Wir bedanken uns für die Bereitstellung FortéBio Grafiken in Abbildung 1 verwendet. Diese Arbeit wurde vom NIH GM083088 TMD unterstützt

<html> 1. Programmierung des Instruments für BLI-Test Schalten Sie das Gerät mindestens eine Stunde im Voraus, um die Lampe zum Aufwärmen, das ist notwendig, um das Rauschen zu minimieren und Drift in der optischen Signal während des Experiments. Stellen Sie die gewünschte Temperatur über die Registerkarte Instrument, um die Probe Plattenhalter vorwärmen. Dann das experimentelle Design in der Datenerfassung-Software. Wählen Sie &quot;Neu Kinetics Experiment&quot; in der Registerkarte Assistent Experiment. Dies stellt eine Tabbed-Menü mit allen Schritten, die definiert werden müssen. 1.1. Teller Definition Definieren Sie die Spalten, die auf der 96-Loch-Probenplatte verwendet werden. Weisen Spalten-Puffer, immobilisiert Protein oder Bindungspartner enthalten. Für jeden Verein gut, geben die Konzentration der Bindungspartner verwendet werden. Hinweis: die Platte Definition in Fig. 2 gezeigt hat Optionen für verschiedene Tests. 1.2. Assay Definition NHALT &quot;&gt; Definieren Sie alle Schritte für den Test benötigt. Dazu gehören (i) Baseline (mehrere), (ii) Laden, (iii) Vereinigung und (iv) Die Dissoziation der Bindungspartner. dann, wie unten beschrieben, link einzelnen Testschritte mit Spalten von Vertiefungen auf der Probenplatte durch Auswählen der Testschritt und dann einen Doppelklick auf den jeweiligen Spalten. Diese Programme die Sensoren von einer Spalte von Vertiefungen zur nächsten während des Tests bewegt. <ol><li> Grundlinie Beginnen mit einer kurzen Basislinien Schritt (≥ 60 sec), mit Sensoren in Assay-Puffer (Figur 2, Spalte 1), um Ausgangssignale BLI in der 96-Well-Platte herzustellen. </li><li> Laden (Immobilisierung des biotinylierten Proteins auf die Sensoren) Zuweisen Sensoren Vertiefungen, welche das biotinylierte Protein (Fig. 2, Spalte 2) enthält. Verwenden Sie die Schwellenwertfunktion, um eine vorgegebene Grad der Bindung (siehe Einleitung) zu erreichen. Stellen Sie die Option Schwelle, so dass alle Sensoren Bewegung seind zur nächsten Spalte von Vertiefungen, wenn einer der Sensoren den Schwellenwert erreicht. </li><li> Grundlinie Fügen Sie einen weiteren Schritt in der Baseline-Puffer (Abbildung 2, Spalte 3, in der Regel&gt; 5 min), um die von den Sensoren weg waschen nicht immobilisierten biotinylierten Proteinen und neue, stabile Basislinie Signale. Für grundlegende Bindung / Dissoziation Assays nur (wie in Abbildung 3), extra eine Basisstufe (60 sec) mit Sensoren in neue Brunnen Puffer (Abbildung 2, Spalte 4) vor der Vereinigung Schritt. </li><li> Verband (des Bindungspartners an das immobilisierte Protein) Für eine Grund Bindung / Dissoziation Assay (wie in Abbildung 3), wählen Sie einen Bereich von Konzentrationen der Bindungspartner für verschiedene Sensoren / Brunnen verwendet werden (Abbildung 2, Spalte 5). Einstellen der Schrittzeit, so dass zumindest ein Sättigungskonzentration des Bindungspartners sollte Gleichgewicht nähern Bindungssignal. Für eineAssay, um allosterische Effekte von kleinen Liganden auf die Dissoziation des Protein-Protein-Komplex (siehe Abbildung 5) zu testen, wählen Sie eine einzelne hohe Konzentration der Bindungspartner (~ 10-fache über dem geschätzten K D) für den Einsatz in allen Verband Brunnen. </li><li> Dissoziation (der Bindungspartner) Einen Grundbindungs ​​/ Dissoziation Assay nur (wie in Fig. 3) bezeichnen die Sensoren bis Spalte 4 (Fig. 2), den gleichen Puffer als Brunnen für die zusätzliche Grundlinie vor der Vereinigung verwendet zurückzukehren. Für ein Test, um allosterische Effekte kleiner Liganden zu testen, statt bezeichnen Sensoren bis Spalte 6 (Abbildung 2), wobei jeder gut kann Puffer plus verschiedene allosterische Liganden enthalten zu bewegen. </li></ol> 1.3. Sensor Zuordnung Geben Sie die Stellen in der Sensorschale, die Feuchtsalzstreuung Sensoren für den Test enthält. Identifizieren Sie alle leeren Stellen, da das Experiment fail, wenn keine Sensoren werden bei Ihnen abgeholt. 1.4. Bewertung Experiment Visualisieren Sie alle geplanten Schritte, um auf Fehler zu überprüfen und gehen Sie zurück, um sie zu korrigieren. 1.5. Führen Experiment Geben Sie notwendigen Informationen, einschließlich Standort der Datendateien. Geben Sie die gewünschte Temperatur für das Experiment. Wenn die Sensoren noch Vorbenetzung benötigen, wählen Sie die Option, verzögern Start des Experiments. Schließlich ist, wenn alle Probenvorbereitung abgeschlossen (Schritt 2) und sowohl die Probenplatte und Sensorfach im Gerät geladen ist, klicken Sie auf die Go-Taste, um den Test auszuführen. 