Die Autoren bedanken sich bei Olivier Manches, Ph.D., Davor Frleta, Ph.D., und Meagan O&#39;Brien, MD für ihre Unterstützung und Rückmeldung zu quittieren. Diese Forschung wurde durch das Nationale Institut für Allergie-und Infektionskrankheiten unterstützt und mit Mitteln aus NIH gewährt Ruth L. Kirschstein National Research Service Awards für Individual Fellowships Predoctoral (F31), um Vielfalt in der Gesundheitsforschung (AI089030) und RO1 (AI081848 Förderung abgeschlossen ).

Ethikerklärung: Forschungsproben gewonnen und für die Forschung mit Zustimmung der Geber gespeichert. Alle Proben sollten codiert oder anonymisiert vor Gebrauch. Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der Institutional Review Board. 1. Differenzierung von humanen Monozyten im peripheren Blut in Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen. Hinweis: Human Buffy Coats dienen als Quelle der menschlichen peripheren Blutzellen (PBMCs) und wurden von der New York Blood Center (New York, NY) erhalten. Blutspender sind gesunden Probanden. Die 5 Tage Verfahren beginnt mit der Beschichtung von humanen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) auf Gewebekulturkolben 35,36. Bemerkenswerte Unterschiede zu den veröffentlichten Protokollen sind die folgenden: <ol><li> Verwenden Sie 225 cm 2 nicht pyrogene Polystyrol-Gewebekulturflaschen mit Filterkappe, insgesamt 2x10 8 PBMCs pro Kolben statt 10 cm Polystyrol-Gewebekulturplatte haftens (58 cm 2) (Schritt 1). </li><li> Planen Medien mit 5% gepooltem Humanserum (PHS, 30 ml) in 500 ml RPMI-1640 + L-Glutamin, 5 ml 1 M HEPES-Puffer und 1,4 ml 50 mg / ml Gentamicin (5% PHS Medien), gefolgt von Filtration durch 20 uM Filter. In insgesamt 50 ml 5% PHS-Medium pro 225 cm 2 Zellkulturflasche. </li><li> Mit 25 ml frischem RPMI-1640-Zellen waschen halten dreimal. Kräftig schütteln für 5 Sekunden bei jedem Waschen und saugen nicht adhärenten Zellen (Schritt 4). </li><li> Add 190 ul von 400 IU / ul IL-4 und 380 &amp;mgr; l von 100 IU / ul GM-CSF pro Kolben (Schritt 3) am Tag 0, 2 und 4. Tag 0 wird definiert als Tag PBMCs werden in Schritt plattiert 1 (Schritt 8). </li><li> Erntetag 5 MoDCs bei einer Konzentration von 1x10 6 Zellen / ml (Schritt 15). </li><li> Verwenden MoDCs sofort in ihren Ruhezustand. Schritte 17-22 werden nie durchgeführt. Anmerkung: Die Proben sollten für beste Ergebnisse so bald wie möglich nach der Entnahme verarbeitet werden. </li><li> Aliquot MoDCs bei einer Konzentrationtion von 2x10 5 Zellen / Vertiefung (200 ul / Vertiefung der 1x10 6 Zellen / ml) in einer 96-Well-Rundbodenplatte (Western-Blot, ELISA, FACS) oder auf eine Poly-L-Lysin behandelt chamberslide (Mikroskopie) für Experimente . Hinweis: Es gibt mindestens vier Bedingungen: Komplett-stimulierten (Negativkontrolle), Grundieren nur nur, Aktivierung und Grundierung, gefolgt von Aktivierung. Bedingungen können erweitert werden, um Verdünnungsmittel Steuerungen für R848 und Nigericin umfassen, falls gewünscht. Wenn der nachgeschaltete Assay ist ICS, sind Duplikate für Isotypkontrollen erforderlich. </li></ol> . 2 Grundierung Inflammasoms - Signal 1 <ol><li> Rekonstitution lyophilisierter R848 in DMSO gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verdünnen Arbeits Lager bei RT mit RPMI-1640. </li><li> In R848 bei 10 uM Endkonzentration Brunnen für 18 Stunden aneignen. Ortszellen in einem Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol> 3 Aktivieren der NLRP3 Inflammasom -. Signal2 <ol><li> Rekonstitution lyophilisierter Nigericin in Ethanol gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verdünnen Arbeits Lager bei RT mit RPMI-1640 vor der Zugabe zu den entsprechenden Bedingungen. </li><li> Nigericin hinzuzufügen bei einer 20 &amp;mgr; M Endkonzentration und zurück in den Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2 für 6 Stunden. Keine Waschschritte treten zwischen Grundierung und während der Aktivierung. Hinweis: Die Sekretion von IL-1β wird durch die Anwesenheit von Calcium-Ionophore erhöht, Brefeldin A, Monensin, Dinitrophenol und Carbonylcyanid-chlorphenylhydrazon 37, 38. Daher Zugabe dieser sekretorischen Inhibitoren sind nicht zu empfehlen, wenn die Analyse Inflammasom Grundierung oder Aktivität, da es die Sekretion von IL-1β zu ändern. </li></ol> 4. IL-1ß-Beispielsammlung <ol><li> Zentrifugieren Sie die Platte mit Zellen und Überstände bei 974 g für 3 min. </li><li> Ohne das Zellpellet zu stören, saugen Sie den Überstand und zu übertragen, um alseparate Rundplatte, um Zytokinsekretion aus den Überständen zu messen. Anmerkung: Die Überstände zeitweilig bei -20 ° C gelagert werden oder -80 ° C zur Langzeitlagerung. </li><li> Dreimaliges Waschen der Zellpellets mit 200 ul 1x PBS bei 974 × g für 3 min, um jede der extrazellulären IL-1β von den zellulären Proben zu entfernen. Hinweis: Beim Waschen Zell-Pellets aus einer 96-Well-Platte, entfernen Sie die Waschplatte durch rasche Inversion