns, nach der Reinigung und der Kultur der RBEC und weiteren Aufbau von Co-Kulturen mit primären Ratten-Astrozyten, ein in vitro-Modell mit BBB BBB charakteristischen Eigenschaften zu erzeugen. Erfolgreich Gründung in-vitro-Kulturen BBB standardisiert erfordert optimale Bedingungen in den mehreren aufeinander folgenden Schritte des Prozesses. Das Modell wurde (a) optimiert, um die niedrigsten parazellulären Permeabilität, die der &quot;Heilige Gral&quot; der in-vitro-Modelle BBB bleibt, und (b) für Auslauf und RMT Mechanismen validiert erhalten. Produktion, Reinigung und Proliferation von RBEC Die größte Herausforderung bei der Kultivierung RBEC ist, um die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Kulturen zu erreichen. Standardisierung des Protokolls erfordert hochwertige Werkzeuge für disAbschnitt, hochwertige Reagenzien und Respekt Reagenz Ablaufdaten. Der Versuchsleiter muss in der Mikro-Dissektion unter Stereomikroskop für die schnelle Entfernung der Hirnhäute und große Schiffe aus der Kortexoberfläche qualifizierte werden. Sobald das Gehirn isoliert und mechanisch dissoziiert, ist eine der großen Herausforderungen, die optimale enzymatische Verdauung der frisch isolierten Gehirnmikrogefäßen. Die Art und Qualität der verwendeten Enzyme ist kritisch. Eine Mischung aus Collage Typ I und II und Dispase in hoher Konzentration mit geringer Variabilität zwischen den Chargen verwendet. Wichtig sind auch die Dauer der enzymatischen Verdauung und das Verhältnis zwischen Enzymkonzentration / Gewebegewicht / Volumen der Verdauung. Die beste Ausbeute von Gehirnmikrogefäß-Produktion wurde mit dem Äquivalent von 1 Kortex des Gehirns in 1 ml Collage erhalten / Dispase bei 60 ug / ml während der beiden Aufschlüsse 30 Minuten und 1 Stunde mischen sind. Ebenfalls kritisch ist die Beseitigung von verunreinigenden Zells (Astrozyten und vor allem Perizyten). Diese Zellen vermehren sich bei höheren Rate als Endothelzellen und nicht tight junctions zu etablieren mit dem letzteren, wodurch die Einrichtung einer homogenen Zellschicht mit guten parazellulären Restriktions. In Anbetracht, dass Gehirn-Endothelzellen exprimieren deutlich höhere Efflux-Pumpen, insbesondere P-gp im Vergleich zu den anderen Zelltypen in Mikrogefäßen gefunden, tolerieren sie besser die ansonsten toxischen Konzentrationen von P-gp-Ligand Drogen, während nicht-Endothelzellen werden eliminiert. Puromycin-Behandlung bei 4 ug / ml für die ersten zwei Tage wurde durch zwei weitere Tage bei 2 ug / ml, gefolgt gute Endothelzellen Reinheit zu erhalten. Diese Auswahl kann auch Endothelzellen begünstigen im Vergleich zu denen von Venen, Pre-Kapillare Arteriolen oder größere Mikrogefäße und führen zu strengeren Monoschichten. Darüber hinaus ist die Verwendung von armes Plasma abgeleiteten Rinderserum eine Notwendigkeit Reinkulturen von Endothelzellen 47,48 erhalten. Das Plasma-derIved Serum fehlt Plättchenwachstumsfaktor (PDGF), die mitogen für Fibroblasten ist für glatte Muskelzellen und Perizyten daher. Wir haben beobachtet, dass die Behandlung von Kunststoff und Filter mit einer Mischung aus Kollagen Typ IV von Mäusen und menschlichem Fibronectin ergibt einen erheblichen Vorteil, mit einem 2-fachen Anstieg der Proliferation Ausbeute im Vergleich mit der traditionellen empfohlen Kollagen Typ I aus Rattenschwanz. Wichtige Hinweise für die Zellproliferation von der extrazellulären Matrix wie beispielsweise Integrin-und Wachstumsfaktor (bFGF) Aktivierung 49 vorgesehen. Pufferkonzentration und pH-Wert der Kulturmedien beschrieben worden sind, positiv auf die parazelluläre Dichtigkeit 50 auswirken, und wir beobachteten eine bessere Reproduzierbarkeit der Kulturen mit dem Zusatz von HEPES-Puffer mit 5 mM. Differenzierung von RBEC: Co-Kultur-Establishment auf Filter einfügen Nach Gehirn-Endothelzellen haben been gereinigt und wurden 6 Tage lang vermehrt, können sie auf Filtern plattiert werden. Zellbeschichtung mit hoher Dichte ist entscheidend, um eine perfekte Monoschicht zu erhalten. Ein Aussaatdichte von 160x10 3 Zellen pro 12-Well-Platte Filter notwendig und ausreichend war, um eine Monolayer 24 Stunden nach der Aussaat zu erhalten. Allerdings ist Isolierung von primären Gehirn Endothelzellen aus ihrer Umgebung ein Paradox in den Bau einer BBB-in vitro-Modell, wie es ist bekannt, dass primäre Zellen und insbesondere Gehirn Endothelzellen, sind stark von ihrer Umgebung reguliert und induktive Faktoren hergestellt die verschiedenen umliegenden Zelltypen. Gehirn-Endothelzellen allein kultiviert schnell dedifferenzieren und verlieren einige spezifische Hirn endotheliale Marker. Somit sollte primären endothelialen Zellen bei niedrigen Passage (P1) zumindest teilweise verwendet werden und neu verbunden, mit ihrer Umgebung durch Co-Kultur mit Astrozyten oder Medium durch Astrozyten 47,51 konditioniert. Dies giltgilt für Astrozyten-Differenzierung als Gehirn-Endothelzellen und Astrozyten sind in Zwei-Wege-Induktion beteiligt. Kultivierung RBEC mit Astrozyten führte zu starken Induktion von interendothelialen TJ 52,23. Die molekularen Mechanismen der Re-Induktion weitgehend unbekannt, und Forschung ist im Gange in mehreren Laboratorien auf bestimmte modulierenden Faktoren von Astrozyten sezerniert wird, die eine optimale endothelialen Zelldifferenzierung 53,54 fördern könnten. Faktoren, die von Endothelzellen des Gehirns einschließlich Leukämie inhibierenden Faktor (LIF) sezerniert wurde gezeigt, dass Astrozyten 55,56 Differenzierung zu induzieren. Bevor Co-Kultur-Gründung, wurden Astrozyten, die Differenzierung Medium, das die Glucocorticoid-Rezeptor-Agonist Hydrocortison ausgesetzt und Co-Kultur-konditionierten Medium. Hydrocortison ist bekannt, dass die Dichtheit der