Diese Arbeit wurde von INSERM, Universität Lille 2 unterstützt, MEDIALZ, LABEX (Exzellenz Labor-Programm zu investieren für die Zukunft) und DISTALZ (Entwicklung innovativer Strategien für eine transdisziplinäre Ansatz zur Alzheimer-Krankheit). FJ.FG ist derzeit ein Empfänger Gemeinschaft von ANR (Französisch National Research Agency / NeuroSplice de Projet Tau ANR-2010-BLAN-1114 01), aber diese Arbeit im Rahmen der Unterstützung von einem Stipendium der JCCM (Spanien) war.

1. Homogenisierung und Gesamtproteinextraktion aus Mensch und Maus Gehirngewebe <ol><li> Hirngewebe Homogenisierung. Homogenisieren des Gehirngewebes 10% (w / v) in 8 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff und 1% w / v SDS-Puffer (UTS) mit einem Potter-Glas (für menschliche Proben) oder Teflon-Homogenisator (für Mäuse Proben). Ultraschallbad bei 60 Hz 30 Impulse mit einer Ultraschallgenerator, indem 0,5 sec für die Gesamt Gewebe Zerfall 13, 14. <ol><li> Bestimmen Proteinkonzentration mit Bradford-Test, mit BSA als Standard. Diese Extraktionspuffer UTS ist völlig kompatibel mit einer Dimension SDS-PAGE solange Lysaten nicht überhitzt zu Carbamylierung 15 zu vermeiden. </li><li> 1% (w / v) und Amberlite inkubieren unter leichtem Mischen während 10 min bei Raumtemperatur. Danach auf 0,22 um Spritzenfilter filtern und schließlich auf die Harnstoff / Thioharnstoff-Lösung fügen Sie den SDS. Dieser Schritt die Menge von Harnsäure und Isocyansäure, die in equilibr sind reduziertium mit Harnstoff in Lösung und deren Abbau erleichtern. </li></ol></li><li> Chloroform / Methanol-Proteinfällung. Man fällt zwischen 100-150 ug Protein für 11 cm IPG-Streifen und 1 bis 1,5 mg für 18 cm Einsen (unabhängig vom pH-Bereich gewählt, um die IEF durchzuführen). <ol><li> Alle Schritte auf Eis oder bei 4 ° C. Kühlen Chloroform und Methanol bei 4 ° C für 30 min vor dem Beginn der Fällungsverfahren. </li><li> Hinzufügen von drei Volumina Methanol und einem Volumen Chloroform zu einem Volumen UTS Lysat. Schütteln Sie die Mischung manuell und fügen Sie drei Volumina kaltem Wasser. Wirbel während 1 min pelle die Proteine ​​durch Zentrifugation bei 12.000 × g für 30 min bei 4 ° C. </li><li> Verwerfen des Überstandes mit einer Pasteurpipette und fügen Sie drei Volumina kaltem MeOH. Wirbel immer Zentrifuge bei 12.000 × g während 30 min bei 4 ° C. Schließlich Stand verwerfen und das Pellet trocknen unter N 2. </li></ol></li><li> Herstellung von Proteinen für die 2D-Analyse.Resuspendieren des Protein-getrocknete Pellet in 2D-Puffer (8 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff mit 4% CHAPS ergänzt). Waschen der Lösung mit Amberlite wie oben angegeben, und versuchen, den Anteil von 500 &amp;mgr; g Protein pro 200 ul Puffer für 2D-2D-DIGE halten. Hinweis: 2D-Puffer bei -80 º C gelagert oder bei 4 ° C während einer Woche gehalten (Harnstoffabbau zu verhindern) werden. <ol><li> Ultraschallbad und speichern die Proben bei -80 ° C bis die Durchführung der folgenden Schritt. Bemerkenswert, kann dieses Protokoll verwendet werden, nachdem Ameisensäure Solubilisierung von Protein-Aggregate 10. Kurz gesagt, verdampfen Ameisensäure unter N 2 und das Pellet wie beschrieben. </li></ol></li></ol> 2. 