in einen Sammelbehälter, so dass die Probe nicht stören. </li></ol> 5. Mess IL-1ß Von Zell-und Überstandsproben <ol><li> Die intrazelluläre Zytokin-Färbung (ICS): Die ICS-Protokoll ist unter 39, 40 beschrieben. Hinweis: nicht die Zellen aussetzen, wenn der nachgeschaltete Assay ist Mikroskopie. Alle Waschschritte und Bestrebungen sollten ohne Störung der Zellschicht / Pellets (abhängig von der stromabwärts-Assay) erfolgen. <ol><li> 100 l 5% PHS Medien in die entsprechenden Wells. Hinzufügengeeignete Menge (ungefähr 1 μl/2x10 5 Zellen oder 1 &amp;mgr; l / Vertiefung) von fluoreszierend markierten α-α-CD11c und CD14 (Marker-Phänotyps, Klon B-Ly6 und MφP9 bezeichnet) oder Isotyp-Kontrolle zu den Zellen für 10 min bei RT im Dunkeln. </li><li> Dreimal Waschen mit 1x PBS bei 974 g für 3 min. </li><li> Fixieren die Zellen durch Zugabe von 100 ul 4% PFA für 20 min bei RT im Dunkeln. </li><li> Pause Point: Waschen mit 100 ul 1x PBS bei 974 g für 3 min und bei 4 ° CO / N in 1x PBS. </li><li> 100 l Permeabilisierung Puffer, um die Zellen für 30 min. Hinweis: Permeabilisierung Puffer 1X PBS mit 0,3% Triton X-100, 1% Rinderserumalbumin (BSA) zur Permeabilisierung besteht und. Bitte nicht stören, wenn adhärenten Zellen nachgeschalteten Test ist Mikroskopie. </li><li> In geeigneten Volumen (ca. 62 ng antibody/2x10 5 Zellen, etwa oder 2,5 ul / Loch) der α-IL-1β-FITC (Klon 8516) oder Isotyp-Kontrolle für2 h in einem Brutschrank bei 37 ° C. </li><li> Waschen der Zellen dreimal mit 200 ul Permeabilisierung Puffer bei 974 × g für 3 min in der Dunkelheit. </li><li> Optional: Fleck mit DAPI, fügen mountant und Deckglas vorsichtig auf einem Glasträger. Lassen mountant zu O / N vor der Aufnahme Mikroskopiebilder heilen. </li><li> Erwerben Sie die Daten, die von FACs oder Mikroskopie. Hinweis: Vergleichen Sie die Isotyp für jede Bedingung an die entsprechende Färbung bei der Analyse von FACs oder Mikroskopie. <ol><li> FACS: Erfassung einer Probe zu einer Zeit. Stellen Sie den FSC / SSC-Gate auf den Live-Zellen, gefolgt von Gating auf CD11c + CD14 - Zellen vor der Analyse der MODC Bevölkerung Pro-IL-1β Färbung. </li><li> Mikroskopie: Stellen Sie die Belichtungszeit mit Hilfe der positive Färbung Probe - R848 behandelt. Verwenden DAPI + Pro-IL-1β + und + DAPI Pro-IL-1β - um den Prozentsatz der Pro-IL-1β + ausdrückt MoDCs bestimmen. </li></ol></li></ol></li><li> SDS-Seite: Immunoblotting durchgeführt wird, um Pro-IL-1β zu erfassen. Hinweis: Die unten beschriebene Technik kombiniert Standard-Immunoblot-Technik, Steigung 4-20% Polyacrylamid-Gel-und Fluoreszenz-oder Chemilumineszenznachweis 41, 42. <ol><li> Lysieren Zellen direkt in 10 ul denaturierende Lyse-Puffer (5 &amp;mgr; l β-mercaptoethanol/950 &amp;mgr; l Laemmli-Probenpuffer gefolgt von einer Verdünnung 1:1 mit Zell-Lyse-Puffer). Übertragen Lysat in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Wärme Lysat auf eine Trockenplatte für 10 min bei 100 ° C. </li><li> Spin Lysats bei 20.800 xg über einen Minizentrifuge für 1 Minute, um das Flüssigkeitsvolumen zu konzentrieren. Pause Punkt: Proben können bei -20 ° C für die kurzfristige Lagerung eingefroren werden. </li><li> Laden Sie das Gesamtvolumen auf das Polyacrylamid-Gel. Führen Sie 140 V durch das Gel-Box für ca. 1 Stunde, oder bis die Farbstofffront das Ende des Gels läuft weg. </li><li> Transfer des Proteins aus dem Polyacrylamid-Gel auf eine PVDF-Immobilon-FL membrane für 90 min bei 100 V Blockieren der Membran mit 5% BSA in Tris gepufferter Kochsalzlösung / 0,1% Tween-20 (TBS-T) 1 Stunde lang. Hinweis: PVDF Immobilon-FL ist am besten für die Verwendung mit Fluoreszenz-Detektion. Eine Membran mit einer anderen Zusammensetzung wird empfohlen, für andere Detektionstechniken, um das Signal-Hintergrund-Verhältnis zu erhöhen. </li><li> Verdünnte primäre und sekundäre Antikörper in 10 ml 5% BSA / TBS-T. Führen primären Antikörper Inkubation bei 4 ° CO / N unter Schütteln und sekundären Antikörper bei RT für 1 h unter Schütteln. </li><li> 3-mal Waschen Sie die Membran mit TBS-T für 5 min unter Schütteln zwischen primären und sekundären Antikörperinkubationen wieder zwischen Sekundär Inkubationen und Bildgebung. Anmerkung: Die Bänder können mit fluoreszierenden oder chemilumineszenten Detektion detektiert werden. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für die Erkennung. </li></ol></li><li> ELISA: Die Proben, die für die Lagerung eingefroren werden, müssen vor der Analyse auf Raumtemperatur ins Gleichgewicht. Spin down Proben in einer Zentrifuge, um Überstand condens konsolidierenation. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers für die Messung von IL-1β. Hinweis: In diesem Protokoll IL-1β ist speziell gemessen; jedoch die gleichzeitige Messung von TNF &amp;agr;, IL-6, und die immunmodulatorische Zytokin IL-10 sorgt für die geeigneten Bedingungen vorbereitet wurden. </li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.

