Dieses Protokoll stellt einen funktionellen In-vitro-Assay dar, bei dem aus Rindermonozyten gewonnene dendritische Zellen verwendet werden, um die Immunogenität von Impfstoffen vor In-vivo-Studien zu messen. Damit wird eine bestehende Lücke in der Nutztiervakzinologie geschlossen. Es ist die Erzeugung und Anwendung von dendritischen Zellen.
Als potenteste antigenpräsentierende Zellen sind dendritische Zellen zu einem wichtigen Forschungsziel für das Verständnis intrazellulärer Immunmechanismen, einschließlich der Wirksamkeit von Impfstoffen, geworden. Dieser Assay kann als Werkzeug für das Screening von Impfstoffkandidaten, als Qualitätskontrollstatus für die Impfstoffproduktion sowie für die Antigen- und Adjuvansauswahl eingesetzt werden. Richard Kangethe, Wissenschaftler im Labor für Tierproduktion und Tiergesundheit, demonstriert das Verfahren.
Beginnen Sie damit, das Blut aus der Halsvenenpunktion des Kalbes umzukehren und mit heparinisierten Vacutainern zu mischen. Anschließend werden 20 Milliliter heparinisiertes Blut in ein steriles 50-Milliliter-Röhrchen überführt und mit 10 Millilitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS verdünnt. Pipettieren Sie 15 Milliliter Lymphozyten-Isolationsmedium in ein steriles 50-Milliliter-Röhrchen und kippen Sie das Röhrchen in eine 45-Grad-Position.
Legen Sie vorsichtig 30 Milliliter PBS-Blutmedium mit einer 25-Milliliter-Pipette auf die Lymphozytenisolierung und bringen Sie das Röhrchen langsam wieder in eine vertikale Position, bevor Sie es zentrifugieren. Sammeln Sie dann die dünne weiße Schicht der mononukleären Zellen des peripheren Blutes oder der PBMC-Schicht mit einer Pasteurpipette und übertragen Sie sie in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen. Waschen Sie die geernteten PBMCs zweimal mit 40 Millilitern PBS pro Waschgang und mischen Sie sie gründlich.
Nach dem Zentrifugieren wird das Pellet in 15 Milliliter Ammoniumchlorid-Kaliumpuffer oder ACK-Puffer resuspendiert. Nach 10 bis 15 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur fügen Sie bis zu 40 Milliliter PBS hinzu und zentrifugieren das Röhrchen mit maximaler Beschleunigung und Verzögerung. Resuspendieren Sie das Pellet in 10 Milliliter des vollständigen Nährmediums.
Fügen Sie dann fünf Mikroliter CD14 MicroBead-Puffer pro 10 Millionen Zellen hinzu und mischen Sie sie gründlich mit einer Pipette. Für die Durchflusszytometrie-Analyse werden 10 Mikroliter CD14-Fluorescein-Isothiocyanat oder FITC-Färbeantikörper zu den PBMCs gegeben und 15 Minuten bei vier bis acht Grad Celsius inkubiert, bevor Sie mit der Durchflusszytometrie fortfahren. Fügen Sie den ungefärbten PBMCs einen Milliliter Faxpuffer hinzu und zentrifugieren Sie ihn sieben Minuten lang bei 500 g und vier Grad Celsius.
Anschließend wird das Pellet in 500 Mikrolitern Faxpuffer pro 100 Millionen Zellen resuspendiert. Als nächstes setzen Sie die immunomagnetische Zelltrennsäule in den Separator ein und platzieren Sie ein 50-Milliliter-Sammelröhrchen unter dem Säulenauslass zum Auffangen des Durchflusses. Nachdem Sie die Säule mit einem Milliliter entgastem Faxpuffer gewaschen haben, ersetzen Sie das gebrauchte 15-Milliliter-Röhrchen durch ein neues.