2. Probenvorbereitung <ol><li> Eine geeignete Testpuffer. Puffer für Experimente in den Fig. 3 und 5 gezeigt: 20 mM MOPS (3 - (N-Morpholino) propansulfonsäure), Tris (Tris (hydroxymethyl) aminomethan) (um den pH auf 8,0 einzustellen), 50 mM KCl. Fügen BSA (Rinderserumalbumin, Fettsäure-frei, 0.5mg / ml Endkonzentration) in dem Puffer für alle Testschritte und für alle Verdünnungen der biotinylierten Proteins oder Bindungspartner, nicht-spezifische Bindung von Proteinen an die Sensoren zu minimieren. </li><li> Verdünnen Sie die biotinylierte Protein (ε) in Assay-Puffer auf eine geeignete Konzentration (siehe Einleitung). </li><li> Verdünnungen des Bindungspartners (F 1 (-ε)) in Assay-Puffer (siehe Beiträge zu Konzentrationsbereich zu verwenden). </li><li> Vorbefeuchtet die Streptavidin-beschichteten Sensoren für mindestens 10 min auf ihre Schutz Saccharose Beschichtung zu entfernen. Entfernen Sie den Sensor-haltigen Zahnstange von der Sensorleiste und legen Sie eine 96-Well-Platte in den Boden der Schale, Schiebe einer Ecke der Platte in der Orientierungs Kerbe auf dem Tablett. Für die Spalte von Sensoren verwendet werden, mit 200 &amp;mgr; l Assay-Puffer pro well in dieser Spalte der 96-Well-Platte. Bringen Sie das Rack von Sensoren, die das Fach in der richtigen Ausrichtung (mit Tabs in Slots). </li><li> Wie bei der Programmierung in Schritt 1 zugeordnet, füllen Brunnen of die Probenplatte mit Testpuffer oder der entsprechenden Proteinverdünnungen, wie in 2. Einführen von Luftblasen zu vermeiden, da sie Rauschen in dem optischen Signal führen. Eine oder mehrere Referenzvertiefungen, die entweder (i) biotinylierte Protein oder (ii) Bindungspartner verzichtet werden. </li><li> Öffnen Sie die Tür des Gerätes und stecken Sie den Sensor Tablett auf die Bühne (links), mit Reitern des Fachs in die Schlitze der Bühne eingesetzt. Legen Sie die Probenplatte in den Plattenhalter (rechts), stellen Sie sicher, dass die Platte flach und in der richtigen Orientierung sitzt, wie auf dem Plattenhalter angezeigt. Schließen Sie die Tür und starten den Test von der Datenerfassungsprogramm (Schritt 1.5). </li></ol> 3. Datenverarbeitung <ol><li> Nachdem der Test ausgeführt wurde, öffnen Sie die Datenanalyse-Software, und laden Sie den Ordner mit den Daten. Klicken Sie auf die Registerkarte &quot;Bearbeiten&quot;, um eine schrittweise Verarbeitung Menü (links) und die rohen kinetischen Daten zu sehen, mit jedem Sensor (AH) eine andere Farbe zugeordnet (sieheAbbildung 3). </li><li> Unter &quot;Datenauswahl&quot;, klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Sensorauswahl&quot;. Auf der &quot;Sample-Kennzeichen-Karte&quot;, bezeichnen die Vertiefungen für 1 oder 2 Steuersensoren (G, H in Test von Abbildung 3) als Referenzquellen. Auf der Verarbeitung Menü, überprüfen Sie die &quot;Subtraktion&quot; und wählen Sie &quot;Referenz Wells&quot;, um Referenzsignal (Einzel-oder gemittelt) von jedem anderen Sensor das Signal zu subtrahieren. </li><li> Richten Sie alle Spuren zu Y = 0 mit dem &quot;Y-Achse ausrichten&quot; Schritt. Wählen Sie &quot;Baseline&quot; als Ausrichtungsschritt (dies ist die letzte Grundlinie vor der Vereinigung Schritt). Für &quot;Zeitbereich&quot; geben Sie die letzten 10 Sekunden von dieser Grundlinie (dh 50-60 Sekunden für eine 60-Sekunden-Basislinie, wie in Abbildung 3). </li><li> Überprüfen Sie die &quot;Inter-Schritt-Korrektur&quot;-Box, um die Signalverschiebungen zwischen Assoziation und Dissoziation Schritte zu minimieren. Wählen ausrichten, um Baseline oder Dissoziation. </li><li> Wählen Savitzky-Golay-Filter-Funktion in den meisten Fällen und klicken Sie auf &quot;Process Data!&quot; , um fortzufahren. Sichtprüfungdie letzten verarbeiteten Daten (unten rechts). Mit Tests zur globalen Datenanalyse (wie in Abbildung 4) bestimmt, ob das Signal Spuren zeigen eine deutliche Verschiebung zwischen Assoziation und Dissoziation Schritte, ändern Sie die Auswahl der Dissoziation oder Baseline für die &quot;Inter-Schritt-Correction&quot; und neu verarbeiten die Daten, bevor Sie mit Daten Analyse. </li></ol> 4. Datenanalyse Klicken Sie auf die Registerkarte &quot;Analyse&quot; in der Datenanalyse zu beginnen. Hinweis: Das Beispiel unten sind die Schritte für die globale Analyse von mehreren Bindungs ​​/ Dissoziations-Kurven (wie in 3). <ol><li> Für &quot;Step auf Analyze&quot;, wählen Sie Assoziation und Dissoziation. Für &quot;Model&quot;, wählen 01.01. Hinweis: andere begrenzte Optionen sind verfügbar. </li><li> Für &quot;Fitting&quot;, wählen Sie Global (Full). Für &quot;Group By&quot; wählen Farbe (wie auf der Grafik). Wählen Sie &quot;R max UNLINKED Durch Sensor&quot; für unabhängige Montage von R max ermöglichen (maximale Signalantwort auf Sättigung der Bindung des Partner an das immobilisierte Protein). Hinweis: Wir tun dies für die meisten Tests als Sensoren unterscheiden sich leicht in der Menge an Protein immobilisiert (siehe Abbildung 3, Loading). </li><li> Auf der gezeigten Tabelle sicher, dass alle Sensor Spuren analysiert werden dieselbe Farbe haben, so werden sie als globaler Satz analysiert werden. Wählen Sie bei Bedarf ein oder mehrere Sensor Spuren von den globalen Pass weglassen: Unter dem &quot;Include&quot;-Spalte mit der rechten Maustaste auf die gewünschte Sensorposition und wählen Sie &quot;Ausschließen Wells&quot;. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Fit Kurven!&quot; , um die nicht-lineare Regressionsanalyse starten. Untersuchen Sie die passenden Ergebnisse, die (i) Überlagerung von Regressionskurven mit Sensordatenspuren (wie in Abbildung 4), (ii) Grundpass Residuen und (iii) eine Tabelle mit bestimmten Parameterwerte (Geschwindigkeitskonstanten, R max umfassen, K D) und Statistiken (Standardfehler für die Parameter, Chi-Quadrat, R 2). </li><li> Unter &quot;Daten-Export&quot;, speichern Anpassungsergebnisse, indem Sie auf &quot;Export Tabelle zu. Csv-Datei&quot;. Für grapHing oder weitere Analyse der Daten / Kurven ausgestattet mit anderer Software, klicken Sie auf &quot;Export Fitting Ergebnisse&quot;, um die Daten der einzelnen Sensor und angepassten Kurve in einer Textdatei speichern. </li></ol>