Endothelzellen des Gehirns zu verbessern und wird in BBB-Modelle vor allem aus Ratte und Maus 57 58,59 endothelialen Zellen verwendet. Das konditionierte mediUm ist von der unteren Kammer der Endothelzelle / Astrozyten Co-Kultursystem nach 3 Tagen gesammelt und zur späteren Verwendung eingefroren. Der Einsatz von Co-Kultur-konditionierten Mediums reduziert die Zeit der endotheliale Zelldifferenzierung zu 3 Tage mit optimalen parazellulären Permeabilität für 2 Tage und auch eine verbesserte Reproduzierbarkeit zwischen den Kulturen. Insgesamt ist das Protokoll beschreiben wir ergibt eine reproduzierbare TEER über 300 Ohm · cm 2 und eine durchschnittliche parazellulären Permeabilität Koeffizienten Pe (LY) von 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min, ähnlich zu den besten Primärzellbasis BBB Modelle 22, 12. Das Protokoll wird beschrieben in der vorliegenden Manuskript mit dem vorgeschlagenen Modulation von Mikrogefäß enzymatische Verdauung kann erweitert werden, um Zellen aus Rattenrückenmark 60 und von Mäusen Hirnendothelzellen. Molekulare und funktionelle Charakterisierung AußerdemTJ Induktion, Astrozyten auch zur Expression von Effluxtransporter wie P-gp in Hirnendothelzellen 61 beitragen. Wir zeigen in der Tat Ausdruck der Effluxtransporter P-gp in der BBB-Modell und wir zeigen die Polarität der P-gp Effluxpumpe Lokalisierung mit biochemischen Methoden und P-gp-Aktivität unter Verwendung eines funktionellen Assays. GLT-1-Expression wurde in den basalen Membranfraktion von Mikrogefäßen festgestellt, jedoch nicht in kultivierten RBEC detektiert. Wir vermuten, dass GLT-1 wurde in unserer RBEC Kultur im Vergleich zu in vivo-Bedingungen und damit nicht durch Western-Blot-Analyse nachweisbar geregelt. Überschüssige Glutamat neurotoxisch und in vivo ist GLT-1 gegen Glutamat-Efflux aus den basalen Fach (Parenchym) zu der apikalen Kammer (Durchblutung) verantwortlich. In Astrozytenkulturen bleibt GLT-1-Expression sehr gering und wird durch Zugabe von Glutamat im Medium 62,63 induziert. Wir conf auchirm der Ausdruck der Zustrom Transporter an der apikalen Membran, wie LRP1, LDLR und TfR. Die Funktionalität der TfR und LDLR wurde mit Bindung und Transportexperimente von Tf-Cy3 und DiLDL von der luminalen auf die abluminalen Seite der Monoschicht wie zuvor mit einem Rind in vitro BBB Modell 64 gezeigt demonstriert. Interessanterweise wurde gezeigt, dass die Lipid Anforderung von Astrozyten erhöht die Expression von LDL-Rezeptor auf Endothelzellen Hirn 65,66 weitere Bestätigung der physiologischen Sprechen zwischen Astrozyten und Endothelzellen des Gehirns, einschließlich in vitro. Wir haben uns entschieden, Transport mit Fluoreszenzfarbstoffen wie veranschau wie Cy3 und Dil bedenkt, dass spektrofluorimetrischen Analyse ist in den meisten Labors zur Verfügung, und kann sich als nützlich erweisen, um in vitro BBB-Modelle zu validieren. Quantifizierung der Fluoreszenz ist jedoch weit weniger empfindlich als die Radioaktivität und erfordert eine Erhöhung der Anzahl von Experimenten, um signifikante Daten zu erhalten.Idealerweise Tf und LDL sind in der Regel radioaktiv markierten (Jod-125) für eine solche Bindung / Aufnahme und den Transport Experimenten. Wir zeigen auch, dass die differenzierte Endothelzellen Monoschicht mit der vorgeschlagenen Protokoll erhalten reagiert auf Entzündungen, die durch TNF-α induziert, wie von CCL2 Mitteilung und BBB Öffnung enthüllt. CCL2 (MCP-1) und seinem Rezeptor CCR2 in ZNS-Erkrankungen wie Multiple Sklerose, experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis (EAE) 67, ZNS-Trauma und 68 werden als Mediatoren der Leukozyten-Migration in das ZNS unter Bedingungen neuroinflammatorische 69,70 bekannt beteiligt. Mit dem Protokoll getestet, können wir nicht feststellen, auf einer polarisierten Sekretion von CCL2 weil BBB-Öffnung ermöglicht die CCL2-Konzentration zwischen den beiden oberen (apikal) und unteren (basal) Fächer ausgleichen lassen. Folglich wir deutlich unterschätzt die Menge des durch die CCL2 RBEC im apikalen Kammer bei 24 Stunden (5A) hergestellt. &gt; Gesamtübersicht und Grenzen der In-vitro-Modelle BBB: I n Vivo gegenüber In-vitro-und Nager gegen Menschen Vergleiche Viel versprechende ZNS-Medikamente, die wirksam bei der BBB-Passage in vitro nachgewiesen scheiterte in klinischen Studien wegen fehlender Vorhersehbarkeit von in-vitro-Modelle BBB oft auf Zellen anderer Spezies als Mensch isoliert basiert. Nach bestem Wissen unseren Erkenntnissen sind die in-vitro-Modelle BBB wahrscheinlich mehr Vorhersage, wenn es um das Studium mechanistische Aspekte von Protein-Netzwerken, Signaltransduktion, Transporter und Rezeptoren kommt. Jeder Mechanismus, Weg oder das Ziel in vitro untersucht werden muss, um seine Regulierung durch komplementäre Umweltreize (andere Zelltypen, Chemikalien, Proteine) mit der gleichen Tierspezies ist und in-situ-Untersuchungen kombiniert werdenUnd, wenn möglich, mit Mikrogefäßen und Endothelzellen aus Menschen isoliert, mit den Einschränkungen und Vorsicht hervorgerufen unten. In-vitro-BBB-Modelle müssen als autonome Systeme, Regelung von Körper isoliert gesehen werden kann, aber immer noch mit großen in-vivo-Eigenschaften und das Potenzial für Regulierung durch Umweltreize dotiert. Kein &quot;ideales&quot; in vitro BBB Modell wurde noch vorgeschlagen 71,72,73 weil die endotheliale Zellmonoschichten fehlen einige wichtige Bestandteile des Neuro Glia Gefäßeinheit (NGVU) und von Blut und Körperregulierung isoliert. Das Fehlen von Perizyten 74,16 oder 17,18 Neuronen oder die verschiedenen Bestandteile der extrazellulären Matrix für die Kunststoffbeschichtung oder dem Kulturmedium und das Serum für das Zellwachstum in den häufigsten und &quot;einfachste