Inflammatorische Zytokine sind integrale bei der Steuerung der angeborenen und adaptiven Immunantwort auf Virusinfektion zu kämpfen. Sezernierte IL-1β wurde gezeigt, dass während der Influenza-Infektion 3, 43, 44 zu erhöhen. Die genauen Mechanismen, durch die diese Zytokine werden als Reaktion auf Viruserkennung in menschlichen dendritischen Zellen nicht vollständig verstanden. Myeloische DC-Isolierungs-Kits sind teuer und zeitaufwendig. Isolation Kits und FAC Sortierung kann unbeabsichtigt Stress oder a...

Die Aktivierung des angeborenen Immunsystems ist erforderlich, um adaptive Immunantwort während der Infektion, Krankheit und Impfung 7 lenken. Dendritische Zellen sind die wirksamsten Antigen-präsentierenden Zellen des angeborenen Immunsystems; sie für die Aufnahme von Antigenen, die Migration in die Lymphknoten und die Aktivierung von naiven CD4 + und CD8 +-cytolytischen T-Zellen 8-10 spezialisiert sind. Um eine schnelle Erregernachweis ermöglichen das angeborene Immunsystem nutzt zahlreiche Keimbahn kodiert pattern recognition receptors (PRR), die konservierte Pathogen abgeleiteten Motive oder Wirt stammt Marker der Zellstress und Schäden zu erkennen. Toll-like-Rezeptoren (TLRs) sind Membran-gebundene Mustererkennungsrezeptoren, die bestimmte extrazelluläre Erreger phagozytierten associated molecular patterns (PAMPs) und Gefahren associated molecular patterns (gedämpft) zu erkennen. Im Gegensatz Nicken like Rezeptoren (NLR) sind cytosolische und reagieren auf ein breites Spektrum von PAMPs und dämpft. Nod-like-Rezeptoren wiederpräsentieren eine zweite Verteidigungslinie gegen Krankheitserreger, die Zelloberfläche und endozytischen PRRs entziehen. Das Zusammenspiel der Erreger stammt, oder &quot;Gefahr&quot; verbunden sind, Faktoren, die mit TLR-Liganden und NLR führt zu einem Zustand der DC-Reifung zu erhöhten DC Interaktion mit anderen Immunzellen und die Förderung der T-Zell-und Zell-Aktivierung natürlicher Killer 11. Interleukin-1β ist ein entscheidender Bestandteil der Immunabwehr gegen Infektionen. Bei Erkennen eines Mikroorganismus, der hoch proinflammatorische Cytokin IL-1β, wird sezerniert und wirkt als ein chemo Lockstoff und Aktivator der angeborenen und erworbenen Immunzellen. In vivo IL-1β ist weitgehend für die Akutphasenreaktion, einschließlich Fieber und inflammatorischen Cytokins verantwortlich 12 Synthese. Die meisten NLRs enthalten eine C-terminale Leucin-reichen Repeat-Domäne, das vermutlich in der Ligandenerkennung, einem zentralen Nukleotid-Bindungsdomäne (NACHT), die impo ist funktionierenrtant für NLRP3 Oligomerisierung und einer N-terminalen Effektor-Domäne (PYD in NLRP3), die Signaltransduktion vermittelt den nachgeschalteten Ziele durch Protein-Protein-Interaktionen. Die NLRP3 Protein definiert den am intensivsten untersuchten Inflammasom komplex. Dieses Protein ist ein Mitglied der Familie NLR und hat die Fähigkeit, eine Mehrmolekularproteinkomplex NLRP3, Adaptorproteins PYCARD (auch bekannt als ASC) und ICE zusammen bilden. Nach Aktivierung Inflammasom PYCARD bindet an NLRP3 N-terminalen Domänen und rekrutiert ICE über Caspase-Aktivierung und Rekrutierung Domäne (CARD)-Domänen. Interleukin-1-Converting-Enzym wird anfänglich als ein Zymogen, das eine CARD-Motiv am N-Terminus erzeugt wird. Inflammasom Bildung führt zu bringen zwei ICE-Moleküle nahe genug, um ihre autokatalytische Aktivierung zu induzieren. Das Inflammasom Komplex ist für die Aktivierung ICE so dass es zytoplasmatischen Pro-IL-1β umwandeln Zytokin reifen erforderlich. Erfolgreiche Sekretion von IL-1β in DCs erfordert Nachweis von zwei verschiedenen und unabhängigen Gefahrensignale. Zunächst TLR Erkundung von PAMPs, dämpft oder Cytokine Signaling (TNF oder IL-1β) bewirkt eine Hochregulation von Zytoplasma-Pro-IL-1β-Protein-Expression. Für Inflammasom Komplexbildung vor der ICE Reifung Eine zweite, oft anders, Signal erforderlich. Ein paar Inflammasom stimulierende Signale sind bakterielle Membran porenbildende Toxine (wie Nigericin), lysosomale stören Kristalle (wie Mononatriumuratkristallen, MSU) und extrazelluläre ATP. Der Upstream-Mechanismus, der zu Inflammasom Aktivierung durch diese unterschiedlichen Aktivatoren NLRP3 ist unklar. Studien, die vor der Signal Inflammasom Bildung schlägt vor, dass die intrazelluläre Ereignisse, wie die Induktion von Hypokaliämie oder reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die indirekt 13-28 Inflammasom aktivieren. Unter den verschiedenen virale Aktivatoren des NLRP3 Inflammasom ist Influenza, die b bietetoth die Primär-und Sekundärsignal für IL-1β Sekretion 3, 29-33 erforderlich. Mit der Maus NLRP3 Knockout-Modelle wurde gefunden, dass IL-1β-Sekretion in DCs ist abhängig NLRP3 32. Zusätzlich zog NLRP3 Knockout-Mäuse weniger Leukozyten an den Ort der Infektion und erfahrenen höhere Mortalität 2, 5. Zwei neuere Arbeiten legen nahe, einen Mechanismus für die NLRP3 Inflammasom Aktivierung während der Influenza-Virus-Infektion; erste, Grundieren durch Erkennung der viralen RNA durch TLR7 oder TLR8 (abhängig von TLR-Expression der Zelle reagiert) oder durch Erfassung von kommensalen Bakterien von anderen TLR zytoplasmatische Pro-IL-1β-Expression zu induzieren, gefolgt von einem zweiten Signal, die Aktivierung von NLRP3 Inflammasom Bildung durch virale Ionenkanalproteins M2 auf dem trans-Golgi-Netzwerk 33, 34. Im letzten Schritt, die Auslösung des NLRP3 Inflammasom ist durch eine Störung der intrazellulären Ionen erreicht &lt;em&gt; Milieu führt zu ROS-Produktion, das ist einfach, durch NLPR3 als Signal an die Inflammasom bilden erfaßt. Doch der genaue Mechanismus der Aktivierung Inflammasom vor der ICE-Aktivität während der Influenza-Infektion noch unklar. Diese Arbeit beschreibt eine Technik, wertvoll für das Studium der NLRP3 Inflammasom im menschlichen MoDCs, die als Grundlage für die weitere Untersuchung der zugrunde liegenden Weg DC basierend IL-1β-Sekretion in Reaktion auf TLR8 Ligation mit R848, gefolgt von der Aktivierung des Inflammasom von einem gut genutzt werden kann bekannt Aktivator der NLRP3, Nigericin. Variationen dieses Verfahrens können mit anderen Zelltypen verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Monozyten, Makrophagen, anderen DC Untergruppen und Epithelzellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1081px;" width="1081">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:179px;">Company</td>
