Die Freisetzung von extrazellulären Fallen durch Neutrophile und andere Immunzellen ist wichtig in der angeborenen Immunität, aber auch stark mit entzündlichen Pathologien verbunden. Über diesen Prozess in Makrophagen ist nur sehr wenig bekannt, obwohl diese Zellen eine entscheidende Rolle bei der Entzündungsreaktion spielen. Dieses Protokoll stellt ein primäres menschliches In-vitro-Modell von Makrophagen extrazellulärer Falle oder Mastfreisetzung bereit.
Es bietet ein Modell für uns, um ein potenzielles physiologisches Wachstum dieser Struktur in vivo zu studieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass die Zellen aus diesem Protokoll primär Zellen sind, die aus menschlichen Buffy-Coat-Präparaten isoliert sind. Es ist kein Grundierungsschritt erforderlich, um die Monozyten in Makrophagen zu differenzieren, was im Gegensatz zu anderen Monozytenzelllinien wie THP-1-Zelllinie steht.
Dieses Protokoll ist leicht an andere Immunzellen angepasst, einschließlich isolierter Neutrophiler und Mikroglia. Extrazelluläre Fallen, die durch Makrophagen erzeugt werden, sind sehr zerbrechlich, daher müssen zwischen den Schritten Die sorgsamen Schritte getroffen werden, um die Integrität der Gebeizten zu erhalten. Bereiten Sie unter sterilen Bedingungen das M1-Grundierungsmedium vor, indem Sie dem gesamten RPMI-1640-Kulturmedium, Interferon-Gamma die Konzentration von 20 Nanogramm pro Milliliter und Lipopolysaccharid in der Konzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter hinzufügen.
Bereiten Sie M2-Grundierungsmedien vor, indem Sie Interleukin 4 zu den kompletten RPMI-1640-Kulturmedien der Konzentration von 20 Nanogramm pro Milliliter hinzufügen. Unter sterilen Bedingungen, Aspirat Medien aus den gesäten und kultivierten GewebeKultur Plattenbrunnen hmDM enthalten. Sorgfältig in jeden Brunnen, einen Milliliter sterilen PBS vorgewärmt auf 37 Grad Celsius hinzufügen.
Entfernen Sie den PBS-Puffer und waschen Sie zwei weitere Male. Fügen Sie entweder einen Milliliter des M1- oder M2-Grundiermediums zu jedem Brunnen hinzu, der das HMDM enthält. Inkubieren Sie die Zellen 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in Gegenwart von 5% Kohlendioxid in einem Zellinkubator.
Bereiten Sie unter sterilen Bedingungen die Kulturmedien mit verschiedenen Stimulatoren der MET-Freisetzung auf das gesamte RPMI-1640-Medium vor. Für Experimente mit hypochloröser Säurestimulation bereiten Sie 200 mikromolare Hypochlorsäure in einem Falcon-Röhrchen mit HBSS vor, das auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde. Nach der Polarisationsbehandlung die Zellmedien aus jedem Brunnen aspirieren und die Zellen dreimal mit einem Milliliter Aliquots entweder steriler PBS für PMA, TNF alpha und Interleukin 8 Stimulation oder HBSS zur hypochlorösen Säurestimulation sorgfältig waschen.
Nachdem Sie die PBS im letzten Waschschritt entfernt haben, fügen Sie einen Milliliter vollständiger Medien hinzu, die PMA, TNF alpha oder Interleukin 8 enthalten. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in einem Zellinkubator für sechs Stunden für TNF Alpha Stimulation und 24 Stunden für PMA oder Interleukin 8 Stimulation. Für Experimente mit Hypochlorsäure, nach dem Entfernen der HBSS in der letzten Waschschritt, fügen Sie einen Milliliter frisch zubereitete Hypochlorsäure.
Dann inkubieren Sie die Zellen für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius in Gegenwart von 5% Kohlendioxid in einem Zell-Inkubator. Danach saugen Sie vorsichtig die Oberwasserstand der Zellen und waschen Sie die Zellen dreimal mit einem Milliliter Aliquots von HBSS. Nachdem Sie den HBSS aus dem letzten Waschschritt entfernt haben, fügen Sie einen Milliliter vollständiger RPMI-1640-Kulturmedien hinzu.