2D-DIGE <ol><li> Proben testen Qualität. Dose Proben erneut mit Ford-Methode. Verdünnen Sie 15 ug von Proteinen in LDS-Probenpuffer, Wärme bei 37 ° C 15 und laden auf 4-12% Polyacrylamid-Gelen. </li><li> Coomassie-Färbung. Fleck-Polyacrylamid-Gel mit 0,1% (w / v) CoomassieBlue G-250, 50% EtOH und 10% (v / v) Essigsäure-Lösung für mindestens 1 Stunde. Hintergrund ließ über Nacht in 7% Essigsäure und 10% (v / v) Ethanollösung entfärben. </li><li> Pre-elektrophoretische Kennzeichnung der Proben. Vor der Durchführung Cyaninfarbstoff Kennzeichnung, ob der pH-Wert der Probe, die Basis-oder auch neutral sein sollte, da die N-Hydroxysuccinimid-Substitution ist effizienter bei basischem pH-Wert und bei optimaler pH 8,6 sein. <ol><li> Beschriften Sie die minimal zwei Proben Studie mit Cy3 oder Cy5 Fluoreszenzfarbstoffe mit einem Verhältnis von 50 ug protein/400 pmol Farbstoff und halten für 1 h bei 4 ° C in der Dunkelheit, die NHS-Ester reaktiven Gruppe der Cyanine mit der unprotonierten Amin erleichtern Gruppen der Lysine. </li><li> Reduzieren Probe Variationen, einen Quer Markierung mit Cy3 und Cy5 Farbstoffen, die Vermeidung einer Vorzugs Kupplung einer Probe zu einem bestimmten Cyanin. Beachten Sie, dass die Cyanin-Farbstoff minimale Markierung kann für kleine Menge an Proteinen, unter Beibehaltung der Menge von 1 ug pro angepasst werdenotein je 8 pmol Cyanin-Farbstoff. Wenn ja, kann das Mini-2DE-System anstelle des großen 2D-Gel-System verwendet werden. Damit wird die 2D-DIGE Analyse einer kleinen Menge von Hirngewebe. </li><li> Kennzeichnen einen Pool von beiden Proben mit der gleichen Menge von Protein (50 ug insgesamt) mit Cy2 Fluoreszenzfarbstoff und als interner Standard verwendet. Verwenden Sie die gleichen Bedingungen wie zuvor angegeben. </li><li> Vollständiges zu einem Gesamtvolumen 350 ul mit 2D-Puffer, enthaltend 1,1% Destreak Reagenz, 1,2% IPG-Puffer und Spuren von Bromphenolblau die Gesamt 150 ug markierte Proteine ​​(50 ug Cy2, Cy3 50 ug und 50 ug Cy2). Führen Sie diesen Schritt in vierfacher Ausfertigung mit vier unabhängigen Streifen. Außerdem bereiten zwei zusätzliche nicht-markierten Streifen (eine für jede Probe) mit 350-450 &amp;mgr; g Protein für den präparativen Gelen. </li><li> Lassen Sie die sechs geladenen Streifen mit Mineralöl über Nacht für passive Rehydrierung bedeckt. </li></ol></li><li> Isoelektrofokussierung. Führen Sie die IEF bei 206; C Bei einem pH-Wert von 3-11NL, 18 cm Streifen des Protokolls ist: maximale Stromeinstellung ist 50 uA / Band während 8 Etappen: 1) 150 V Schritt 1 h, 2) 200 V Schritt 5 Stunden, 3) 500 V Gradient für 2 Stunden, 4), 1000 V Gradienten für 2 Stunden, 5), 2000 V Gradienten für 2 Stunden, 6) 4.000 V Gradienten für 2 Stunden, 7) 8.000 V Gradienten für 2 Stunden und 8) für insgesamt 24.000 V · h Schritt . Nach IEF, Versand den Überschuss der Mineralöl-Chromatographie mit Papier und die Streifen bei -20 ° C bis in die zweite Dimension. </li><li> IPG-Streifen Ausgleich. Äquilibrieren Streifen in 6 M Harnstoff, 2% SDS, 30% Glycerol, 50 mM Tris-HCl pH 8,6-Puffer mit 1% DTT für 15 min und nach mit 4,7% Jodacetamid in dem gleichen Puffer ohne DTT. </li><li> Zweite Dimension oder SDS-PAGE-Elektrophorese. Stellen die sechs 12% SDS-PAGE-Gelen (1,5 M Tris-HCl pH 8,6, 12% Acrylamid / Bisacrylamid, 0,1% (w / v) SDS, 0,072% (w / v) APS und 0,1% (v / v) TEMED ) in der gleichen Zeit mit einem großen 2D-System mit vier Low-Fluoreszenz-Glasplatten für die strips mit Fluoreszenzproben und zwei weitere Glasplatten mit 1,5 mm Dicke für präparative Gele, um die Protein-Spots herauszuschneiden. <ol><li> Laden die sechs IPG-Streifen auf der Oberseite der Gele und überschichtet mit 0,5% (w / v) Agarose. Laufpuffer aus 25 mM Tris, 192 mM Glycin und 0,1% (w / v) SDS besteht. Führen Sie die Migration bei 2,5 W / Gel über Nacht mit einem Kühlsystem auf 4 ° C 16,17 gesetzt. </li></ol></li><li> Fluoreszenzbilder Erfassung und Analyse. Verwenden Sie einen Typhoon 9400-Scanner, um die Fluoreszenz Gele Bilder (12 Bilder zu einem Experiment) zu erhalten. Scan Cy2, Cy3 und Cy5 Bilder für jedes Gel bei 488/520 