			<td style="width:121px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:391px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">IL-4</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">GM-CSF</td>
			<td style="width:179px;">Genzyme</td>
			<td style="width:121px;">NDC 58468-0180-2</td>
			<td>We acquire this item through our local pharmacy with a prescription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">RPMI 1640 with L-glutamine</td>
			<td style="width:179px;">Cellgro</td>
			<td style="width:121px;">10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Peripheral blood mononuclear cells</td>
			<td style="width:179px;">New York Blood Center</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>PBMCs were isolated from the blood of healthy donors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">12-well tissue culture plates</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">96-well round bottom tissue culture plates</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-IL-1&#946;-FITC</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;">IC201F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">FITC isotype control</td>
			<td style="width:179px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:121px;">130-092-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-&#946;-Tubulin</td>
			<td style="width:179px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:121px;">SC-9014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-IL-1&#946;</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;">mab201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">PVDF Immobilon-FL membrane</td>
			<td style="width:179px;">Millipore</td>
			<td style="width:121px;">IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">gradient 4-12 % polycrylamide gel</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-1159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">laemmli sample buffer</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">BSA</td>
			<td style="width:179px;">Equitech Bio Inc</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>30% solution sterile/filtered</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">PFA</td>
			<td style="width:179px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:121px;">15710</td>
			<td>16% solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">human inflammatory cytokine bead array kit</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">551811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">nigericin</td>
			<td style="width:179px;">Invivogen</td>
			<td>tlrl-nig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">R848</td>
			<td>3M Corp.</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-CD14</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">340436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-CD11c</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">555392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">TBS</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>On site stock room</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tween-20</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">P2287-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"><a>Nunc EasYFlask 225cm2, Filter Cap, 70mL working volume, 30/Cs</a></td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">159933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">20 &#956;M Sterile Disposable Filter Units</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">569-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Hepes</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">goat &#945;-mouse IRDye 800CW</td>
			<td style="width:179px;">Licor</td>
			<td style="width:121px;">926-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">donkey &#945;-rabbit IRDye 680RD</td>
			<td style="width:179px;">Licor</td>
			<td style="width:121px;">926-68073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Spectra multicolor broad range protein ladder</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">26634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tris Glycine SDS 10x</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tris Glycine 10x</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-0734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Methanol - 4L</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">A433P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Prolong Gold antifade Reagent with DAPI</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td>P-36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide</td>
			<td style="width:179px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:121px;">354108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activation and measurement of nlrp3 inflammasome activity using il-1&#946; in human monocyte-derived dendritic cells