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+plasmid+expression+vector+for+the+production+of+biotinylated+proteins+by+site-specific,+enzymatic+modification+in+Escherichia+coli.">A versatile plasmid expression vector for the production of biotinylated proteins by site-specific, enzymatic modification in Escherichia coli.</a> Gene. 169, 59-64 (1996).</li><li>Dayne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioLayer+Interferometry+(BLI)+-+How+Does+it+Work?.">BioLayer Interferometry (BLI) - How Does it Work?.</a> Fort&#233;Bio newsletter In Interactions. 5, 8-9 (2012).</li><li>Wartchow, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensor-based+small+molecule+fragment+screening+with+biolayer+interferometry.">Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry.</a> J. Comput. Aided Mol. Des. 25, 669-676 (2011).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal. Biochem. 377, 209-217 (2008).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Die derzeit verfügbaren Instrumente zur BLI ermöglichen signifikante Durchsatz und Flexibilität in Tests zur biomolekularen Wechselwirkungen. Verschiedene Lösungsproben werden in die Vertiefungen einer schwarzen Mikrotiterplatte abgegeben wird, und einen Satz von parallelen BLI Sensoren programmiert werden, um zwischen den Spalten der Vertiefungen auf der Platte hin und her zu bewegen. Die Proben werden durch Orbitalschütteln während des Tests gerührt. Das hier verwendete System 8 Sensoren und verwendet eine 96-w...