nm 532/580 nm und 630/670 nm Anregung / Emissionswellenlängen auf. Verwenden Informatik-Software, um die Bilder zu analysieren. Daten sind repräsentativ für die Veränderungen der Spot Volumen der Verteilung des Signals über die vier Gele zwischen den beiden untersuchten Proben verbunden. </li><li> Coomassie-Färbung für große Gele. Befestigen Sie die präparative Gele in 50% (v / v) EtOH und 3% (V / V) Orthophosphorsäure-Lösung für mindestens 24 Stunden. Dann, nach zweimal waschen mit ultrareinem Wasser für 20 min. Führen Färbung in 34% (v / v) MeOH, 17% (w / v) Ammoniumsulfat und 2% Orthophosphorsäure 1 h vor der Zugabe von 0,1% (w / v) Coomassie-Blue G-250. Halten Sie die Gele in der Färbung für mindestens 48 h und in ultrareinem Wasser entfärbt. <ol><li> Spots für MS-Identifikation. Sobald Fluoreszenzbildern analysiert, stellt die Software eine Liste von Punkten, deren Expression statistisch unterschiedlich. Manuelles auszuschneiden diese Flecken aus den präparativen Gelen. Dieses Verfahren erfordert Übung und etwas Fingerfertigkeit, um Keratin Kontamination zu vermeiden. Proben können dann in Wasser bei -20 ° C bis zum Senden MS gehalten werden. Spot-Identifikation ist vollkommen kompatibel mit Tandem-Massenspektrometrie (MS / MS) und Relevanz der Protein-Identitäten nach der Wahrscheinlichkeit basiert Mowse-Score mit einem p-Wert von 0,05 (p &lt;0,05) 18 berechnet beurteilt. </li> &lt;/ Ol&gt; </li></ol> 3. Qualitative Mini-2DE Assay <ol><li> Resuspendieren maximal 100 ug Proteinprobe in 2D-Puffer bis zu einem Endvolumen von 200 &amp;mgr; l einer 11 cm IPG-Streifen. Im Falle der Überexpression System oder gereinigtes Protein, kann die Ausgangsmenge an 20 ug gesenkt werden. </li><li> Hinzufügen von 1,1% (v / v) Destreak Reagenz, 0,55% (v / v) IPG-Puffer und Spuren von Bromphenolblau bis zu einem Endvolumen von 200 ul. Dann Wirbel, stellen einen schnellen Spin und laden zu einem IPG-Streifen für passive Rehydrierung über Nacht mit Mineralöl bedeckt (um den Streifen in seine ursprüngliche Dicke mitbringen). Anmerkung: Der Anteil der IPG-Puffer ist für alle gleich dem Intervall des gewünschten pH (pH 3-11, 4-7, 7-11, usw.), aber seine Zusammensetzung variiert in Abhängigkeit von dem pH-Bereich gewählt. </li><li> Isoelectrofocalisation. Führen IEF bei 20 ° C Die Programmdauer ist abhängig vom pH-Bereich gewählt. Bemerkenswert, Parameter wie Elektroendosmose kann die IEF-Profil stören und in diesen FällenOptimierung in electrofocalisation Zeit erforderlich ist 19. Hinweis: es ist nicht unbedingt eine längere IEF, die bessere Ergebnisse liefert, aber die Verkürzung der Zeit von IEF kann auch die Auflösung zu verbessern. Nach IEF kann IPG-Streifen bei -20 ° C über Monate gelagert werden. </li><li> IPG-Streifen Ausgleich. Äquilibrieren der Streifen in einem Puffer, der 25 mM Tris-HCl pH 6,8, 20 mM DTT, 10% Glycerin, 5% SDS, 0,05% Bromphenolblau. Machen Sie drei Gleichgewichts badet für 15 min mit der Änderung der Pufferlösung zwischen jedem Bad. </li><li> SDS-PAGE. Die IPG-Streifen Schicht auf ein Fertig Gel (IPG ein gut 11 cm IPG-Streifen) mit einem Anteil von Polyacrylamid in Abhängigkeit von der MW des Proteins von Interesse gewählt. Dann tupfen Sie das Gel auf eine Nitrocellulose / PVDF-Membran bei 100 mV bei 33 min. </li><li> Inkubation über Nacht mit der erforderlichen Antikörper und Visualisierung von Peroxidase-Aktivität. Führen Sie die Ausrichtungen der Immunoblots mit nicht verwandten Polypeptiden, die durch den sekundären Antikörper enthüllt. Erreiche eine halb quantittive Analyse durch Densitometrie des Volumens und der Intensität der Spuren / Spots mit ImageJ Software. </li></ol>