Entzündliche Prozesse von der Sekretion von Interleukin (IL) -1 resultierenden Familie Zytokinen durch Immunzellen führen zu lokalen oder systemischen Entzündung, Gewebeumbau und Reparatur, und virologische Kontrolle 1, 2. Interleukin-1β ist ein wesentlicher Bestandteil der angeborenen Immunantwort und trägt zu beseitigen eindringende Krankheitserreger und verhindert die Schaffung persistierende Infektion 1-5. Inflammasomes der Schlüssel Signalisierungsplattform für die Aktivierung von Interleukin-1-Converting-Enzym (ICE oder Caspase-1). Die NLRP3 Inflammasom erfordert mindestens zwei Signale in DCs zu IL-1β Sekretion 6 verursachen. Pro-IL-1β-Protein-Expression in ruhenden Zellen begrenzt; daher ist für die IL-1β-Transkription und Proteinexpression eine Vorlaufsignal erforderlich. Ein zweites Signal von NLRP3 zur Bildung des Multiprotein NLRP3 inflammasome erfaßt. Die Fähigkeit der dendritischen Zellen zur Verantwortungd, die für die IL-1β-Sekretion erforderlichen Signale können unter Verwendung eines synthetischen Purin, R848, die durch TLR8 in menschlichen Monozyten prime Zellen gewonnenen dendritischen Zellen (MoDCs) abgetastet wird, gefolgt von der Aktivierung des NLRP3 inflammasome mit dem bakteriellen Toxin getestet werden und Kalium-Ionophor Nigericin. Monozyten-abgeleiteten DCs sind leicht in Kultur produziert und bieten deutlich mehr Zellen als gereinigte menschliche myeloische DCs. Das hier vorgestellte Verfahren unterscheidet sich von anderen inflammasome Assays dadurch, dass sie in vitro menschliche anstelle der Maus abgeleitete DCs so dass für die Untersuchung der inflammasome in menschlichen Erkrankungen und Infektionen.