Dann inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius in Gegenwart von 5% Kohlendioxid in einem Zell-Inkubator. Bereiten Sie SYTOX grünen Farbstoff in HBSS mit einer Konzentration von 40 Mikromolaren vor. Direkt 25 Mikroliter des Farbstoffs zu jedem Brunnen hinzufügen, der HMDM enthält.
Inkubieren Sie Zellen bei Raumtemperatur für 5 Minuten im Dunkeln. Dann legen Sie das HMDM in Gewebekulturbrunnen auf die Mikroskopstufe eines invertierten Fluoreszenzmikroskops für die Bildgebung. Schalten Sie eine breitspektrumfreie Fluoreszenzlichtquelle, eine Hellfeld-Lichtquelle und ein invertiertes Mikroskop ein, das mit einer hochauflösenden Farb-Digitalkamera installiert ist.
Drehen Sie das Filterrad auf die Nummer zwei für grüne Fluoreszenz mit Anregung bei 504 Nanometern und Dimension bei 523 Nanometern. Mit dem 5X-Objektiv, fokussieren Sie das Bild mit dem groben Fokus dann die feinen Fokusknöpfe auf dem Mikroskop, bis das Bild scharf, klar und fokussiert erscheint. Schalten Sie das Mikroskop in den Kameramodus.
Starten Sie die zugehörige Software. Klicken Sie auf die Schaltfläche Wiedergabe, um eine Vorschau des Bildes anzuzeigen, und passen Sie den Feinfokusknopf am Mikroskop an, bis das Bild im Software-Vorschaufenster scharf, klar und fokussiert erscheint. Klicken Sie auf die Schaltfläche Erfassen.
Klicken Sie innerhalb der Software auf Datei. Speichern als erforderlicher Bilddateityp. Drehen Sie das Filterrad auf dem Mikroskop auf die Position Nummer fünf für die Lichtfeldabbildung, und wiederholen Sie die Aufnahmevorgänge, um das entsprechende Hellfeldbild zu erhalten.
Hier werden Hellfeldbilder gezeigt, die die morphologischen Veränderungen von HMDM als Reaktion auf Reize zeigen. M1-polarisierte Makrophagen aus Experimenten mit HMDM, die Interferongamma und Lipopolysaccharid ausgesetzt waren, zeigten eine längliche und spindelartige Zellform. Zum Vergleich: Die Morphologie der M2-polarisierten Makrophagen nach Exposition von HMDM mit Interleukin 4 für 48 Stunden war in der Regel rund und flach.
Die Fähigkeit differenzierter HMDM-Phänotypen, METs freizusetzen, wurde durch Live-Zell-Fluoreszenz-Bildgebung mit SYTOX grün visualisiert. Die Kontrolle, die von jedem HMDM-Phänotyp erhalten wurde, der 24 Stunden lang inBrütete, ohne dass es keine entzündungshemmenden Reize gab, zeigte eine sehr begrenzte grüne Färbung. Eine positive Färbung von METs, dargestellt als grüne Streifen, wurde bei Exposition von M1-HMDMs gegenüber Hypochlorsäure, PMA, Interleukin 8 oder TNF alpha erreicht.
Das Vorhandensein einer grünen Färbung, die in den Zellen sichtbar ist, spiegelt den Verlust der Membranintegrität wider, der durch den Zelltod entstehen kann, der unabhängig von extrazellulärer Trapfreisetzung ist. Die Experimente mit M2-HMDMs, die Interleukin 4 ausgesetzt waren, zeigten keine Freisetzung von DNA aus den Zellen, wie das Fehlen der Stränge oder Streifen extrazellulärer DNA zeigt. Jedoch, Es gab einige zelluläre Aufnahme von grünen Fluoreszenzfarbstoff mit der Hypochlorsäure und TNF alpha.
Es ist wichtig, das direkte helle Licht zu vermeiden, das die Färbung vor der Bildgebung überbelichten kann. Extrazelluläre DNA kann durch qPCR-Analyse an nuklearer und mitochondrialer DNA im Zellüberstand quantifiziert werden. Eine weitere Charakterisierung der Maststruktur und ihrer Rolle bei chronischen Entzündungen mit HMDM kann im Vergleich zu anderen verewigten Zelllinienmakrophagen klinisch relevanter sein.