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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+of+alpha-synuclein+in+Lewy+bodies+is+a+pathological+event+not+associated+with+impairment+of+proteasome+function.">Ubiquitination of alpha-synuclein in Lewy bodies is a pathological event not associated with impairment of proteasome function.</a> J Biol Chem. 278, 44405-44411 (2003).</li><li>Sergeant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Truncated+beta-amyloid+peptide+species+in+pre-clinical+Alzheimer's+disease+as+new+targets+for+the+vaccination+approach.">Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer's disease as new targets for the vaccination approach.</a> J Neurochem. 85, 1581-1591 (2003).</li><li>Le Freche, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+phosphorylation+and+sevoflurane+anesthesia:+an+association+to+postoperative+cognitive+impairment.">Tau phosphorylation and sevoflurane anesthesia: an association to postoperative cognitive impairment.</a> Anesthesiology. 116, 779-787 (2012).</li><li>Leboucher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detrimental+effects+of+diet-induced+obesity+on+tau+pathology+are+independent+of+insulin+resistance+in+tau+transgenic+mice.">Detrimental effects of diet-induced obesity on tau pathology are independent of insulin resistance in tau transgenic mice.</a> Diabetes. 62, 1681-1688 (2013).</li><li>Deramecourt, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical,+neuropathological,+and+biochemical+characterization+of+the+novel+tau+mutation+P332S.">Clinical, neuropathological, and biochemical characterization of the novel tau mutation P332S.</a> J Alzheimers Dis. 31, 741-749 (2012).</li><li>Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmortem+interval+effect+on+RNA+and+gene+expression+in+human+brain+tissue.">Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue.</a> Cell Tissue Bank. 12, 311-318 (2011).</li><li>Bell, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+a+twenty-first+century+brain+bank:+experience+in+the+BrainNet+Europe+consortium.">Management of a twenty-first century brain bank: experience in the BrainNet Europe consortium.</a> Acta Neuropathol. 115, 497-507 (2008).</li><li>Crecelius, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+quantitative+post-mortem+changes+in+the+gray+matter+of+the+human+frontal+cortex+proteome+by+2-D+DIGE.">Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE.</a> Proteomics. 8, 1276-1291 (2008).</li><li>Swatton, J. E., Prabakaran, S., Karp, N. A., Lilley, K. S., Bahn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+profiling+of+human+postmortem+brain+using+2-dimensional+fluorescence+difference+gel+electrophoresis+(2-D+DIGE).">Protein profiling of human postmortem brain using 2-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2-D DIGE).</a> Mol Psychiatry. 9, 128-143 (2004).</li><li>Viswanathan, S., Unlu, M., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+difference+gel+electrophoresis.">Two-dimensional difference gel electrophoresis.</a> Nat Protoc. 1, 1351-1358 (2006).</li><li>Tannu, N. S., Hemby, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+fluorescence+difference+gel+electrophoresis+for+comparative+proteomics+profiling.">Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis for comparative proteomics profiling.</a> Nat Protoc. 1, 1732-1742 (2006).</li></ol>

Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären.

Entdecken pathologischen Expression von Proteinen, die Suche nach Biomarkern und die Modulation der möglichen Pfade für pharmakologische Targets gehören zu den Zielen der Neuroproteomics 30 nähert. Unter den Schwellenwerkzeuge, ergänzt das Feld 2DE eine vielversprechende Erwartungs. Dennoch sollte ein Konsens, um die Variabilität zu minimieren und die Reproduzierbarkeit der Experimente erreicht werden. Entsprechend dieser Idee ein standardisiertes Protokoll, um 2D-DIGE (Abbildung 2) und...

Psychische und neurologische Störungen repräsentieren 13% der globalen Krankheitslast, müssen neue Herausforderungen wie die pathophysiologischen Mechanismen, Risikofaktoren und Biomarker erforscht prodromal 1 werden. Im Einklang mit diesem Ziel, Proteomik-Studien des menschlichen Gehirns unverzichtbar geworden, um molekulare Signalwege in Prozesse wie Gedächtnis, Verhalten, Emotionen und neuronale Plastizität zum Beispiel, nicht nur für die physiologische, sondern auch für pathologische Zustände beteiligt aufzudecken. Daher ist die Verwendung von Tiermodellen und insbesondere die transgenen Mäuse, bringt eine Vielzahl von Möglichkeiten, um die Entstehung von menschlichen neurodegenerativen Erkrankungen 2 nachzuahmen. Proteomics Ansätze sind, um diese neue Perspektiven im Bereich der Neurowissenschaften zu erreichen heutzutage. Zweidimensionale Gelelektrophorese (2DE) ist ein potenter und wahrscheinlich einfache Methode, um das Proteom von einer Vielzahl von Proben vergleichen können. Darüber hinaus ist es auch eineleistungsfähige Methode, um ein Protein aus einem komplexen Gemisch, um zu identifizieren und zu isolieren, weiter zu analysieren, durch Massenspektrometrie. Diese Technik besteht im wesentlichen in zwei aufeinanderfolgenden Stufen: 1) Proteintrennung nach ihrem isoelektrischen Punkt (pI) von Isoelektrofokussierung (IEF). Genauer gesagt, wird ein elektrisches Potential über die Immobilin Acrylamid Streifen unter einem pH-Gradienten aufgetragen und dann Proteine ​​wandern und sich auf einen bestimmten pI in Abhängigkeit von ihrer globalen Nettoladung. 2) isoelektrisch fokussiert Proteine ​​denaturiert und negativ durch die Zugabe von Natriumdodecylsulfat (SDS geladen), wodurch Proteine ​​in ihrer ersten Struktur werden je nach ihrem scheinbaren Molekulargewicht (MW) von SDS-PAGE 3 getrennt. Diese zwei unterschiedlichen Eigenschaften ermöglichen es uns, einen double-Wert, weiter in der Studie des Proteoms gehen zu bewältigen. Auf der einen Seite dieser Ansatz bietet die Möglichkeit, eine quantitative Analyse mit minimalen Farbstoffe 2D-DIGE-Verfahren durchzuführen, und auf der anderen Seite ein qualitaive Analyse von Mini-2DE zu Western-Blot gekoppelt. Quantitative Analyse von 2D-DIGE verleiht Protein-Expression ändert sich über die Probe Proteom. Kurz gesagt werden Proben mit drei Cyanine (Cy2, Cy3 und Cy5) Emission bei drei verschiedenen Wellenlängen (blau, grün und rot) markiert. Diese Fluor minimal Farbstoffe N-Hydroxy Succinimidylester-Gruppe enthaltenden reagieren mit der ε-Aminogruppe der Lysinreste von Proteinen, was zu kovalenter Amid-Bindungen 4. Lysinreste werden nur zwischen 1-3% und damit verhindert, dass mehrere Etiketten zusätzlich pro Protein und die wichtigsten Änderungen der Nettoladung 5, 6 gekennzeichnet. Cy3 und Cy5 werden oft verwendet, um zwei unabhängige Stichproben zu kennzeichnen, während Cy2 Tags eine Mischung aus gleichen Teilen der Proben zu vergleichen. Die beiden wichtigsten Vorteile sind, dass alle markierten Proben werden gemischt und IEF und SDS-PAGE sind in ein Gel auf einmal für jeden Schritt durchgeführt, die Vermeidung der inter Variabilität unter Experimente durch Vergleich geliert. Darüber hinaus stellt es eine hohe Detektionsschwelle von rund 1 Femtomol von Protein 7. Gele werden gescannt und 2D-Software vergleicht die 2D-Gel-Fluoreszenzbilder, wo Cy2 dient als interner Standard, die eine Identifizierung der statistischen Unterschiede zwischen den Stellen für ihren hinteren Identifizierung durch Massenspektrometrie. Das 2D-Analyse-Software mit dem internen Standard erreicht eine schnelle Erkennung von weniger als 10% der Unterschiede zwischen den Proben mit mehr als 95% der statistischen Vertrauens 8. Qualitative Analyse von Mini-2DE ist ein entscheidender Schritt für die Proteincharakterisierung. Das Prinzip ist das gleiche, wie zuvor für PI-und MW-Trennung beschrieben, aber in diesem Fall Proteine ​​werden von einer kleinen Polyacrylamid-Gel auf eine Membran übertragen und Immunoblot wird danach durchgeführt. Während einer Dimension Gelelektrophorese stellt Veränderungen in der Proteinexpression für ein oder mehrere Protein-Epitope in Funktion des Antikörpers, der INFORMATIOn von Mini-2DE verleiht mit zwei zusätzlichen Parametern. Erstens ändern die Protein isovariants in Abhängigkeit von der pI, die anzeigt, dass post-translationale Modifikationen stattfinden könnten. Zweitens kann die Massenspektrometrie Identifizierung bezeichnend für plausibel Zymogene und Abbauprodukte von Proteinen sein. Daher sind durch 2D-DIGE beobachtet Modifikationen wahrscheinlich ein Indikator für die zugrunde liegenden Mechanismen Veränderungen in der globalen Proteom-Profil. Alignments von Immunoblots unter mehreren Proben für das gleiche Protein-Epitop / s Mini-2DE kann Säure Veränderungen beleuchten in post-translationale Variationen etwas beobachtet oder gar nicht von eindimensionalen Immunoblotting 9, 10 reflektieren. Darüber hinaus informiert diese Analyse über die möglichen Spaltstellen aufgrund der Kenntnis des pI und MW der Stoffwechselrückstände 11,12. Die Kombination dieser beiden Techniken eine komplementäre Proteomik-Analyse. Auf der einen Seite 2D-DIGE bietet einen typ.e von Unterschieden ermöglicht eine präzise Trennung von Polypeptiden, deren Expression ist anders. Diese Unterschiede bestehen im wesentlichen in das Auftreten oder Verschwinden eines Flecks oder Zunahme / Abnahme der Intensität einer durch eine Software-Analyse der Fluoreszenz Gele. Jedoch sind diese Beobachtungen selbst kaum die Natur der beobachteten Änderung erklären. Aus diesen Gründen einmal das Polypeptid isoliert und durch Massenspektrometrie identifiziert, die Verwendung von Mini-2DE ermöglicht, genau zu bestätigen 1) die Identität des Proteins isoliert und 2) die Art der Unterschied: Änderung in der isovariant / Isoform Niveau Expression, posttranslationale Modifikationen und Spaltprozesse zum Beispiel. Jedoch ist es notwendig, einen Ausgangs Lysepuffer sowohl 2D-DIGE und mit Mini-2DE kompatibel sein, um die möglichen Dispersionen durch die Verwendung von Extraktionsprotokollen, die sehr unähnlich zu begrenzen entwickeln. In dem vorliegenden Artikel werden wir debeschrieben eine angepasste Protokoll für die Vorbereitung, Extraktion und die Leistung der 2D-DIGE und Mini-2DE Techniken zur Gehirnproteine ​​aus humanen und Maus-Gewebe.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="709">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5nmol 1 * 5 Nmo</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">25-8010-65</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Immobiline DryStrip</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Reference in function of the pH interval/size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">IPG Buffer, pH X-X</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Reference in function of the pH interval desired</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1&#160;</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">551797N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td>17-1335-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KIT BOX IPG 1 * 1 KIT</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">28-9334-92</td>
			<td>Plastic box to make the passive rehydration&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">MILLEX GS Filter</td>
			<td style="width:113px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLGS033SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Criterion XT Precast Gels 13.3 x 8.7 cm (W x L)</td>
			<td style="width:113px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Reference in function of the MW to separate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">IPGphor III Isoelectric Focusing Unit</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">11-0033-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Ettan DALTsix Large Electrophoresis System</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">80-6485-08&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Gel Company</td>
			<td style="width:119px;">P2D1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

consensus brain-derived protein, extraction protocol for the study of human and murine brain proteome using both 2d-dige and mini 2de immunoblotting