Diese Techniken messen TLR8 Grundierung mit R848. Die intrazelluläre Zytokin-Färbung für Pro-IL-1β ermöglicht für die Mikroskopie und FACS-Positionsanzeigen von CD14 - CD11c + MoDCs. Beide Techniken können relativ zu einem nicht grundierten oder Ruhe, Zellkontrolle sowie eine Isotyp-Kontrolle (Fig. 1 und 2) quantifiziert werden. Prozent pro-IL-1β + färbenden Zellen durch die geometrische Mitte dieser Population multipliziert, um die mittlere Fluoreszenzintensit?...

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Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&amp;#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Dendritische Zellen (DCs) sezernieren IL-1β in Reaktion auf TLR8 Anerkennung von synthetischen Purin, R848, gefolgt von NLRP3 Inflammasom Aktivierung mit Nigericin daher, IL-1β kann verwendet werden, um NLRP3 Inflammasom Aktivität zu messen. Die intrazelluläre Zytokin-Färbung, Immunoblotting und ELISA werden verwendet, um NLRP3 Inflammasom Grundieren und Aktivierung über IL-1β Ausdruck genau zu messen.

Aktivierung und Messung der NLRP3 Inflammasom Aktivität mit IL-1β in humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

activation-measurement-nlrp3-inflammasome-activity-using-il-1-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

20.7K Aufrufe.  New York University School of Medicine.  Dendritische Zellen (DCs) sezernieren IL-1β in Reaktion auf TLR8 Anerkennung von synthetischen Purin, R848, gefolgt von NLRP3 Inflammasom Aktivierung mit Nigericin daher, IL-1β kann verwendet werden, um NLRP3 Inflammasom Aktivität zu messen. Die intrazelluläre Zytokin-Färbung, Immunoblotting und ELISA werden verwendet, um NLRP3 Inflammasom Grundieren und Aktivierung über IL-1β Ausdruck genau zu messen. 

Serie: Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin which forms an insoluble clot that stops hemorrhage. Factor V (FV) in its activated form, FVa, is a critical cofactor for the protease FXa and accelerator of thrombin generation during fibrin clot formation as part of prothrombinase 1, 2. Manual FV assays have been described 3, 4, but they are time consuming and subjective. Automated FV assays have been reported 5-7, but the analyzer and reagents are expensive and generally provide only the clot time, not the rate and extent of fibrin formation. The microplate platform is preferred for measuring enzyme-catalyzed events because of convenience, time, cost, small volume, continuous monitoring, and high-throughput 8, 9. Microplate assays have been reported for clot lysis 10, platelet aggregation 11, and coagulation Factors 12, but not for FV activity in human plasma. The goal of the method was to develop a microplate assay that measures FV activity during fibrin formation in human plasma.
This novel microplate method outlines a simple, inexpensive, and rapid assay of FV activity in human plasma. The assay utilizes a kinetic microplate reader to monitor the absorbance change at 405nm during fibrin formation in human plasma (Figure 1) 13. The assay accurately measures the time, initial rate, and extent of fibrin clot formation. It requires only &mu;l quantities of plasma, is complete in 6 min, has high-throughput, is sensitive to 24-80pM FV, and measures the amount of unintentionally activated (1-stage activity) and thrombin-activated FV (2-stage activity) to obtain a complete assessment of its total functional activity (2-stage activity - 1-stage activity).
Disseminated intravascular coagulation (DIC) is an acquired coagulopathy that most often develops from pre-existing infections 14. DIC is associated with a poor prognosis and increases mortality above the pre-existing pathology 15. The assay was used to show that in 9 patients with DIC, the FV 1-stage, 2-stage, and total activities were decreased, on average, by 54%, 44%, and 42%, respectively, compared with normal pooled human reference plasma (NHP).
The FV microplate assay is easily adaptable to measure the activity of any coagulation factor. This assay will increase our understanding of FV biochemistry through a more accurate and complete measurement of its activity in research and clinical settings. This information will positively impact healthcare environments through earlier diagnosis and development of more effective treatments for coagulation disorders, such as DIC.

This study describes a novel microplate assay that measures FV coagulation activity during fibrin clot formation in human plasma which has not been reported previously. The method uses a kinetic microplate reader to continuously measure the change in absorbance at 405nm during fibrin clot formation in human plasma.