gemacht&quot; in vitro BBB Modelle basierend auf Endothelzellen verwendet Zellen mit Astrozyten differenziert kann die Proteinexpression i modulierenn Vergleich mit der in vivo Situation 75. Diese Modelle können viele Transporter in vivo angezeigt zu äußern, aber nicht alle. In einigen Fällen wurden die ersten Transportparameter in isolierten Mikrogefäßen (am nächsten zu der in vivo-Situation) überprüft, und studierte dann in Zellkultursystemen 76,61. Molekularbiologischen Forschung hat es der Charakterisierung von Gen-und Proteinexpression in isolierten Mikrogefäßen und niedrigen Gang Endothelzellkulturen aus der gleichen Art, und zwischen den verschiedenen Arten, meist aus Kleintiere wie Nagetiere (Mäuse und Ratten) oder vom Rind und Schwein Vergleich zu Menschen 77,78,75,15. Transkriptomischen Vergleich zwischen in vivo-und in vitro-Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen zeigten zahlreiche Gentranskripten, die differentiell exprimiert wurden und die am häufigsten in vitro signifikant herunterreguliert. Transcripts Zustrom Transportern wie TfR und pr Codierungoteins in Vesikeltransport beteiligt sind vor allem in kultivierten Endothelzellen des Gehirns herunterreguliert, was auf eine allgemeine Abnahme der Endozytose und Vesikeltransport in solchen Zellen. Kultur Manipulation in Bezug auf Reinheit (Puromycin-Behandlung) und die Behandlung mit Hydrocortison kann dazu beitragen, ein &quot;in-vivo-ähnlichen&quot; Genexpressionsprofil 77 wiederherzustellen. Transkriptom-Studien ergaben auch wichtige Unterschiede zwischen Arten, die weiter erschweren Prognosen auf Arzneimittelaufnahme bei Menschen auf der Grundlage Nagetier in vitro BBB-Modelle 75. In-vitro-Modelle, die BBB-Co-Kultur von humanen Endothelzellen und Astrozyten wurden 15 beschrieben. Obwohl relevant sind diese Modelle schwieriger zu implementieren regelmäßig, wie sie dass geregelte Zugang zur postmortalen menschlichen Gewebe und es gibt Heterogenität der Qualität / Eigenschaften der menschlichen Gehirn-Endothelzellen, je nach Alter, Krankheiten und möglicherweise medizinische treatment von Spendern. Anstrengungen unternommen, um neue in-vitro-Modellen, die eine bessere Reproduktion der physiologischen, anatomischen und funktionellen Eigenschaften der in vivo BBB entwickeln. Co-Kulturen, die drei-Zelltypen sind sehr restriktiv und schwierig erscheint, routinemäßig zu implementieren. Bis heute sind die komplexesten in vitro BBB-Modelle sind die dynamischen in-vitro-Modelle (DIV-BBB), die gefäßartige Organisation mit Astrozyten gehören und beinhalten eine Strömung von Medium, das den Blutfluss 75,79,80,81,82 nachahmt, 83,84,85. Wenn zerebralen Endothelzellen zu einer Strom ausgesetzt ist, aktiviert die erzeugte Scherspannung mechanotransducers an der Zelloberfläche, die die Expression verschiedener Gene in Endothelzellen Physiologie wie Zellteilung, Differenzierung, Migration und Apoptose beteiligt 80 zu modulieren. In vivo Scherbeanspruchung durch den Blutstrom erzeugt wird, ist für mitotische Festnahme an der Zellkontakt, der die Einrichtung ermöglicht ein verantwortungsendothelialen Zellschicht der Blutgefäße 80. Genom-und Proteom-Analyse des normalen menschlichen Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen zeigte die Auswirkungen der Schubspannung in Endothelzellen BBB Physiologie 84. Scherbeanspruchung ist für das Überleben der Zelle, einen höheren Grad der endothelialen Zelladhäsion, Effluxpumpe Induktion und bessere Polarisation Transporter 75, der Regulierung des Glukosestoffwechsel 75,86, Oxidation durch CYP450 Enzyme 75 und die Regulierung der parazelluläre Permeabilität durch Erhöhung der Expression von Genen, die für die interzelluläre junctional Elemente wie Occludin und ZO-1 87,75,80 und damit hohe TEER rund 1.500 - 2.000 Ohm · cm 2, in der Nähe von in vivo bekannten Parameter 79,80 In der Biotechnologie-und Pharmaindustrie, Routine-Screening von Drogen oder sogar Hochdurchsatz-Screening (HTS) und die Bemühungen um Tierversuche zu reduzieren, führtefür die Entwicklung der verschiedenen Zelllinien in Ersatz der Primärkultur von zerebralen Endothelzellen, die schwieriger zu routineAufbau verbleiben verwendet werden. In den meisten Fällen wurden Primärkulturen von zerebralen Endothelzellen mit einer immortalisierenden Gen (SV40 oder Polyoma large T-Antigen und Adenovirus-E1A) entweder durch Transfektion von Plasmid-DNA oder durch eine Infektion mit retroviralen Vektoren transduziert 88,89,75,. Mehrere endothelialen Zelllinien von zerebralen Ursprungs wie die RBE4, GP8/3.9, GPNT, RBEC1, TR-BBBs oder rBCEC4 Rattenzelllinien 88,75, der b.End3 Mauszelllinie 90,75, die PBMEC/C1 entwickelt - 2 Schweine-Zelllinie 87,75, und die hCMEC/D3 menschlichen Zelllinie 89,75. Andere Modelle, die sich auf Zellen des nicht-zerebralen Ursprungs wie der Madin-Darby-Hundenieren (MDCK)-Zelllinien oder Caco2 12,75 berechnet. Unter den verschiedenen menschlichen Groß endothelialen Zelllinien hat das hCMEC/D3 weit zitieren wordend verbessert und als ein Modell der BBB seit seiner Gründung im Jahr 2005 91,92. Wie bei Primärkulturen, Zelllinien vorhanden Vorteile und Grenzen. Sie sind leichter zu handhaben als Primärkulturen haben eine erweiterte Lebensdauer, sind gut gekennzeichnet und lassen Reproduzierbarkeit zwischen Großversuche. Allerdings können Zelllinien, Gewebe-spezifische Funktionen verlieren, verlieren Umweltregulierung und erwerben ein Molekular Phänotyp ganz andere Zellen in vivo 75, 89. Insbesondere Monoschichten aus Zelllinien vorhanden Dichtheit reduziert, niedrige TEER und Show-Transporter Profilvariation 75,89 erzeugt. Somit Tierversuchen oder Studien in Primärzellen sind oft trotz ihrer zusätzlichen Komplexität bevorzugt.