Zweidimensionale Gelelektrophorese (2DE) ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Proteom Änderungen möglicherweise zu verschiedenen physiologischen oder pathologischen Bedingungen im Zusammenhang aufzudecken. Grundsätzlich ist dieses Verfahren auf die Trennung von Proteinen entsprechend ihrem isoelektrischen Punkt in einem ersten Schritt, und zum anderen nach ihrem Molekulargewicht durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) auf. In diesem Bericht ein optimiertes Protokoll für die Probenvorbereitung kleine Menge von menschlichen post-mortem Hirngewebe und Maus beschrieben. Dieses Verfahren ermöglicht es, sowohl die Fluoreszenzdifferenz-Gelelektrophorese zweidimensionalen (2D-DIGE) und Mini-2DE-Immunoblotting durchzuführen. Die Kombination dieser Ansätze ermöglicht es, nicht nur neue Proteine ​​und / oder Proteinmodifikationen finden in ihrem Ausdruck durch seine Kompatibilität mit Massenspektrometrie-Erkennung, sondern auch einen neuen Einblick in die Marker-Validierung. So, Mini-2DE zu Western-Blot-Genehmigungen verbunden zu identifizieren und zu validieren Post-Translationale Modifikationen, Proteine ​​Katabolismus und bietet einen qualitativen Vergleich zwischen den verschiedenen Bedingungen und / oder Behandlungen. Hier stellen wir eine Methode, um Komponenten von Proteinaggregaten in AD und Lewy-Körper-Demenz, wie der Amyloid-beta-Peptid und dem Alpha-Synuclein gefunden studieren. Unser Verfahren kann somit für die Analyse des Proteoms angepasst und unlösliche Proteine ​​extrahiert aus menschlichem Hirngewebe und Mäuse-Modellen zu. Parallel dazu kann es nützliche Informationen für die Untersuchung von molekularen und zellulären Signalwege bei neurodegenerativen Erkrankungen sowie potenzielle neue Biomarker und therapeutische Targets beteiligt sind.

Proteomics auf Hirngewebe bleibt eine Herausforderung, da keine ideale Puffer vorhanden, um 100% von Proteinen, insbesondere Membran-assoziierten Proteine ​​oder Zellskelett erholen. Der erste Satz von Experimenten wurde die Suche nach einem geeigneten Lyse-Puffer mit beiden Ansätze und der mit einem großen Panel von Protein erholen können kompatible konzentriert. Somit wurden drei Lysepuffer untersucht, um die am besten geeignete zu bestimmen. Erstens ist die gemeinsame biochemische und molekularbiologische Puff...

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Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting

Eine gemeinsame Proteinextraktionsprotokoll unter Verwendung von Harnstoff / Thioharnstoff / SDS Puffer für Mensch und Maus Hirngewebe ermöglicht indentification von Proteinen mittels 2D-DIGE und ihre anschließende Charakterisierung von Mini 2DE Immunoblotting. Diese Methode ermöglicht es, mehr reproduzierbare und zuverlässige Ergebnisse aus menschlichen Biopsien und experimentellen Modellen zu erhalten.

Konsens Brain-derived Protein, Extraktionsprotokoll für das Studium der Human-und Maus-Gehirn-Proteome Mit Sowohl 2D-DIGE-und Mini-2DE Immunoblotting

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or ...

consensus-brain-derived-protein-extraction-protocol-for-study-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.9K Aufrufe.  Inserm UMR 837.  Eine gemeinsame Proteinextraktionsprotokoll unter Verwendung von Harnstoff / Thioharnstoff / SDS Puffer für Mensch und Maus Hirngewebe ermöglicht indentification von Proteinen mittels 2D-DIGE und ihre anschließende Charakterisierung von Mini 2DE Immunoblotting. Diese Methode ermöglicht es, mehr reproduzierbare und zuverlässige Ergebnisse aus menschlichen Biopsien und experimentellen Modellen zu erhalten. 