Protein-Protein-Wechselwirkungen sind wichtig für viele biologische Prozesse und markierungsfreie optische Methoden wie Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) wurden in vitro verwendet worden, um die Kinetik der Bindung und Dissoziation 1 studieren. Die meisten markierungsfreien Methoden ein Biomolekül Immobilisierung auf einer Sensoroberfläche und verwenden Sie ein optisches Signal an einen Bindungspartner aus der Lösung zu erkennen, wie es mit dem immobilisierten Biomolekül 1 zuordnet. Während SPR ist ein hochempfindliches Verfahren, ist es anfällig für Störungen aufgrund von Änderungen des Brechungsindex der Lösung über dem Sensor 2 fließt. Obwohl nicht so empfindlich wie SPR, Bio-Schicht-Interferometrie (BLI) weniger von Änderungen in der Probenzusammensetzung 1,3 betroffen. BLI verwendet LWL-Biosensoren, die eine proprietäre biokompatible Beschichtung an der Spitze zu haben. Das hier verwendete (Octet-RED96)-System enthält acht Spektralphotometer. Weißes Licht wird an einer Reihe von Sonden, die an einem Roboterarm bewegen geleitet. Faseroptische Sensoren are, aufgenommen durch die Sonden und in eine Platte mit 96 Vertiefungen enthaltenden Proben. Eines der Zielmoleküle auf der Biosensoroberfläche immobilisiert. Dann Sensoren werden in die Vertiefungen, die die Bindungspartner in der Lösung bewegt wird. BLI überwacht Verband der Bindungspartner immobilisiert mit dem Molekül und überwacht Dissoziation nach dem Umzug die Sensoren an-Lösung ohne den Bindungspartner dann. Bindung von Molekülen an die Biosensor-Oberfläche führt zu Änderungen der optischen Interferenz zwischen Lichtwellen, die von einer Innenfläche und von der externen Schnittstelle zwischen Sensor und zurück in die Lösung Spektralphotometer reflektieren. Diese Veränderungen in der Interferenz quantifiziert und zur kinetischen Raten der Bindung und Dissoziation, wie in der Animation der Figur 1 zusammengefaßt bestimmen. Wir haben BLI angelegt, um Wechselwirkungen zwischen dem katalytischen Komplex von bakteriellen ATP-Synthase und seine ε-Untereinheit, die das automatische hemmen das Enzym zu messen. ATP synthase ist eine membranständige Drehnanomotor, der Synthese und Hydrolyse von ATP katalysiert 4. Der katalytische Komplex (F 1) in einer löslichen Form, die als ATPase arbeitet isoliert werden. Ε-Untereinheit besitzt zwei Domänen: die N-terminale Domäne (NTD) ist die korrekte Montage und funktionelle Kopplung des Enzyms notwendige, aber nicht direkt interagieren mit den katalytischen Untereinheiten, der C-terminalen Domäne (CTD) kann das Enzym durch die Interaktion mit inhibieren mehrere katalytischen Untereinheiten 5,6. Diese ε-vermittelte Regulierung ist spezifisch für bakterielle ATP-Synthase und wird nicht in der mitochondrialen Homolog beobachtet. ATP-Synthase hat als Ziel für antibakterielle Medikamente entstanden, wie die jüngsten FDA-Zulassung von bedaquiline zu arzneimittelresistenten Tuberkulose zu behandeln 7 gezeigt. So Targeting ε die hemmende Rolle für die Wirkstoffforschung konnte die antibakterielle die mitochondriale ATP-Synthase nicht hemmen ergeben. Mit dem isolierten katalytischen Komplex (F 1), εwird zu einem dissoziierbares Untereinheit. Doch mit ε F 1 gebunden ist, der kann einen dramatischen εCTD Konformationsänderung unterziehen, teilweise in zentralen Hohlraum des Enzyms Einfügen und Bildung eines hemmenden Zustand, die wahrscheinlich nicht direkt 6,8 distanzieren ist. Wir verwenden BLI Kinetik der F 1 / ε-Bindung und Dissoziation zu messen, und indirekt an allosterische Effekte von katalytischen-Ort-Liganden auf die ε-Konformation zu untersuchen. In unserem System wurde ε für die Immobilisierung auf der Sensoroberfläche, da BLI-Signal (wie SPR) ausgewählt ist empfindlich gegenüber der Masse der Bindungsmoleküle an der Oberfläche. Die ε-Untereinheit ist klein (~ 15 kDa) gegenüber dem Haupt F 1-Komplex (~ 347 kDa). Somit wird eine größere BLI Signal aus der Bindung an immobilisiertes F 1 ε führen. Um F 1 Dissoziation, die sehr langsam sein kann überwachen, müssen ε stark immobilisiert werden. So entschieden wir uns für biotinylierenUnd Immobilisierung auf Streptavidin-beschichteten Biosensoren. Proteine ​​können durch (i) zufällige Modifikation der Oberfläche Lysine 9, (ii) Umsetzung einer einzigartigen nativen oder gentechnisch Cystein mit einem Biotin-Maleimid-Reagenz 10 oder (iii) Zugabe einer genetisch bestimmten Biotin-Akzeptor-Peptid, das enzymatisch biotinyliert wird während biotinyliert in vivo-Expression des markierten Proteins 11. In unserem System wird ε (iii) 8 unter Verwendung von Verfahren biotinyliert. Sobald Biotin-markierten ε auf Streptavidin immobilisiert Sensoren können BLI die Bindung und Dissoziation von F 1, die von ε-Untereinheit (F 1 (-ε)) abgereicherte messen. Für die hier beschriebenen Experimente war vorläufigen Tests durchgeführt, um angemessene Mengen des biotinylierten Proteins zu bestimmen, um auf die Sensoren zu immobilisieren. Dies kann variieren, abhängig von dem Molekulargewicht des Proteins und seinem Bindungspartner, aber das Ziel ist, eine minimale Menge an immobilisiertem Protein t bestimmenHat bietet (i) akzeptable Signal-zu-Rauschen für Bindungskinetik mit einer niedrigen Konzentration des Bindungspartners (nachfolgend K D) und (ii) minimale Verzerrung Bindungskinetik mit nahezu Sättigungskonzentration des Bindungspartners. Auch kann Stöchiometrie Biotinylierungsgrad variieren (aber vermeiden&gt; 1 Mol Biotin / Mol Protein), so dass einige erste Test kann für jede neue Charge von biotinyliertem Protein benötigt werden, um zu bestätigen, dass eine konsistente BLI-Signal kann während der Immobilisierung auf Streptavidin-beschichteten erreicht werden Sensoren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="610">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Octet-RED96</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">30-5048</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A6003-10G</td>
			<td>Fatty Acid free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biosensor/Streptavidin</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">18-5019</td>
			<td>Tray of 96 sensors</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Microtiter plate</td>
			<td style="width:108px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">655209</td>
			<td>Black, Polypropylene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Data Acquisition software</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">Version 6.4</td>
			<td>Newer versions available</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Data Analysis software</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">Version 6.4</td>
			<td>Newer versions available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects

Wir beschreiben die Verwendung von Bio-Schicht Interferometrie inhibitorische Wechselwirkungen der ε-Untereinheit mit dem katalytischen Komplex von Escherichia coli ATP-Synthase zu studieren. Bakterielle F-ATP-Synthase ist das Ziel eines neuen, von der FDA zugelassene Antibiotikum zur Bekämpfung der medikamentenresistenten Tuberkulose. Verständnis bakterienspezifischen Auto Hemmung der ATP-Synthase durch die C-terminale Domäne von ε-Untereinheit kann ein neues Mittel, um das Enzym für die Entdeckung der antibakterielle Medikamente an. Die C-terminale Domäne von ε erfährt eine dramatische Konformationsänderung, wenn das Enzym die Übergänge zwischen den aktiven und inaktiven Zuständen und katalytischen Ort Liganden beeinflussen, welche von Konformationen ε vorherrschende ist. Die Assay-Maßnahmen Kinetik der ε die Bindung / Dissoziation mit der katalytischen Komplex und indirekt mealeistet die Verschiebung des enzymgebundenen ε zu und von der scheinbar nondissociable inhibitorische Konformation. Die Bio-Schicht Interferometrie Signal nicht überempfindlich auf Lösungszusammensetzung, so kann es auch verwendet werden, um allosterische Effekte von katalytischen Ort Liganden auf Konformationsänderungen ε überwachen werden.

Echtzeit-Bindung und Dissoziation BLI Kinetik sind in Abbildung 3 dargestellt. Dieses Experiment wurde mit Testpuffer in Assoziation und Dissoziation getan. Dieses Experiment wurde mit einer 10 min Basis Schritt gestartet, da die Sensoren erst kurz vorbefeuchtet worden. Als nächstes wurde biotinyliertes ε auf den Sensoren geladen. Keine nachweisbare Dissoziation von ε aufgetreten ganzen restlichen Schritte von der Referenzkurve (G), die keine Bindungspartner aufgenommen hatte gesehen. Eine zweite Ref...