Viele Medikamente entwickelt, um das Zentrale Nervensystem (ZNS) zu behandeln Erkrankungen sind nicht imstande, die Hirnparenchym in therapeutisch relevanten Konzentrationen zu erreichen. Die BBB schützt Gehirn Nervengewebe, die durch Schwankungen der Plasma-Zusammensetzung, das aus Krankheitserregern, und unterhält Homöostase des Hirnparenchym durch die Einschränkung nicht-spezifischen Ionenfluss, Peptide, Proteine ​​und sogar Zellen in und aus dem Gehirn ein. BBB Eigenschaften durch intime Nähe und Übersprechen zwischen den spezialisierte Klasse Hirnkapillarendothelzellen und benachbarte Elemente der Neuro Glia-Kreiseinheit (NGVU) wie Neuronen induziert und aufrechterhalten wird, Gliazellen (Astrozyten genauer Endfüßchen) und Perizyten umhüllt in der Basalmembran, die hauptsächlich aus Kollagen Typ IV, Fibronectin, Laminin und Proteoglykane 2,3 besteht. Perizyten decken etwa 22 - 32% des Endothels an der Kapillare Ebene und spielen eine wichtigeRolle bei der Regulation der Proliferation Endothel, Angiogenese-und Entzündungsprozessen. Endothelzellen bilden eine kontinuierliche Bahn für die innere Oberfläche der Kapillaren. Sie werden von TJs, das eine bandartige Struktur an der apikalen Bereich bilden und dazu beitragen, dass Polarisierungszelle verbunden. Astrozyten regulieren BBB Eigenschaften und sind Quellen von wichtigen Regulationsfaktoren wie TGF-β, GDNF, bFGF und IL-6. Astrozyten in GFAP mit unvollständiger Funktionalität mangelhaft sind nicht in der Lage, um BBB-Eigenschaften 4 zu regeln. Neuronen nicht direkt strukturell in der Bildung der BBB beteiligt, sondern auch regulieren wichtige Aspekte der Proteinexpression und BBB Funktionen 5. Um die Struktur, Physiologie und Pathologie des BBB weiter untersuchen, wurden in vitro-Modelle der Blut-Hirn als Forschungswerkzeuge entwickelt. Gehirn-Endothelzellen wurden aus verschiedenen Spezies extrahiert wurden, in vitro-Modelle zu implementieren BBB basierendauf niedrigen Gang Primärkulturen aus Rinder 6,7, Schweine 8,9, 10,11,12 Ratte, Maus 13 und auch menschliche 14,15. Diese Modelle sind bekannt, die in vivo BBB nachahmen insbesondere wenn co-kultiviert mit Glia-Zellen aus Ratten-oder Maus-und / oder Perizyten 16,12, und / oder neuronalen Vorläuferzellen stamm 17 Astrozyten und / oder Neuronen 18. Die &quot;im Labor&quot;-Modelle sind oft von Nagetieren hergestellt, weil sie in vitro / in vivo-Experimenten und-Vergleiche und / oder der Untersuchung von Hirnendothelzellen aus transgenen Modellen 19 erzeugt. Neu in vitro BBB-Modelle entwickelt wurden auch entwickelt, um vorherzusagen Aufnahme in das Gehirn von möglichen ZNS-Wirkstoffkandidaten vor der in-vivo-Tests 15,20,21,3,6,22,11,23. In vitro BBB-Modelle sind in der Regel verwendet, um zu vergleichen der Transport von Medikamenten mit: i) bekannt Eindringen in das ZNS oder mit low Durchlässigkeit über die BBB und keine zentralen Wirkungen, und ii) die scheinbare Pe der gleichen Medikamente in Tiermodellen der gleichen Spezies gemessen. Die Drogen, die leicht passieren die BBB sind meist lipophilen und überqueren die Gehirn endothelialen Zellmembranen durch Lipid-vermittelte freie Diffusion (Koffein, Carbamazepin, etc.). Die negativ transportiert Medikamente wie Digoxin, Verapamil oder Cyclosporin A aktiv durch Hirnendothelzellen Effluxtransporter wie P-gp extrudiert. Viele der neu entwickelten therapeutischen Moleküle sind jedoch Biopharmazeutika, wie rekombinante Proteine, monoklonale Antikörper oder siRNAs. Die meisten von ihnen die BBB nicht kreuzen durch: i) Fehlen spezifische Transporter, und ii) die dicht gepackten Schicht von Endothelzellen, die hochmolekulare Moleküle aus unterziehen parazellulären Durchgang zu verhindern. Mit dieser Grenzen, &quot;Trojanische Pferd&quot; Strategien wurden unter Verwendung von Vektoren (Antikörper, Peptide) gegen bekannte Rezeptoren an der BBB, beteiligt i implementiertn-Rezeptor-vermittelten Transport oder Transzytose (RMT), wie die Transferrin (Tf)-Rezeptors (TfR), der Insulin-Rezeptor (IR) oder Mitglieder der LDL-Rezeptor (LDLR)-Rezeptorfamilie verwandt (LDLR, LRP1). Solche Rezeptoren wurden auf isolierte Gehirn Kapillaren und in der BBB wurden in vivo 24,25 gefunden. Transkriptionsprofile für diese Rezeptoren, insbesondere diejenigen der Familie LDLR wurden analysiert und verglichen zwischen Endothelzellen des Gehirns und Gehirn-Endothelzellen kokultiviert mit Astrozyten im Gehirn oder Kapillaren unmittelbar nach ihrer Extraktion aus Gehirn 26. Pardridge 24 geöffnet, das Feld mit dem OX-26 Antikörper gegen den Transferrinrezeptor (TfR), gefolgt von Antikörper gegen den Insulinrezeptor und den Insulin-Wachstumsfaktor-Rezeptor 27,28. Mit diesen Antikörper basierte Vektoren, hat ArmaGen Technologies einen BBB molekularen Trojaner-Plattform-Technologie über die BBB 29 entwickelt, um Medikamente zu liefern, einschließlich Proteinen. DieLiteratur ist reich an Daten, die LRP1-Expression in Endothelzellen des Gehirns und seiner Rolle als leistungsfähiges endozytischen / Scavenger-Rezeptor. Western-Blot-Analyse ergab, dass LRP1 wird in Fraktionen in Hirnkapillaren angereichert und im Rattenhirn-Kapillarendothelzellen 30 ausgedrückt. Unternehmen wie Angiochem Ziel LRP1 mit von Aprotinin abgeleitetes Peptid-Vektoren, die effiziente Wirkstoff Zustrom über die BBB 31 zu fördern. Allerdings ist auch in LRP1 aktiven Transport von Aß und seine Auslauf / Abstand von Hirnparenchym, um den Blut 32 beteiligt. Solche Daten beinhalten LRP1 in einem bidirektionalen Transport über die BBB in Abhängigkeit von seiner Liganden. biOasis entwickelt die Transcend Technik unter Verwendung eines Proteins Melanotransferrin für den Transport von biologischen wie lysosomalen Enzymen und Antikörpern durch die BHS 33 während VECT-HORUS entwickelt Peptidvektoren, die LDLR 34 zielen. Es werden Daten darauf hindeutet, dass die LRP und LDL-Rezeptor kann zum Unterschied zu transportierenerent Moleküle wie lysosomale Enzyme 35,36 oder Nanopartikel-Komplexen über die BBB 37. Unsere Interessengebiet ist Arzneimittelabgabe an das ZNS mit Vektormolekülen und vektorisiert Drogenkandidaten für die Behandlung von ZNS-Erkrankungen. Insbesondere weist Arzneimittelabgabe über die BBB in den Kontext der Neuroentzündung, ein Prozess, in dessen Umfang variieren kann berücksichtigt werden, aber das ist wahrscheinlich für alle ZNS-Läsionen und Erkrankungen wie Enzephalitis, multipler Sklerose, Alzheimer-Krankheit usw. Neuroinflammation ist mit BBB-Entzündung und möglicherweise mit Veränderungen in Physiologie und Durchlässigkeit BBB bedenkt, dass parazellulären und transzellulären Transport in pathologischen Bedingungen 38,39,40,41,42,43 verstärkt werden verbunden. Zum Beispiel TNF-α, TWEAK und andere Cytokine modulieren Entzündung und Experimenten mit in vitro BBB Modelle haben gezeigt, dass sie den parazellulären Eigenschaften th zu veränderne endotheliale Zellschicht 38,39,40 und TNF-α führt auch zu einem Anstieg der transzellulären Transport von LDL 41, Holotransferrin 42 und 43 Lactoferrin. Unser Ziel war die Entwicklung und Charakterisierung ein optimiertes und hoch reproduzierbare Ratte syngenen BBB-Modell mit Co-Kulturen von primären Gehirn Endothelzellen und Astrozyten. Wir haben 5 Wochen alt und neonatalen Wistar-Ratten für Gehirn-Endothelzellen-Produktion und Astrozyten-Produktion auf. Eine Herausforderung war es, ein Protokoll, das die Produktion von &quot;Wochen reproduzierbar&quot; BBB-Modelle zu etablieren. Um dieses Ziel zu erreichen, wurde jeder Schritt der Produktion Protokoll an festen Tagen in der Woche durchgeführt, ausgehend vom Gehirn Mikrogefäß Produktion am Mittwoch der ersten Woche. Dissektionen wurden fast jede Woche in den letzten 3 Jahren durchgeführt. Um die Reproduzierbarkeit der Kulturen weiter zu verbessern, wurde ein Qualitätssicherungssystem etabliert. Alle Reagents und Chemikalien wurden in einer Datenbank (Datum der Eintragung, Lager, Verfalldatum, etc.) verwiesen. Das Modell wurde nach einer Reihe von Kriterien, wie Endothelzellen Organisation und Reinheit aus, TEER, LY Durchlässigkeit, Reaktion auf pro-inflammatorische Mittel, qualitative und quantitative Ausdruck der TJ-Proteine, die Funktionalität von Efflux-Transporter wie P-gp, und Rezeptoren in Transzytose durch die endotheliale Zellschicht, wie die TfR oder LDL-Rezeptor beteiligt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="666">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:189px;">Product</td>