Serie: Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS display abnormalities in the expression of FMR1 - a protein required for typical, healthy neural development.3 Recent data has suggested that the loss of this protein can cause the cortex to be hyperexcitable thereby affecting overall patterns of neural plasticity.4,5
In addition, Fragile X shows a strong comorbidity with autism: in fact, 30% of children with FXS are diagnosed with autism, and 2 - 5% of autistic children suffer from FXS.6
Transcranial Magnetic Stimulation (a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses 7,8) represents a unique method of exploring plasticity and the manifestations of FXS within affected individuals. More specifically, Theta-Burst Stimulation (TBS), a specific stimulatory protocol shown to modulate cortical plasticity for a duration up to 30 minutes after stimulation cessation in healthy populations, has already proven an efficacious tool in the exploration of abnormal plasticity.9,10 
Recent studies have shown the effects of TBS last considerably longer in individuals on the autistic spectrum - up to 90 minutes.11 This extended effect-duration suggests an underlying abnormality in the brain's natural plasticity state in autistic individuals - similar to the hyperexcitability induced by Fragile X Syndrome.
In this experiment, utilizing single-pulse motor-evoked potentials (MEPs) as our benchmark, we will explore the effects of both intermittent and continuous TBS on cortical plasticity in individuals suffering from FXS and individuals on the Autistic Spectrum.

In this article, we examine the effects of Theta-Burst TMS stimulation on cortical plasticity in individuals suffering from Fragile X syndrome and individuals on the autistic spectrum.

TMS: Mit dem Theta-Burst-Protokoll zu Mechasnism der Plastizität in Individuen sich mit Fragile X-Syndrom und Autismus

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Forschung

Neurowissenschaften

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

Methoden zur Untersuchung der neuronalen Morphogenese:<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; RNAi Elektroporation in embryonale Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

Sequential Photo-Bleiche zur Einzel-Schwann-Zellen an der neuromuskulären Synapse Delineate

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Genetische Manipulation von Kleinhirnkörnerzellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt;, Um neuronale Morphologie und Migration Studieren

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

New Methods to Study Gustatory Coding

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons (GRNs) detect tastant molecules, they encode information about the identity and concentration of the tastant as patterns of electrical activity that then propagate to follower neurons in the brain. These patterns constitute internal representations of the tastant, which then allow the animal to select actions and form memories. The use of relatively simple animal models has been a powerful tool to study basic principles in sensory coding. Here, we propose three new methods to study gustatory coding using the moth Manduca sexta. First, we present a dissection procedure for exposing the maxillary nerves and the subesophageal zone (SEZ), allowing recording of the activity of GRNs from their axons. Second, we describe the use of extracellular electrodes to record the activity of multiple GRNs by placing tetrode wires directly into the maxillary nerve. Third, we present a new system for delivering and monitoring, with high temporal precision, pulses of different tastants. These methods allow the characterization of neuronal responses in vivo directly from GRNs before, during and after tastants are delivered. We provide examples of voltage traces recorded from multiple GRNs, and present an example of how a spike sorting technique can be applied to the data to identify the responses of individual neurons. Finally, to validate our recording approach, we compare extracellular recordings obtained from GRNs with tetrodes to intracellular recordings obtained with sharp glass electrodes.

We present three new methods to study gustatory coding. Using a simple animal, the moth Manduca sexta (Manduca), we describe a dissection protocol, the use of extracellular tetrodes to record the activity of multiple gustatory receptor neurons, and a system for delivering and monitoring precisely timed pulses of tastants.

Neue Methoden zum Studieren der Gustatory Coding

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other neurological diseases at an increasing speed. However, little is known about the molecular mechanisms that underlie these disorders. The genetic, molecular, and behavioral toolbox of Drosophila melanogaster makes this model organism particularly useful to characterize new disease genes and mechanisms in a high-throughput manner. Nevertheless, high-throughput screens require efficient and reliable assays that, ideally, are cost-effective and allow for the automatized quantification of traits relevant to these disorders. The island assay is a cost-effective and easily set-up method to evaluate Drosophila locomotor behavior. In this assay, flies are thrown onto a platform from a fixed height. This induces an innate motor response that enables the flies to escape from the platform within seconds. At present, quantitative analyses of filmed island assays are done manually, which is a laborious undertaking, particularly when performing large screens.
This manuscript describes the &#34;Drosophila Island Assay&#34; and &#34;Island Assay Analysis&#34; algorithms for&#160;high-throughput, automated data processing and quantification of island assay data. In the setup, a simple webcam connected to a laptop collects an image series of the platform while the assay is performed. The &#34;Drosophila Island Assay&#34; algorithm developed for the open-source software Fiji processes these image series and quantifies, for each experimental condition, the number of flies on the platform over time. The &#34;Island Assay Analysis&#34; script, compatible with the free software R, was developed to automatically process the obtained data and to calculate whether treatments/genotypes are statistically different. This greatly improves the efficiency of the island assay and makes it a powerful readout for basic locomotion and flight behavior. It can thus be applied to large screens investigating fly locomotor ability, Drosophila models of movement disorders, and drug efficacy.

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

The island assay is a relatively new, cost-effective assay that can be used to evaluate the basic locomotor behavior of Drosophila melanogaster. This manuscript describes algorithms for automatic data processing and objective quantification of island assay data, making this assay a sensitive, high-throughput readout for large genetic or pharmacological screens.

