Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es verwendet werden kann, um den entzündlichen Kaspaseweg auf molekularer Ebene in lebenden Zellen in einem bestimmten Krankheitszustand zu visualisieren und abzufragen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie verwendet werden kann, um die Komponenten, Anforderungen und die Lokalisation der entzündlichen Caspase-Aktivierungskomplexe in primären Immunzellen zu identifizieren. Mit geringfügigen Optimierungen kann diese Methode an andere Primärzellen und eine Reihe von Proteinen angepasst werden, die durch Oligomerisierung aktiviert werden, und ihre Anwendbarkeit ist nicht auf mikroskopische Methoden beschränkt.
Saugen Sie zunächst die Medien aus vollständig differenzierten Makrophagen auf 10 Zentimeter langes Geschirr und waschen Sie die Zellmonoschicht mit warmem serumfreiem RPMI-1640-Medium, wobei Sie alle Medien vollständig entfernen. Ernten Sie die Zellen, indem Sie zwei Milliliter 0,25% warme Trypsin-EDTA-Lösung pro 10-Zentimeter-Schale hinzufügen. Pipettieren Sie das Trypsin-EDTA vorsichtig mit einer P-1000-Mikropipette über die gesamte Schale und übertragen Sie die Suspension dann auf ein 15-Milliliter-konisches Rohr, das fünf Milliliter warmes Vollkulturmedium enthält.
Überprüfen Sie die Zellablösung unter einem Hellfeldmikroskop und lösen Sie sie bei Bedarf erneut. Aspirieren Sie das Medium und resuspendieren Sie die Zellen in 10 Millilitern 1X sterilem PBS, vorgewärmt auf 37 Grad Celsius. Nehmen Sie dann ein 20-Mikroliter-Aliquot, um die Zellzahl mit einem Hämozytometer zu bestimmen.
Nehmen Sie ein bis zwei Mal 10 bis die fünften Zellen pro Transfektion und legen Sie sie in eine 15-Milliliter-Röhre. Mit vorgewärmtem 1X sterilem PBS auf ein Endvolumen von 15 Millilitern bringen. Den PBS absaugen und noch einmal für eine Minute bei 250 x g zentrifugieren.
Entfernen Sie alle verbleibenden PBS aus dem Zellpellet mit einer P-200-Mikropipette. Nehmen Sie pro Transfektion ein steriles Mikroröhrchen von 1,5 Millilitern und fügen Sie das entsprechende Reporterplasmid und Caspase BiFC-Plasmide in die Kapuze hinzu. Legen Sie die Pipettenstation, das Gerät, die Spitzen, die Elektroporationsröhrchen und die Pipette in eine sterile Laminar-Flow-Haube.
Schließen Sie das Nukleofektionsgerät an und schalten Sie es ein. Geben Sie die Transsektionsparameter im angezeigten Startbildschirm ein. Drücken Sie auf Spannung, geben Sie 1000 ein und drücken Sie auf Fertig, um sie auf 1000 Volt einzustellen.
Drücken Sie auf Breite, geben Sie 40 ein, und drücken Sie Fertig, um den Puls auf 40 Millisekunden einzustellen. Drücken Sie abschließend auf Impulse, geben Sie 2 ein und drücken Sie auf Fertig, um die Anzahl der elektrischen Impulse auf 2 einzustellen. Nehmen Sie einen der Elektroporationsröhrchen und füllen Sie ihn bei Raumtemperatur mit drei Millilitern Elektrolytpuffer E.
Setzen Sie das Elektroporationsrohr in den Pipettenhalter an der Pipettenstation ein und stellen Sie sicher, dass die Elektrode an der Seite des Rohres nach innen zeigt und ein Klickgeräusch zu hören ist, wenn das Rohr eingeführt wird. Nehmen Sie das Zellpellet und fügen Sie 10 Mikroliter vorgewärmten Resuspension R-Puffer für jeweils ein bis zwei mal 10 zu den fünften Zellen hinzu und mischen Sie vorsichtig mit einer P-20-Mikropipette. Fügen Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension zu jedem Transfektionsröhrchen hinzu und mischen Sie vorsichtig mit einer P-20-Mikropipette.
Führen Sie eine Spitze in die Pipette ein, indem Sie den Druckknopf zum zweiten Anschlag drücken, um sicherzustellen, dass die Klemme den Montageschaft des Kolbens in der Spitze vollständig aufnimmt. Als nächstes drücken Sie den Druckknopf an der Pipette zum ersten Stopp und tauchen Sie in das erste Röhrchen mit Zell- oder Plasmid-DNA-Gemisch ein, um die Probe abzusaugen. Setzen Sie die Pipette mit der Probe sehr vorsichtig in den Pipettenhalter ein, um sicherzustellen, dass die Pipette einrastet und richtig platziert ist.
Drücken Sie auf dem Touchscreen auf Start und warten Sie, bis die elektrischen Impulse abgegeben werden. Entfernen Sie langsam die Pipette aus der Station und fügen Sie sofort die transektorierte Zellsuspension in die entsprechende Vertiefung mit dem vorerwärmten antibiotikafreien Medium hinzu, indem Sie langsam den Druckknopf zum ersten Anschlag drücken. Schaukeln Sie die Platte vorsichtig mit transektierten Zellen und inkubieren Sie für ein bis drei Stunden in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator, dann fügen Sie 200 Mikroliter vorgewärmtes Kulturmedium zu jedem Brunnen hinzu.