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Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects

Die Protokolle beschreiben kinetische Untersuchungen von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit Bio-Schicht-Interferometrie. F-ATP-Synthase, die in der zellulären Energiestoffwechsel beteiligt ist, kann durch die ε-Untereinheit in Bakterien gehemmt werden. Wir haben Bio-Schicht Interferometrie geeignet ist, Wechselwirkungen des katalytischen Komplexes mit inhibitorischer C-terminalen Domäne ε zu studieren.

Bio-Schicht-Interferometrie zur Messung der Kinetik der Protein-Protein-Interaktionen und allosterische Ligandeneffekte

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia ...

bio-layer-interferometry-for-measuring-kinetics-protein-protein

Research

JoVE Journal

Chemistry

28.7K Aufrufe.  SUNY Upstate Medical University.  Die Protokolle beschreiben kinetische Untersuchungen von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit Bio-Schicht-Interferometrie. F-ATP-Synthase, die in der zellulären Energiestoffwechsel beteiligt ist, kann durch die ε-Untereinheit in Bakterien gehemmt werden. Wir haben Bio-Schicht Interferometrie geeignet ist, Wechselwirkungen des katalytischen Komplexes mit inhibitorischer C-terminalen Domäne ε zu studieren. 

Serie: Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects

A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal fermentation processes and screening for new oil-rich strains requires a fast and reliable protocol for determination of intracellular lipid content. Current practices rely largely on gravimetric methods to determine oil content, techniques developed decades ago that are time consuming and require large sample volumes. In this paper, Nile Red, a fluorescent dye that has been used to identify the presence of lipid bodies in numerous types of organisms, is incorporated into a simple, fast, and reliable protocol for measuring the neutral lipid content of Auxenochlorella protothecoides, a green alga. The method uses ethanol, a relatively mild solvent, to permeabilize the cell membrane before staining and a 96 well micro-plate to increase sample capacity during fluorescence intensity measurements. It has been designed with the specific application of monitoring bioprocess performance. Previously dried samples or live samples from a growing culture can be used in the assay.

A simple protocol to determine the neutral lipid content of algal cells using a Nile Red staining procedure is described. This time-saving technique offers an alternative to traditional gravimetric-based lipid quantification protocols. It has been designed for the specific application of monitoring bioprocess performance.

Eine einfache und schnelle Protokoll zur Messung neutralen Lipiden in Algenzellen mit Fluoreszenz

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

Forschung

Chemie

Quantitative and Qualitative Examination of Particle-particle Interactions Using Colloidal Probe Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate using the Atomic Force Microscope (AFM), can provide key insights into physical interactions present within colloidal systems. Colloidal systems are widely existent in several applications including, pharmaceuticals, foods, paints, paper, soil and minerals, detergents, printing and much more.1-3 Furthermore, colloids can exist in many states such as emulsions, foams and suspensions. Using colloidal probe nanoscopy one can obtain key information on the adhesive properties, binding energies and even gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of the colloids present within. Additionally, colloidal probe nanoscopy can be used with biological cells to aid in drug discovery and formulation development. In this paper we describe a method for conducting colloidal probe nanoscopy, discuss key factors that are important to consider during the measurement, and show that both quantitative and qualitative data that can be obtained from such measurements.

Colloidal probe nanoscopy can be used within a variety of fields to gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of colloidal systems and aid in drug discovery and formulation sciences using biological systems. The method described within provides a quantitative and qualitative means to study such systems.

Quantitative und qualitative Untersuchung der Partikel-Partikel Wechselwirkungen mit Kolloidales Probe Nanoskopie

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate ...

An ELISA Based Binding and Competition Method to Rapidly Determine Ligand-receptor Interactions

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and reliable point-by-point protocols of enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for the investigation of ligand-receptor interactions: the direct ligand-receptor interaction assay (LRA) and the competition LRA. As a case study, the ELISA based analysis of the interaction between different lambda interferons (IFNLs) and the alpha subunit of their receptor (IL28RA) is presented: the direct LRA is used for the determination of dissociation constants (KD values) between receptor and IFN ligands, and the competition LRA for the determination of the inhibitory capacity of an oligopeptide, which was designed to compete with the IFNLs at their receptor binding site. Analytical steps to estimate KD and half maximal inhibitory concentration (IC50) values are described. Finally, the discussion highlights advantages and disadvantages of the presented method and how the results enable a better molecular understanding of ligand-receptor interactions.

The presented protocols describe two enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based techniques for the rapid investigation of ligand-receptor interactions: The first assay allows the determination of dissociation constant between ligand and receptor. The second assay enables a rapid screening of blocking peptides for ligand-receptor interactions.