Messung der Faktor V-Aktivität in humanem Plasma unter Verwendung eines Mikroplatten Koagulationsanalyse

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and pathogenesis of inflammation. Isolation and study of DCs have been important in biological research because of their distinctive features. Although they are essential key mediators of the immune system, DCs are very rare in blood, accounting for approximately 0.1 - 1% of total blood mononuclear cells. Therefore, alternatives for isolation methods rely on the differentiation of DCs from monocytes isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The utilization of proper isolation techniques that combine simplicity, affordability, high purity, and high yield of cells is imperative to consider. In the current study, two distinct methods for the generation of DCs will be compared. Monocytes were selected by adherence or negatively enriched using magnetic separation procedure followed by differentiation into DCs with IL-4 and GM-CSF. Monocyte and MDDC viability, proliferation, and phenotype were assessed using viability dyes, MTT assay, and CD11c/ CD14 surface marker analysis by imaging flow cytometry. Although the magnetic separation method yielded a significant higher percentage of monocytes with higher proliferative capacity when compared to the adhesion method, the findings have demonstrated the ability of both techniques to simultaneously generate monocytes that are capable of proliferating and differentiating into viable CD11c+ MDDCs after seven days in culture. Both methods yielded &gt; 70% CD11c+ MDDCs. Therefore, our results provide insights that contribute to the development of reliable methods for isolation and characterization of human DCs.

This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.

Charakterisierung von humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen durch Imaging Durchflusszytometrie: Ein Vergleich zwischen zwei Monozyt Isolation Protokolle

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Herstellung von menschlichen Monozyten abgeleiteten Dendritischen Zellen aus Vollblut

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

Entwicklung und Validierung eines empfindsamen Einzelmolekül Array digitale Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay für menschliche Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

Erkennung von Inflammasome Aktivierung und Pyroptotic Zelltod in murinen Makrophagen Knochenmark abgeleitet

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of monocyte-derived macrophages can impair wound healing. We showed that high fat and high sugar diets promote monocyte priming and dysfunction, converting healthy blood monocytes into a hyper chemotactic phenotype poised to differentiate into macrophages with dysregulated activation profiles and impaired phenotypic plasticity. The over-recruitment of monocyte-derived macrophages and recruitment of macrophages with dysregulated activation profiles is believed to be a major contributor to the development of chronic inflammatory diseases associated with metabolic disorders, including atherosclerosis and obesity. The goal of this protocol is to quantify the chemotactic activity of blood monocytes as a biomarker for monocyte priming and dysfunction and to characterize the macrophage phenotype blood monocytes are poised to differentiate into in these mouse models. Using single cell Western blot analysis, we show that after 24 h 33%of cells recruited into MCP-1-loaded basement membrane-derived gel plugs injected into mice are monocytes and macrophages; 58% after day 3. However, on day 5, monocyte and macrophage numbers were significantly decreased. Finally, we show that this assays also allows for the isolation of live macrophages from the surgically retrieved basement membrane-derived gel plugs, which can then be subjected to subsequent characterization by single cell Western blot analysis.

Here we present a protocol to quantify the chemotactic activity of blood monocytes in mouse models, to assess the effects of nutritional, pharmacological and genetic interventions on blood monocyte and to characterize the blood monocytes derived macrophages in mouse models using monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-loaded basement membrane-derived gel plugs.

Quantifizierung der monozytenchemotaktischen Aktivität in Vivo und Charakterisierung von Blutmonozyten abgeleiteten Makrophagen

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas autophagic flux is only observed in iDCs. To gain mechanistic insights, we developed efficient strategies to interfere with HSV-1-induced autophagic turnover. An inhibitor-based strategy, to modulate HSV-1-induced autophagy, constitutes the first choice, since it is an easy and fast method. To circumvent potential unspecific off-target effects of such compounds, we developed an alternative siRNA-based strategy, to modulate autophagic turnover in iDCs upon HSV-1 infection. Indeed, electroporation of iDCs with FIP200-specific siRNA prior to HSV-1 infection is a very specific and successful method to ablate FIP200 protein expression and thereby to inhibit autophagic flux. Both presented methods result in the efficient inhibition of HSV-1-induced autophagic turnover in iDCs, whereby the siRNA-based technique is more target specific. An additional siRNA-based approach was developed to selectively silence the protein expression of KIF1B and KIF2A, facilitating autophagic turnover upon HSV-1 infection in mDCs. In conclusion, the technique of siRNA electroporation represents a promising strategy, to selectively ablate the expression of distinct proteins and to analyze their influence upon an HSV-1 infection.

In this study, we present inhibitor- and siRNA-based strategies to interfere with autophagic flux in Herpes simplex virus type-1 (HSV-1)-infected monocyte-derived dendritic cells.