			<td style="width:149px;">Company</td>
			<td style="width:153px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:175px;">Comments / expiration term</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:189px;">BSA fraction V low endotoxin</td>
			<td style="width:149px;">PAA</td>
			<td style="width:153px;">K45-011-500g</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15140-122</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:189px;">0,05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">25300-054</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">DMEM High Glucose</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">61965-026</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:189px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">10270-098</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">T75 flasks</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson Falcon</td>
			<td style="width:153px;">353135</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:189px;">HEPES buffer (1 M)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15630-056</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Collagene type IV mouse (10 x 1 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:153px;">356233</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 month</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Fibronectin humain plasma (5 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:153px;">356008</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 month</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Vannas Spring Scissors, straight (9 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">91500-09</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Scissors, straight (9 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">14568-09</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Forceps Dumont #5/45 (11 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11251-35</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Graefe Forceps, tip width 0,8 mm</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11050-10</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Graefe Forceps, curve tip width 0,8 mm</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11051-10</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Collagenases / Dispase mix (2 x 5 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:153px;">05 401 054 001</td>
			<td style="width:175px;">- 20 &#176;C / 3 months</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">DNase I (100 mg / 569 KU / mg)</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">DN25-100 mg</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Gentamicin (10 mg/mL)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15710-049</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">31331-028</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Bovine serum from platelet poor plasma (500 mL)</td>
			<td style="width:149px;">Clinisciences</td>
			<td style="width:153px;">BT-214-100</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:189px;">bFGF (10 &#181;g)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">13256-029</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Heparine Na salt from porcine mucosa Grade I</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H3149-100KU</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Puromycin</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">P8833-10 mg</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">ITSX</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">51500-056</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Polyethylene hanging cell insert for 12-well plates</td>
			<td style="width:149px;">Millipore</td>
			<td style="width:153px;">PIRP15R48</td>
			<td style="width:175px;">Porosity: 1 &#181;m 
			Surface: 1,1 cm2</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H0888-1 g</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Mouse anti-CD31 / PECAM&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:189px;">Rabbit anti-Von Willebrand</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">AB7356</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Desmine</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">MAB3430</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Vimentine</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">08-0052 clone V9, (58 &#181;g/mL)&#160;</td>
			<td style="width:175px;">1/50 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Claudin-5</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">35-2500, (500 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Rabbit anti-ZO-1</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">61-7300 (250 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:189px;">Rabbit anti-Occludine&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">71-1500 (250 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="height:72px;width:189px;">Alexa fluor 488, 594 conjugated secondary antibodies</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:175px;">1/800</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Lucifer yellow CH, dilithium salt</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">L0259</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">TNF-a Human</td>
			<td style="width:149px;">PeproTech</td>
			<td style="width:153px;">300-01A</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Rat MCP-1 ELISA Kit</td>
			<td style="width:149px;">PeproTech</td>
			<td style="width:153px;">900-K59</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Mouse anti-P-glycoprotein</td>
			<td style="width:149px;">Covance, Eurogentec</td>
			<td style="width:153px;">SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/400 - fixation PFA 4% 
			1/200 (western blot)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Rabbit anti-GLT-1</td>
			<td style="width:149px;">Abcam</td>
			<td style="width:153px;">ab41621</td>
			<td style="width:175px;">1/1000 (western blot)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Rhodamine 123</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">83702</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Verapamil hydrochloride</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">V4629</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Cyclosporine A</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">30024</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="122">
			<td height="122" style="height:123px;width:189px;">Monoclonal anti a2 Macroglobulin Receptor (CD91, LRP1) against b-chain of amino acid 4291-4344 within an EGF repeat</td>
			<td style="width:149px;">American Diagnostica</td>
			<td style="width:153px;">3501 (100 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/5 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Mouse anti-LDLR</td>
			<td style="width:149px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:153px;">AF2255 (200 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/50 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">Rat transferrin-Cy3</td>
			<td style="width:149px;">Gentaur</td>
			<td style="width:153px;">JOR160050</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">DiILDL</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">L-3482</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (bbb): a focus on bbb impermeability and receptor-mediated transport

Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​spezifisch reguliert molekularen und zellulären Fluss zwischen Blut und Nervengewebe. Unser Ziel war die Entwicklung und Charakterisierung eines hoch reproduzierbare syngenen Ratten in vitro-Modell der BHS mit Co-Kulturen von primären Ratten-Gehirn-Endothelzellen (RBEC) und Astrozyten an Rezeptoren in Transzytose durch die endotheliale Zellschicht beteiligt studieren. Astrozyten wurden durch mechanische Präparation folgenden Trypsinverdau isoliert und für die spätere Co-Kultur eingefroren. RBEC wurden von fünf Wochen alten Ratte Kortex isoliert. Die Gehirne wurden von Hirnhaut und der weißen Substanz gereinigt und folgende enzymatische Verdauung mechanisch dissoziiert. Danach wurde das Gewebe-Homogenat in Rinderserumalbumin zentrifugiert, um Bruchstücke von Gefäßnervengewebe zu trennen. Die Gefäßfragmente erfuhr eine zweite enzymatische Verdauung freien Endothelzellen aus ihren extrazellulären Matrix. Die restlichen kontaminierenden Zellen wie Perizyten wurden feitere durch Ausplattieren der Mikrogefäßfragmente in Puromycin-haltigem Medium eliminiert. Sie wurden dann auf Filter für Co-Kultur mit Astrozyten am Boden der Vertiefungen gezüchtet agiert. RBEC ausgedrückt hohe Tight Junction (TJ) Proteine ​​wie Occludin, Claudin-5 und ZO-1 mit einem typischen Lokalisation an den Zellgrenzen hinweg. Die transendotheliale elektrischen Widerstand (TEER) von Hirn endothelialen Monoschichten, was die Dichtheit der TJs erreicht 300 Ohm · cm 2 im Durchschnitt. Die Endothelzellen Permeabilitätskoeffizienten (Pe) für Lucifer Yellow (LY) war in hohem Maße reproduzierbar mit einem Durchschnitt von 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min. Gehirn-Endothelzellen in Monoschichten organisiert ausgedrückt Effluxtransporters P-Glykoprotein (P-gp), zeigte einen polarisierten Transport von Rhodamin 123, einem Liganden für P-gp und zeigten spezifische Transport von Transferrin-Cy3 und DiILDL durch die endotheliale Zellschicht. Abschließend bieten wir ein Protokoll für die Einrichtung eines in-vitro-BBB-Modell, das in hohem Maße reproduzierbar durch die Methoden der Qualitätssicherung ist, und das ist für die Forschung auf BBB Transporter und Rezeptoren.