Ein ELISA-basierte Bindung und Wettbewerbsverfahren zu schnell zu bestimmen, Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and ...

Synthesis of Ligand-free CdS Nanoparticles within a Sulfur Copolymer Matrix

Aliphatic ligands are typically used during the synthesis of nanoparticles to help mediate their growth in addition to operating as high-temperature solvents. These coordinating ligands help solubilize and stabilize the nanoparticles while in solution, and can influence the resulting size and reactivity of the nanoparticles during their formation. Despite the ubiquity of using ligands during synthesis, the presence of aliphatic ligands on the nanoparticle surface can result in a number of problems during the end use of the nanoparticles, necessitating further ligand stripping or ligand exchange procedures. We have developed a way to synthesize cadmium sulfide (CdS) nanoparticles using a unique sulfur copolymer. This sulfur copolymer is primarily composed of elemental sulfur, which is a cheap and abundant material. The sulfur copolymer has the advantages of operating both as a high temperature solvent and as a sulfur source, which can react with a cadmium precursor during nanoparticle synthesis, resulting in the generation of ligand free CdS. During the reaction, only some of the copolymer is consumed to produce CdS, while the rest remains in the polymeric state, thereby producing a nanocomposite material. Once the reaction is finished, the copolymer stabilizes the nanoparticles within a solid polymeric matrix. The copolymer can then be removed before the nanoparticles are used, which produces nanoparticles that do not have organic coordinating ligands. This nascent synthesis technique presents a method to produce metal-sulfide nanoparticles for a wide variety of applications where the presence of organic ligands is not desired.

Herein we present a method to synthesize ligand-free cadmium sulfide (CdS) nanoparticles based on a unique sulfur copolymer. The sulfur copolymer operates as a high temperature solvent and a sulfur source during the nanoparticle synthesis and stabilizes the nanoparticles after the reaction.

Synthese von Ligand freien CdS-Nanopartikel innerhalb eines Schwefel-Copolymer-Matrix

Aliphatic ligands are typically used during the synthesis of nanoparticles to help mediate their growth in addition to operating as high-temperature ...

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. Fundamental to these transitions is the intrinsic flexibility of the protein, which is critically modulated by membrane lipid-composition. To better understand the structural basis of channel function, it is necessary to study protein dynamics in a physiological membrane environment. Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy is an important tool to characterize conformational transitions between functional states. In comparison to NMR and X-ray crystallography, the information obtained from EPR is intrinsically of lower resolution. However, unlike in other techniques, in EPR there is no upper-limit to the molecular weight of the protein, the sample requirements are significantly lower, and more importantly the protein is not constrained by the crystal lattice forces. Therefore, EPR is uniquely suited for studying large protein complexes and proteins in reconstituted systems. In this article, we will discuss general protocols for site-directed spin labeling and membrane reconstitution using a prokaryotic proton-gated pentameric Ligand-Gated Ion Channel (pLGIC) from Gloeobacter violaceus (GLIC) as an example. A combination of steady-state Continuous Wave (CW) and Pulsed (Double Electron Electron Resonance-DEER) EPR approaches will be described that will enable a complete quantitative characterization of channel dynamics.

This article describes methods for site-directed spin labeling and reconstitution of pentameric ligand-gated channels for Electron Paramagnetic Resonance studies. This protocol can be adapted for any membrane protein. The reconstitution method described here can also be used for patch-clamp measurements of macroscopic and single-channel currents in a defined lipid system.

Site-Directed Spin Labeling und EPR-spektroskopischen Untersuchungen von pentamerem liganden-gesteuerten Ionenkanäle

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

Sulfate Separation by Selective Crystallization with a Bis-iminoguanidinium Ligand

A simple and effective method for selective sulfate separation from aqueous solutions by crystallization with a bis-guanidinium ligand, 1,4-benzene-bis(iminoguanidinium) (BBIG), is demonstrated. The ligand is synthesized as the chloride salt (BBIG-Cl) by in situ imine condensation of terephthalaldehyde with aminoguanidinium chloride in water, followed by crystallization as the sulfate salt (BBIG-SO4). Alternatively, BBIG-Cl is synthesized ex situ in larger scale from ethanol. The sulfate separation ability of the BBIG ligand is demonstrated by selective and quantitative crystallization of sulfate from seawater. The ligand can be recycled by neutralization of BBIG-SO4 with aqueous NaOH and crystallization of the neutral bis-iminoguanidine, which can be converted back into BBIG-Cl with aqueous HCl and reused in another separation cycle. Finally, 35S-labeled sulfate and &#946; liquid scintillation counting are employed for monitoring the sulfate concentration in solution. Overall, this protocol will instruct the user in the necessary skills to synthesize a ligand, employ it in the selective crystallization of sulfate from aqueous solutions, and quantify the separation efficiency.