Pipettieren Sie jeweils hundert Millionen Zellen in 500 Mikroliter Puffer, damit die Zellsuspension die Säule passieren kann. Spülen Sie die Säule anschließend dreimal mit jeweils drei Millilitern entgastem Faxpuffer aus. Nach der Erfassung des Durchflusses wird die erste eluierte naive Lymphozytenfraktion als CD14-negative Zellfraktion markiert.
Nehmen Sie die Säule aus dem Abscheider und legen Sie einen neuen sterilen 15-Milliliter-Schlauch für die Abwassersammlung unter die Säule. Geben Sie fünf Milliliter Faxpuffer in die Säule und drücken Sie ihn sofort mit dem Kolben durch. Sammeln und markieren Sie die zweite Durchfluss- oder die naive Monozytenfraktion als CD14-positive Zellfraktion.
Fügen Sie den geernteten CD14-positiven Monozyten ein komplettes Nährmedium hinzu, um 1 Million Zellen pro Milliliter zu erhalten. Geben Sie als Nächstes einen Milliliter Zellsuspension in jede Vertiefung einer sterilen 24-Well-Platte, bevor Sie jede Vertiefung mit 40 Mikrolitern des im Kit enthaltenen Zytokincocktails ergänzen. Übertragen Sie am zweiten Tag die Hälfte des Inhalts jeder Vertiefung mit einer Pipette in einzelne 1,5-Milliliter-Röhrchen.
Nachdem Sie die 1,5-Milliliter-Röhrchen sieben Minuten lang bei 500 g zentrifugiert haben, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern frischem Nährmedium. Übertragen Sie 500 Mikroliter dieser resuspendierten Zellsuspension zurück in die entsprechenden Vertiefungen, so dass das Endvolumen in der Vertiefung einen Milliliter beträgt. Reichern Sie jede Vertiefung mit 20 Mikrolitern Zytokincocktail an.
Um antigengepulste MoDCs zu erzeugen, fügen Sie einen Mikroliter pro Milliliter Tollwutvirusimpfstoff oder RV-Suspension zu einem Milliliter naiver MoDC-Kultur in der 24-Well-Platte hinzu und inkubieren Sie die Platte 48 Stunden lang bei 5 % Kohlendioxid und 37 Grad Celsius. Halten Sie am siebten Tag die 24-Well-Platte mit den antigengepulsten MoDCs 10 Minuten lang auf Eis, bevor Sie einen Milliliter eiskaltes PBS pro Well hinzufügen und gründlich mischen. Übertragen Sie die Suspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen.
Waschen Sie die Vertiefungen mit zwei Millilitern eiskaltem PBS. Sammeln Sie die verbleibenden Zellen in jeder Vertiefung und füllen Sie den gewaschenen Inhalt in die entsprechenden Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 g für sieben Minuten.
Nach dem Verwerfen des Überstands wird das antigengepulste MoDCs-Zellpellet in einem vollständigen Nährmedium resuspendiert, um die Endkonzentration von 100.000 Zellen pro Milliliter einzustellen. Für die MoDC-Lymphozyten-Kokultur werden die Vertiefungen einer sterilen 24-Well-Platte am siebten Tag des Antigenpulses mit einem Milliliter der naiven Lymphozytenzellsuspension und einem Milliliter antigengepulster oder nicht-antigengepulster MoDC-Suspension besiedelt. Nach zwei Tagen Inkubation wird jede Vertiefung mit 20 Nanogramm rekombinantem Interleukin-2 pro Milliliter ergänzt und die Inkubation für weitere 120 Stunden fortgesetzt.
Übertragen Sie am 14. Tag einen Milliliter der Co-Kultur in ein steriles 1,5-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie das Röhrchen. Anschließend wird das Zellpellet mit einem Milliliter antigengepulsten oder nicht gepulsten MoDCs resuspendiert. Gut mischen und die Zellsuspensionen in die entsprechenden Vertiefungen überführen.