Hochdurchsatz-Analyse des Bewegungsapparates Verhaltens in der Drosophila -Insel-Assay

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Isolation und RNA-Extraktion von Neuronen, Makrophagen und Mikroglia aus Larven Zebrafisch Gehirne

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Extraction and Dissection of the Domesticated Pig Brain

Use of the pig as a preclinical and translatable animal model has been well-documented and accepted by research fields investigating cardiovascular systems, gastrointestinal systems, and nutrition, and the pig is increasingly being used as a large animal model in neuroscience. Furthermore, the pig is an accepted model to study neurodevelopment as it displays brain growth and development patterns similar to what occurs in humans. As a less common animal model in neuroscience, surgical and dissection procedures on pigs may not be as familiar or well-practiced among researchers. Therefore, a standardized visual protocol detailing consistent extraction and dissection methods may prove valuable for researchers working with the pig. The following video showcases a technique to remove the pig brain while keeping the cortex and brainstem intact and reviews methods to dissect several commonly investigated brain regions including the brainstem, cerebellum, midbrain, hippocampus, striatum, thalamus, and medial prefrontal cortex. The purpose of this video is to provide researchers with the tools and knowledge necessary to consistently perform a brain extraction and dissection on the four-week-old pig.

This protocol details the technique for removal of the pig brain in its entirety and dissection of several brain regions commonly studied in neuroscience.

Extraktion und Zerlegung des domestizierenden Schweinehirns

Use of the pig as a preclinical and translatable animal model has been well-documented and accepted by research fields investigating cardiovascular ...

Laser Microdissection-Based Protocol for the LC-MS/MS Analysis of the Proteomic Profile of Neuromelanin Granules

Neuromelanin is a black-brownish pigment, present in so-called neuromelanin granules (NMGs) in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta. Besides neuromelanin, NMGs contain a variety of proteins, lipids, and metals. Although NMGs-containing dopaminergic neurons are preferentially lost in neurodegenerative diseases like Parkinson&#39;s disease and dementia with Lewy bodies, only little is known about the mechanism of NMG formation and the role of NMGs in health and disease. Thus, further research on the molecular characterization of NMGs is essential. Unfortunately, standard protocols for the isolation of proteins are based on density gradient ultracentrifugation and therefore require high amounts of human tissue. Thus, an automated laser microdissection (LMD)-based protocol is established here which allows the collection of NMGs and surrounding substantia nigra (SN) tissue using minimal amounts of tissue in an unbiased, automatized way. Excised samples are subsequently analyzed by mass spectrometry to decipher their proteomic composition. With this workflow, 2,079 proteins were identified of which 514 proteins were exclusively identified in NMGs and 181 in SN. The present results have been compared with a previous study using a similar LMD-based approach reaching an overlap of 87.6% for both proteomes, verifying the applicability of the revised and optimized protocol presented here. To validate current findings, proteins of interest were analyzed by targeted mass spectrometry, e.g., parallel reaction monitoring (PRM)-experiments.

A robust protocol is presented here for isolating neuromelanin granules from human post-mortem substantia nigra pars compacta tissue via laser microdissection. This revised and optimized protocol massively minimizes the required time for sample collection, reduces the required sample amount, and enhances the identification and quantification of proteins by LC-MS/MS analysis.

Laser-Mikrodissektions-basiertes Protokoll für die LC-MS/MS-Analyse des proteomischen Profils von Neuromelanin-Granulaten

Neuromelanin is a black-brownish pigment, present in so-called neuromelanin granules (NMGs) in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta. ...

Revolutionierung der fNIRS-Studien: Ein neuartiger Ansatz zur neuronalen Kopplung

New Framework for Understanding Cross-Brain Coherence in Functional Near-Infrared Spectroscopy (fNIRS) Hyperscanning Studies

Despite the growing body of functional near-infrared spectroscopy (fNIRS) hyperscanning studies, the assessment of coupling between two neural signals using wavelet transform coherence (WTC) seems to ignore the directionality of the interaction. The field is currently lacking a framework that allows researchers to determine whether a high coherence value obtained using a WTC function reflects in-phase synchronization (i.e., neural activation is seen in both members of the dyad at the same time), lagged synchronization (i.e., neural activation is seen in one member of the dyad prior to the other member), or anti-phase synchronization (i.e., neural activation is increased in one member of the dyad and decreased in the other). To address this need, a complementary and more sensitive approach for analyzing the phase coherence of two neural signals is proposed in this work. The toolbox allows investigators to estimate the coupling directionality by classifying the phase angle values obtained using traditional WTC into in-phase synchronization, lagged synchronization, and anti-phase synchronization. The toolbox also allows researchers to assess how the dynamics of interactions develop and change throughout the task. Using this novel WTC approach and the toolbox will advance our understanding of complex social interactions through their uses in fNIRS hyperscanning studies.

Autor im Rampenlicht: Neue Erkenntnisse in fNIRS-Studien erschließen - Ein neuartiges Framework für die Synchronieanalyse zwischen den Gehirnen 

Wavelet transform coherence (WTC) is a common methodology for assessing the coupling between signals that is used in functional near-infrared spectroscopy (fNIRS) hyperscanning studies. A toolbox for assessing the directionality of the signal interaction is presented in this work.

Neuer Rahmen für das Verständnis der hirnübergreifenden Kohärenz in funktionellen Hyperscanning-Studien der Nahinfrarotspektroskopie (fNIRS)

Despite the growing body of functional near-infrared spectroscopy (fNIRS) hyperscanning studies, the assessment of coupling between two neural signals ...