A protocol for in situ aqueous synthesis of a bis(iminoguanidinium) ligand and its utilization in selective separation of sulfate is presented.

Sulfate Trennung durch selektive Kristallisation mit einer Bis-iminoguanidinium Ligand

A simple and effective method for selective sulfate separation from aqueous solutions by crystallization with a bis-guanidinium ligand, ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals leads to the formation of composite materials with unique properties. In addition, the undesirable process of biofouling is initiated by the adsorption of biomolecules, mainly proteins, on surfaces. This organic layer is an adhesion layer for bacteria and allows them to interact with the surface. Understanding the fundamental forces that govern the interactions at the organic-inorganic interface is therefore important for many areas of research and could lead to the design of new materials for optical, mechanical and biomedical applications. This paper demonstrates a single-molecule force spectroscopy technique that utilizes an AFM to measure the adhesion force between either peptides or amino acids and well-defined inorganic surfaces. This technique involves a protocol for attaching the biomolecule to the AFM tip through a covalent flexible linker and single-molecule force spectroscopy measurements by atomic force microscope. In addition, an analysis of these measurements is included.

Here we present a protocol to measure the force of interactions between a well-defined inorganic surface and either peptides or amino acids by single-molecule force spectroscopy measurements using an atomic force microscope (AFM). The information obtained from the measurement is important to better understand the peptide-inorganic material interphase.

Einblicke in die Wechselwirkungen von Aminosäuren und Peptide mit anorganischen Materialien Verwendung von Einzelmolekülkraftspektroskopie

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Accessing Valuable Ligand Supports for Transition Metals: A Modified, Intermediate Scale Preparation of 1,2,3,4,5-Pentamethylcyclopentadiene

A reliable, intermediate scale preparation of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene (Cp*H) is presented, based on modifications of existing protocols that derive from initial 2-bromo-2-butene lithiation followed by acid mediated dienol cyclization. The revised synthesis and purification of the ligand avoids the use of mechanical stirring while still permitting access to significant quantities (39 g) of Cp*H in good yield (58%). The procedure offers other additional benefits, including a more controlled quench of excess lithium during the production of the intermediate heptadienols and a simplified isolation of Cp*H of sufficient purity for metallation with transition metals. The ligand was subsequently used to synthesize [Cp*MCl2]2 complexes of both iridium and ruthenium to demonstrate the utility of the Cp*H prepared and purified by our method. The procedure outlined herein affords substantial quantities of a ubiquitous ancillary ligand support used in organometallic chemistry while minimizing the need for specialized laboratory equipment, thus providing a simpler and more accessible entry point into the chemistry of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene.

Reliable, intermediate scale preparation of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene (Cp*H) is presented. The revised protocol for the synthesis and purification of the ligand minimizes the need for specialized laboratory equipment while simplifying reaction workups and product purification. Use of Cp*H in the synthesis of [Cp*MCl2]2 complexes (M = Ru, Ir) is also described.

Wertvolle Ligand Zugriff auf Untersätze für Übergangsmetalle: Eine modifizierte, Intermediate Maßstab Herstellung von 1,2,3,4,5-Pentamethylcyclopentadien

A reliable, intermediate scale preparation of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene (Cp*H) is presented, based on modifications of existing protocols that ...

Ligand-Mediated Nucleation and Growth of Palladium Metal Nanoparticles

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution of capping ligands during the synthesis reaction, their role in regulating the nucleation and growth rates of colloidal nanoparticles is not well understood. In this work, we demonstrate a mechanistic investigation of the role of trioctylphosphine (TOP) in Pd nanoparticles in different solvents (toluene and pyridine) using in situ SAXS and ligand-based kinetic modeling. Our results under different synthetic conditions reveal the overlap of nucleation and growth of Pd nanoparticles during the reaction, which contradicts the LaMer-type nucleation and growth model. The model accounts for the kinetics of Pd-TOP binding for both, the precursor and the particle surface, which is essential to capture the size evolution as well as the concentration of particles in situ. In addition, we illustrate the predictive power of our ligand-based model through designing the synthetic conditions to obtain nanoparticles with desired sizes. The proposed methodology can be applied to other synthesis systems and therefore serves as an effective strategy for predictive synthesis of colloidal nanoparticles.

The main goal of this work is to elucidate the role of capping agents in regulating the size of palladium nanoparticles by combining in situ small angle x-ray scattering (SAXS) and ligand-based kinetic modeling.

Liganden-vermittelten Keimbildung und das Wachstum von Palladium Metall-Nanopartikeln

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.