Nach der Färbung der PBMCs und der naiven Lymphozyten und Monozyten auf der Zelloberfläche wird ein Milliliter der Zellsuspension mit einer Pipette in ein steriles 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt und 10 Minuten lang bei 500 g zentrifugiert. Dann resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter PBS und füllen Sie es in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Sammeln Sie auch die Restzellen und die entsprechenden Röhrchen mit einem Milliliter PBS.
Geben Sie dann 10 Milliliter PBS in das 15-Milliliter-Röhrchen mit den Zellen und mischen Sie es durch Pipettieren. Nachdem Sie das Röhrchen sieben Minuten lang bei 850 g zentrifugiert haben, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig mit der Restsuspension, die nach dem Dekantieren des Überstands übrig bleibt. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 96-Well-Platte mit V-Boden und versiegeln Sie die Wells, um ein Verschütten zu vermeiden.
Sobald die Färbung abgeschlossen ist, führen Sie die Durchflusszytometeranalyse durch. Passen Sie in der Echtzeitvorschau den Schwellenwert für die Fluoreszenz an, einschließlich Spannung und Verstärkung sowie der Zellgröße, um schließlich Gates um die gewünschte Zellpopulation zu zeichnen und gleichzeitig zelluläre Trümmer auszuschließen. CD14-Zellfärbung und Durchflusszytometrie zeigten, dass die naive Monozytenfraktion zu 98% aus CD14-positiven Monozytenzellen bestand und funktionell zur Antigenaufnahme fähig war.
Die naiven MoDCs, die phänotypisch durch die Untersuchung der Expression von MHC Klasse 2 und co-stimulatorischen CD86- und CD40-Zelloberflächenmarkern charakterisiert wurden, validierten die dendritischen Zellen oder den DC-ähnlichen Phänotyp. Während der MoDC-Lymphozyten-Kokultur am neunten Tag wurde eine morphologische Veränderung beobachtet, die eine Dendritenverlängerung im RV-Puls zu MoDCs zeigte. Im Vergleich zur nicht-gepulsten MoDC-Lymphozytenkultur konnte eine signifikante Erhöhung der Lymphozytenproliferation durch die Hochregulation der Ki67- und CD25-Aktivierungsmarker auf den CD4-positiven und CD8-positiven T-Zellen an Tag 16 in der gepulsten MoDC-Lymphozyten-Kokultur nachgewiesen werden.
Die CD8-positiven T-Zellen aus den reifen RV-gepulsten MoDC-Co-Kulturen zeigten eine achtfache Hochregulation von Ki67 im Vergleich zur unspezifischen Gruppe. Die CD4-positiven Zellen in der gleichen Co-Kultur zeigten einen siebenfachen Anstieg von Ki67 im Vergleich zu Kontrollen, was die Fähigkeit von RV-geprimten MoDCs demonstriert, das RV-Antigen naiven Lymphozyten zu präsentieren und sie in vitro zu aktivieren. Die qPCR-Quantifizierung von Kokulturen zeigte in allen Kokulturen, die GAPDH als Kalibrator verwendeten, einen Anstieg der Interferon-gamma-Expression um mehr als 30 % und einen Anstieg der Ki67-Expression um mehr als 5 %.
Eine signifikant höhere Konzentration von sezerniertem Interferon gamma wurde in der RV-gepulsten MoDC-Lymphozyten-Kokultur im Vergleich zur unspezifischen Behandlungsgruppe beobachtet. Führen Sie den Schichtungsschritt sehr langsam und vorsichtig durch und achten Sie darauf, dass das Blut auf das Lymphozyten-Isolationsmedium gelegt wird. Achten Sie besonders darauf, alle PBMCs zu sammeln, ohne zu viel Material von den anderen Schichten zu sammeln.
Andere Methoden wie Durchflusszytometrie, ELISA und quantitative PCR können nach diesem Verfahren angewendet werden, um die Aktivierung von Immunmarkern zu bewerten.