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Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die Reproduzierbarkeit der einem in vitro-Modell mit BBB eine Ratte syngenen Co-Kultur von Endothelzellen und Astrozyten zu validieren. Die Endothel-Zellschicht vorgestellt hohen und niedrigen TEER LY Durchlässigkeit. Expression spezifischer TJ Proteinen wurden funktionellen Antworten zu Entzündungen und Funktionalität von Transportern und Rezeptoren untersucht.

Einrichten einer<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Ratte Blut-Hirn-Schranke (BBB): Ein Fokus auf BBB-Undurchlässigkeit und Rezeptor-vermittelten Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

42.3K Aufrufe.  VECT-HORUS SAS.  Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die Reproduzierbarkeit der einem in vitro-Modell mit BBB eine Ratte syngenen Co-Kultur von Endothelzellen und Astrozyten zu validieren. Die Endothel-Zellschicht vorgestellt hohen und niedrigen TEER LY Durchlässigkeit. Expression spezifischer TJ Proteinen wurden funktionellen Antworten zu Entzündungen und Funktionalität von Transportern und Rezeptoren untersucht. 

Serie: Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a significant obstacle to pharmaceutical treatments of brain disorders as it limits the passage of molecules from the vasculature into the brain tissue to molecules less than approximately 500 Da in size6. FUS induced BBB disruption (BBBD) is temporary and reversible4 and has an advantage over chemical means of inducing BBBD by being highly localized. FUS induced BBBD provides a means for investigating the effects of a wide range of therapeutic agents on the brain, which would not otherwise be deliverable to the tissue in sufficient concentration. While a wide range of ultrasound parameters have proven successful at disrupting the BBB2,5,7, there are several critical steps in the experimental procedure to ensure successful disruption with accurate targeting. This protocol outlines how to achieve MRI-guided FUS induced BBBD in a rat model, with a focus on the critical animal preparation and microbubble handling steps of the experiment.

Microbubble-mediated focused ultrasound disruption of the blood-brain barrier (BBB) is a promising technique for non-invasive targeted drug delivery in the brain1-3. This protocol outlines the experimental procedure for MRI-guided transcranial BBB disruption in a rat model.

MRI-geführten Störung der Blut-Hirn-Schranke mit Hilfe der transkraniellen fokussiertem Ultraschall in einem Rattenmodell

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

Forschung

Medizin

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain barrier1. The barrier selectively excludes molecules from crossing between the blood and the brain based upon their size and charge. This function can impede the delivery of therapeutics for neurological disorders. A number of chemotherapeutic drugs, for example, will not effectively cross the blood-brain barrier to reach tumor cells2. Thus, improving the delivery of drugs across the blood-brain barrier is an area of interest.
The most prevalent methods for enhancing the delivery of drugs to the brain are direct cerebral infusion and blood-brain barrier disruption3. Direct intracerebral infusion guarantees that therapies reach the brain; however, this method has a limited ability to disperse the drug4. Blood-brain barrier disruption (BBBD) allows drugs to flow directly from the circulatory system into the brain and thus more effectively reach dispersed tumor cells. Three methods of barrier disruption include osmotic barrier disruption, pharmacological barrier disruption, and focused ultrasound with microbubbles. Osmotic disruption, pioneered by Neuwelt, uses a hypertonic solution of 25% mannitol that dehydrates the cells of the blood-brain barrier causing them to shrink and disrupt their tight junctions. Barrier disruption can also be accomplished pharmacologically with vasoactive compounds such as histamine5 and bradykinin6. This method, however, is selective primarily for the brain-tumor barrier7. Additionally, RMP-7, an analog of the peptide bradykinin, was found to be inferior when compared head-to-head with osmotic BBBD with 25% mannitol8. Another method, focused ultrasound (FUS) in conjunction with microbubble ultrasound contrast agents, has also been shown to reversibly open the blood-brain barrier9. In comparison to FUS, though, 25% mannitol has a longer history of safety in human patients that makes it a proven tool for translational research10-12.
In order to accomplish BBBD, mannitol must be delivered at a high rate directly into the brain's arterial circulation. In humans, an endovascular catheter is guided to the brain where rapid, direct flow can be accomplished. This protocol models human BBBD as closely as possible. Following a cut-down to the bifurcation of the common carotid artery, a catheter is inserted retrograde into the ECA and used to deliver mannitol directly into the internal carotid artery (ICA) circulation. Propofol and N2O anesthesia are used for their ability to maximize the effectiveness of barrier disruption13. If executed properly, this procedure has the ability to safely, effectively, and reversibly open the blood-brain barrier and improve the delivery of drugs that do not ordinarily reach the brain 8,13,14.

Blood-brain barrier disruption aids the delivery of certain drugs to the brain. Mannitol delivered intra-arterially shrinks cells surrounding blood vessels in order to physically disrupt the barrier.

Rat Modell der Blut-Hirn-Schranke Störung zu Neurovascular Therapeutics Gezielte zulassen

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying mechanisms involved in it are useful for treatment. There are both in vivo and in vitro methods available for this purpose. In vivo models can mimic actual head injury as it occurs during TBI. However, in vivo techniques may not be exploited for studies at the cell physiology level. Hence, in vitro methods are more advantageous for this purpose since they provide easier access to the cells and the extracellular environment for manipulation.
Our protocol presents an in vitro model of TBI using stretch injury in brain microvascular endothelial cells. It utilizes pressure applied to the cells cultured in flexible-bottomed wells. The pressure applied may easily be controlled and can produce injury that ranges from low to severe. The murine brain microvascular endothelial cells (cEND) generated in our laboratory is a well-suited model for the blood brain barrier (BBB) thus providing an advantage to other systems that employ a similar technique. In addition, due to the simplicity of the method, experimental set-ups are easily duplicated. Thus, this model can be used in studying the cellular and molecular mechanisms involved in TBI at the BBB.

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

In vitro traumatic brain injury models are being developed to reproduce in vivo brain deformation. Stretch-induced injury has been employed for astrocytes, neurons, glial cells, aortic, and brain endothelial cells. However, our system uses a blood brain barrier (BBB) model that possesses properties constituting a legitimate model of the BBB to establish an in vitro&#160;TBI model.