siRNA Elektroporation zur Modulation der Autophagie bei Herpes Simplex Virus Typ 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic inflammation. Neutrophil ETs (NETs) consist of a mesh of DNA, histone proteins, and various granule proteins (i.e., myeloperoxidase, elastase, and cathepsin G). Other immune cells, including macrophages, can also produce ETs; however, to what extent this occurs in vivo and whether macrophage extracellular traps (METs) play a role in pathological mechanisms has not been examined in detail. To better understand the role of METs in inflammatory pathologies, a protocol was developed for visualizing MET release from primary human macrophages in vitro, which can also be exploited in immunofluorescence experiments. This allows further characterization of these structures and their comparison to ETs released from neutrophils. Human monocyte-derived macrophages (HMDM) produce METs upon exposure to different inflammatory stimuli following differentiation to the M1 pro-inflammatory phenotype. The release of METs can be visualized by microscopy using a green fluorescent nucleic acid stain that is impermeant to live cells (e.g., SYTOX green). Use of freshly isolated primary macrophages, such as HMDM, is advantageous in modeling in vivo inflammatory events that are relevant to potential clinical applications. This protocol can also be used to study MET release from human monocyte cell lines (e.g., THP-1) following differentiation into macrophages with phorbol myristate acetate or other macrophage cell lines (e.g., the murine macrophage-like J774A.1 cells).

Presented here is a protocol to detect macrophage extracellular trap (MET) production in live cell culture using microscopy and fluorescence staining. This protocol can be further extended to examine specific MET protein markers by immunofluorescence staining.

In Vitro Stimulation und Visualisierung der extrazellulären Trap-Freisetzung in differenzierten menschlichen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct regulation of inflammatory signaling and is activated by proximity-induced dimerization following recruitment to inflammasomes. Caspase-1 is abundant in the monocytic cell lineage and induces maturation of the pro-inflammatory cytokines interleukin (IL)-1&#946; and IL-18 to active secreted molecules. The other inflammatory caspases, caspase-4 and -5 (and their murine homolog caspase-11) promote IL-1&#946; release by inducing pyroptosis. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is a tool used to measure inflammatory caspase induced proximity as a readout of caspase activation. The caspase-1, -4, or -5 prodomain, which contains the region that binds to the inflammasome, is fused to non-fluorescent fragments of the yellow fluorescent protein Venus (Venus-N [VN] or Venus-C [VC]) that associate to reform the fluorescent Venus complex when the caspases undergo induced proximity. This protocol describes how to introduce these reporters into primary human monocyte-derived macrophages (MDM) using nucleofection, treat the cells to induce inflammatory caspase activation, and measure caspase activation using fluorescence and confocal microscopy. The advantage of this approach is that it can be used to identify the components, requirements, and localization of the inflammatory caspase activation complex in living cells. However, careful controls need to be considered to avoid compromising cell viability and behavior. This technique is a powerful tool for the analysis of dynamic caspase interactions at the inflammasome level as well as for the interrogation of the inflammatory signaling cascades in living MDM and monocytes derived from human blood samples.

This protocol describes the workflow to obtain monocytes-derived macrophages (MDM) from human blood samples, a simple method to efficiently introduce inflammatory caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) reporters into human MDM without compromising cell viability and behavior, and an imaging-based approach to measure inflammatory caspase activation in living cells.

Visualisierung von entzündlichen Kaspasen induzierter Nähe in humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and play a unique role within the immune system by linking the innate and adaptive immune responses. These cells can phagocytize and then present captured antigens to effector immune cells, triggering a diverse range of immune responses. This paper demonstrates a standardized method for the in vitro generation of bovine monocyte-derived dendritic cells (MoDCs) isolated from cattle peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and their application in evaluating vaccine immunogenicity.
Magnetic-based cell sorting was used to isolate CD14+ monocytes from PBMCs, and the supplementation of complete culture medium with interleukin (IL)-4 and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) was used to induce the differentiation of CD14+ monocytes into naive MoDCs. The generation of immature MoDCs was confirmed by detecting the expression of major histocompatibility complex II (MHC II), CD86, and CD40 cell surface markers. A commercially available rabies vaccine was used to pulse the immature MoDCs, which were subsequently co-cultured with naive lymphocytes.
The flow cytometry analysis of the antigen-pulsed MoDCs and lymphocyte co-culture revealed the stimulation of T lymphocyte proliferation through the expression of Ki-67, CD25, CD4, and CD8 markers. The analysis of the mRNA expression of IFN-&#947; and Ki-67, using quantitative PCR, showed that the MoDCs could induce the antigen-specific priming of lymphocytes in this in vitro co-culture system. Furthermore, IFN-&#947; secretion assessed using ELISA showed a significantly higher titer (**p &#60; 0.01) in the rabies vaccine-pulsed MoDC-lymphocyte co-culture than in the non-antigen-pulsed MoDC-lymphocyte co-culture. These results show the validity of this in vitro MoDC assay to measure vaccine immunogenicity, meaning this assay can be used to identify potential vaccine candidates for cattle before proceeding with in vivo trials, as well as in vaccine immunogenicity assessments of commercial vaccines.

The methodology describes the generation of bovine monocyte-derived dendritic cells (MoDCs) and their application for the in vitro evaluation of antigenic candidates during the development of potential veterinary vaccines in cattle.

Bestimmung der Immunogenität von Impfstoffen anhand von dendritischen Zellen aus Rindermonozyten

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...