Stellen Sie die Schale in den Inkubator und warten Sie mindestens 24 Stunden auf Genexpression. Am nächsten Tag untersuchen Sie die Zelllebensfähigkeit und Transfektionseffizienz mit einem Epifluoreszenzmikroskop. Entfernen Sie die Medien vorsichtig mit einer P-1000-Mikropipette aus den Zellen und fügen Sie 500 Mikroliter der Stimuluslösung an der Seite des Brunnens hinzu.
Um unbehandelte Kontrollbrunnen zu betreiben, fügen Sie ein Bildgebungsmedium ohne den Stimulus hinzu. Um die Zellen mit einem Epifluoreszenz- oder Konfokalmikroskop sichtbar zu machen, schalten Sie das Mikroskop und die Fluoreszenzlichtquelle gemäß den Anweisungen ein. Wählen Sie das 10-fache oder 20-fache Ziel aus und stellen Sie die Kulturschale auf die Mikroskopbühne.
Finden Sie Zellen unter dem 568-Nanometer-Filter mit dem Okular. Und konzentrieren Sie sich auf die Zellen, die die roten Blutkörperchen des Reporters exprimieren. Zählen Sie alle roten Zellen im Gesichtsfeld.
Wechseln Sie im selben Gesichtsfeld zu den Filtern 488 oder 512, zählen Sie die Anzahl der roten Zellen, die ebenfalls grün sind. Zählen Sie mindestens 100 rote Zellen mit mindestens drei Feldern. Berechnen Sie den Prozentsatz der Venus-positiven transektierten Zellen pro Gesichtsfeld und durchschnittlich die resultierenden Prozentsätze für jede Behandlung gut, um die Standardabweichung zu erhalten.
Um die Zellen mit einem Epifluoreszenz- oder Konfokalmikroskop abzubilden, visualisieren Sie das Live-Bild der Zellen auf dem Computerbildschirm, wie es von der Kamera aufgenommen wurde. Feinabstimmung des Fokus und der Position der Zellen mithilfe der Joystick-Steuerung und des Fokusrads. Stellen Sie die prozentuale Laserleistung und Belichtungszeit für die 512-Nanometer- oder 488-Nanometer- und 568-Nanometer-Laser so ein, dass das Signal im Bild ohne Sättigung gut aussieht.
Schalten Sie die Live-Aufnahme ein und untersuchen Sie das resultierende Bild, um sicherzustellen, dass für jede Etage in den Display-Histogrammen für beide Kanäle ein eindeutiger Höhepunkt zu sehen ist. Während Sie das Live-Bild der Zellen visualisieren, nehmen Sie mehrere repräsentative Bilder eines Feldes auf, das eine oder mehrere Zellen enthält, die den mCherry- oder dsRedmito-Reporter für jede Vertiefung der Platte exprimieren. Ausgewählte CD-14-positive Monozyten, die sieben Tage lang mit GM-CSF inkubiert wurden, zeigten Veränderungen in der Zellmorphologie im Laufe der Differenzierungsperiode, die von sphärischen Suspensionszellen zu spindeldürren und vollständig gebundenen und schließlich zu mehr verteilten Zellen führten, wenn sie vollständig differenziert waren.
Vollständig differenzierte Zellen wurden mit den Caspase-BiFC-Paaren VC und VN zusammen mit dem Reporterplasmid dsRedmito transektiert, das zur Markierung der transektierten Zellen verwendet wurde. Unbehandelte Zellen zeigten keine Venusfluoreszenz. Und in mit Nigericin behandelten Zellen erschien Caspase-1 BiFC als einzelnes Punctum mit der typischen Form von ASC-Flecken.
Die Quantifizierung von Venus-positivem MDM zeigte, dass der höchste Prozentsatz an Caspase-1 BiFC in der LPS plus Nigericin-Behandlungsgruppe beobachtet wird. Bei der Plasmidtitration von Caspase-1-, 4- und 5-Pro-BiFC-Paaren ergab sich der höchste Prozentsatz an Venus-positiven Zellen aus 400, 500 bzw. 1.000 Nanogramm transektiertem Plasmid. Konfokale Bilder, die mit einem 20-fachen Objektiv eines Zellfeldes 24 Stunden nach der Transsektion aufgenommen wurden, zeigten, dass die unbehandelten transektivierten Zellen lebensfähig sind, da die Mitochondrien intakt sind.
Nach der Behandlung mit Häm erscheint der Caspase-1-Komplex als ein einzelnes grünes Punctum, ähnlich dem durch Nigericin induzierten. Denken Sie daran, raue Bedingungen und übermäßige Manipulation der Zellen während der Differenzierung, Transfektion und Behandlung zu vermeiden, da dies zu einer spontanen Aktivierung und einer hohen Hintergrundaktivierung der Caspase führen kann.