Stretchlimousine in Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen (CEND) als<em&gt; In Vitro</em&gt; Traumatische Hirnverletzung Modell der Blut-Hirn-Schranke

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Exzitotoxische Stimulation der Hirn Microslices als<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic cerebrovascular accidents account for 80% of all strokes. A common cause of IR injury is the rapid inflow of fluids following an acute/chronic occlusion of blood, nutrients, oxygen to the tissue triggering the formation of free radicals.
Ischemic stroke is followed by blood-brain barrier (BBB) dysfunction and vasogenic brain edema. Structurally, tight junctions (TJs) between the endothelial cells play an important role in maintaining the integrity of the blood-brain barrier (BBB). IR injury is an early secondary injury leading to a non-specific, inflammatory response. Oxidative and metabolic stress following inflammation triggers secondary brain damage including BBB permeability and disruption of tight junction (TJ) integrity.
Our protocol presents an in vitro example of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) on rat brain endothelial cell TJ integrity and stress fiber formation. Currently, several experimental in vivo models are used to study the effects of IR injury; however they have several limitations, such as the technical challenges in performing surgeries, gene dependent molecular influences and difficulty in studying mechanistic relationships. However, in vitro models may aid in overcoming many of those limitations. The presented protocol can be used to study the various molecular mechanisms and mechanistic relationships to provide potential therapeutic strategies. However, the results of in vitro studies may differ from standard in vivo studies and should be interpreted with caution.

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.

Sauerstoff-Glukose Deprivation und Reoxygenierung als<em&gt; In-vitro-</em&gt; Ischämie-Reperfusion Injury Modell zum Studium der Blut-Hirnschranke Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the brain for visual perception. Damage to RGCs and their axons leads to vision loss and/or blindness. Although the specific cause of glaucoma is unknown, the primary risk factor for the disease is an elevated intraocular pressure. Glaucoma-inducing procedures in animal models are a valuable tool to researchers studying the mechanism of RGC death. Such information can lead to the development of effective neuroprotective treatments that could aid in the prevention of vision loss. The protocol in this paper describes a method of inducing glaucoma - like conditions in an in vivo rat model where 50 &#181;l of 2 M hypertonic saline is injected into the episcleral venous plexus. Blanching of the vessels indicates successful injection. This procedure causes loss of RGCs to simulate glaucoma. One month following injection, animals are sacrificed and eyes are removed. Next, the cornea, lens, and vitreous are removed to make an eyecup. The retina is then peeled from the back of the eye and pinned onto sylgard dishes using cactus needles. At this point, neurons in the retina can be stained for analysis. Results from this lab show that approximately 25% of RGCs are lost within one month of the procedure when compared to internal controls. This procedure allows for quantitative analysis of retinal ganglion cell death in an in vivo rat glaucoma model.

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Glaucoma auslösende Verfahren in ein<em&gt; In Vivo</em&gt; Rat Modell und Whole-mount Retina Vorbereitung

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

In-Vitro- Assays zur Beurteilung der Blut-Hirn-Schranke Mesh-artigen Gefäßbildung und -störung

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

Verbesserte Methode für die Einrichtung einer In-vitro- Blut - Hirn-Schranke Modell auf porcinen Endothelzellen Gehirnzellen basiert

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and subsequent vision loss. The inner blood-retinal barrier (iBRB) is mainly composed of retinal vascular endothelium with low permeability under physiological conditions. This feature of low permeability is tightly regulated and maintained by low rates of paracellular transport between adjacent retinal microvascular endothelial cells, as well as transcellular transport (transcytosis) through them. The assessment of retinal transcellular barrier permeability may provide fundamental insights into iBRB integrity in health and disease. In this study, we describe an endothelial cell (EC) transcytosis assay, as an in vitro model for evaluating iBRB permeability, using human retinal microvascular endothelial cells (HRMECs). This assay assesses the ability of HRMECs to transport transferrin and horseradish peroxidase (HRP) in receptor- and caveolae-mediated transcellular transport processes, respectively. Fully confluent HRMECs cultured on porous membrane were incubated with fluorescent-tagged transferrin (clathrin-dependent transcytosis) or HRP (caveolae-mediated transcytosis) to measure the levels of transferrin or HRP transferred to the bottom chamber, indicative of transcytosis levels across the EC monolayer. Wnt signaling, a known pathway regulating iBRB, was modulated to demonstrate the caveolae-mediated HRP-based transcytosis assay method. The EC transcytosis assay described here may provide a useful tool for investigating the molecular regulators of EC permeability and iBRB integrity in vascular pathologies and for screening drug delivery systems.

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

This protocol illustrates an in vitro endothelial cell transcytosis assay as a model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability by measuring the ability of human retinal microvascular endothelial cells to transport horseradish peroxidase across cells in caveolae-mediated transcellular transport processes.

Endothelzell-Transzytose-Assay als In-vitro-Modell zur Beurteilung der Permeabilität der inneren Blut-Retina-Barriere

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...

In Vitro Application of a Wireless Sensor in Flexion-Extension Gap Balance of Unicompartmental Knee Arthroplasty

Unicompartmental knee arthroplasty (UKA) is an effective treatment for end-stage anteromedial osteoarthritis (AMOA). The key to UKA is the flexion-extension gap balance, which is closely related to postoperative complications such as bearing dislocation, bearing wear, and arthritis progression. The traditional gap balance assessment is performed by indirectly sensing the tension of the medial collateral ligament by a gap gauge. It relies on the surgeon's feel and experience, which is imprecise and difficult for beginners. To accurately assess the flexion-extension gap balance of UKA, we developed a wireless sensor combination consisting of a metal base, a pressure sensor, and a cushion block. After osteotomy, the insertion of a wireless sensor combination allows the real-time measurement of intra-articular pressure. It accurately quantifies the flexion-extension gap balance parameters to guide further femur grinding and tibia osteotomy, to improve the accuracy of gap balance. We conducted an in vitro experiment with the wireless sensor combination. the results showed that there was a difference of 11.3 N after applying the traditional method of flexion-extension gap balance performed by an experienced expert.

In Vitro Application of a Wireless Sensor in Flexion-Extension Gap Balance of Unicompartmental Knee Arthroplasty

This protocol presents a cadaveric study of a wireless sensor used in medial unicompartmental knee arthroplasty. The protocol includes the installation of an angle measuring device, standardized Oxford unicompartmental knee arthroplasty osteotomy, preliminary assessment of flexion-extension balance, and application of the sensor to measure flexion-extension gap pressure.