Die Autoren möchten die finanzielle Unterstützung für diese Arbeit von der US Army Military ERDC Technik 6.1 Grund Research Program und dem Zentrum für ERDC Directed Research-Programm bereitgestellt bestätigen. Die Autoren möchten auch für die Unterstützung der experimentellen Arbeit danken dem Personal und die Einrichtungen des ERDC Geotechnische und Struktur Laboratory Beton-und Zweig Materialien. Veröffentlichungserlaubnis wurde von der Direktorin, Geotechnik &amp; Structures Laboratory gewährt.

1. Fish Scale Probenvorbereitung Für diese Studie wurden Skalen von der US Army Engineer Forschungs-und Entwicklungszentrum (ERDC) Umweltlabor auf halber Länge (29. Schwanz Spalte) von einem etwa 600 mm lang gar (A. Spachtel) erhalten. Die Fischschuppen wurden nach dem ERDC und National Institute of Health (NIH) der Tierpflege-Richtlinien erhalten. <ol><li> Materialien Notieren Sie sich die räumliche Lage an der Fische der für die Studie gewonnen Skalen. Achten Sie darauf, auf die entsprechende Organisation oder staatliche Richtlinien zur Gewinnung von biologischen Proben, wie z. B. die Tierpflege NIH-Richtlinien einzuhalten. Speichern die Waage in einem adäquaten Medium, wie zB Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, um die Hydrierung zu bewahren und Mineralgehalt, wenn sie aus dem Fisch entfernt werden. Vermeiden Sie längeren Lagerung, die in Mineralverlust führen kann, die die Nanoindentierung Daten beeinflussen können. Verwenden Sie eine mittlere Borstenbürste und tweezers jede Weichgewebe von den harten Schuppen zu entfernen. </li><li> Specimen Montage und Sectioning Prüfung einen Querschnitt der kurzen Achse des Fischschuppen (Fig. 1) unter Verwendung von FTIR und Nanoindentierung erfordert die Montage der ersten Skala in einem starren Medium, wie einem Zweikomponenten-Epoxidharz, bestehend aus einem Harz und Härter. Verwenden Allzweck RT Härtung Epoxide mit niedrigen Spitzentemperaturen, wie das Handelszweck-Epoxidharz in dieser Studie, die eine Spitzentemperatur von weniger als 55 ° C verwendet hatten </li></ol><img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51535/51535fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51535/51535fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Röntgen-CT-Bilder der A. Spachtel Skala, das den in dieser Studie untersucht von A. Kurzachsenquerschnitt Spatel mit Nanoindentierung und FTIR [A (anterior), P (posterior), D (dorsalen), V (ventralen)]. &lt;/ P&gt; <ol start="2"><li><ol><li> Halten Sie die Fischschuppen in einem 32 mm Durchmesser Proben Form unter Verwendung eines handelsüblichen Kunststoff-Probenhalter. Dies hält die Probe korrekt ausgerichtet, während die Montage im Epoxid. </li><li> Sobald die Probe in der Form gehalten, gießen Sie die nicht ausgehärteten Epoxy auf die Probe und lassen Sie das Epoxid gemäß den Anweisungen des Herstellers, um zu heilen. </li><li> Nachdem das Epoxidharz ausgehärtet ist, der Abschnitt montiert Probe unter Verwendung einer Diamantklinge mit hoher Präzision Trennsäge an der Mittellinie der Probe. </li><li> Ultraschallbad in destilliertem Wasser für 15 min bis alle Fremdkörper aus der Probe zu entfernen. </li></ol></li><li> Polieren für Nanoindentation-und FTIR- Um eine glatte, ebene Oberfläche für Nanoindentierung erhalten, wie in Abbildung 2 dargestellt, sind die folgenden Polierverfahren und Parameter auf Basis von Gesprächen mit der Polier Herstellung und Testproben vorgeschlagen. Allerdings müssen die Parameter für die verschiedenen Biomaterialien auf der Basis Reaktionen eingestellt werdenwie Abtragsraten. Beschallen von Proben in einem Bad aus destilliertem Wasser zwischen Polierschritte ist wichtig, um Teilchen aus einem gröberen Polierschritt sicherzustellen, werden nicht in einem nachfolgenden feineren Polierschritt eingeführt. </li></ol><img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51535/51535fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51535/51535fig2.jpg" /> Abbildung 2. Bild einer polierten Kurzachsenquerschnitt A. Spachtel Skala in Epoxidharz montiert. <ol start="4"><li><ol><li> Grobpolitur mit einer 15 um SiC-Pad und Wasser als Schmiermittel, bis die Probe ist eben mit der automatischen Polierkopf Kraft von 7 lbf und Geschwindigkeit von 200 Umdrehungen pro Minute (rpm). </li><li> Beschallen der Probe in ein Bad aus destilliertem Wasser 15 min. </li><li> Zwischenlack mit einen 6 um SiC-Pad mit Wasser Schmiermittel bei einer Plattengeschwindigkeit von 130 Umdrehungen pro Minute und eine Kraft von 7 lbf für5 min. </li><li> Beschallen Probe in ein Bad aus destilliertem Wasser 15 min. </li><li> Polnisch mit einem 1 um SiC-Pad mit Wasser Schmiermittel bei einer Plattengeschwindigkeit von 130 Umdrehungen pro Minute und einer Kraft von 7 lbf für 5 min. </li><li> Beschallen der Probe in ein Bad aus destilliertem Wasser 15 min. </li><li> Feinschliff mit einer 50 nm kolloidalen Kieselsäuresuspension mit einem geeigneten Polierkissen wie etwa ein hochdichtes, nicht-gewebten, Tiefschlaf porösem Polyurethan, die ein Hersteller schlägt vor, für die 50 nm-Suspensionen. Politur mit einer Geschwindigkeit von 130 UpM mit einer Kraft von 7 lbf für 5 min. </li><li> Beschallen der Probe in ein Bad aus destilliertem Wasser 15 min. </li></ol></li></ol> 2. Nanoindentation Testing <ol><li> Kalibrieren Sie den Nanoindentierung System vor jeder Partie der Prüfung nach den Richtlinien produziert. Die Kalibrierung sollte das Bestimmen Bereich die Funktion des Systems für die Berkovich Spitze und Rahmensteifigkeit. Zusätzlich führen eine Mikroskop-to-Inden Kalibrierung bei diesem Schrittum zu gewährleisten, die Gedankenstriche korrelieren mit den gewählten Mikroskop Standorten. </li><li> Legen Sie die Probe in die Nanoindenters und die Verwendung der optischen Mikroskop Steuerelemente auf der Nanoindenters, um die Probe zu fokussieren. </li><li> Verwenden Sie die Software steuert, um die Probe zu dem Ort für den ersten Gedankenstrich zu bewegen. Im Idealfall ist dies ungefähr 10 &amp;mgr; m im Epoxyharz vom Rand des ganoine Schicht entlang der Mittellinie des Querschnitts der Waage. </li><li> Führen Sie vier parallele Reihen von Gedankenstrichen im Abstand von 15 um voneinander zu erhalten, beginnend an diesem Standort eine statistisch signifikante Daten eingestellt. Stellen Sie die Nanoindentor zu einer maximalen Belastung von 5 mN, Be-und Entladen Raten von 0,1 mN / sec, einer Haltezeit von 30 Sekunden und eine Mindestgedankenstrich Abstand von 5 um für jede Zeile. Die Reihe von Gedankenstrichen sollte Setup orthogonal zur ganoine Oberfläche zu laufen, und sollte eine ausreichende Anzahl von Gedankenstrichs, über Querschnitt der Waage zu reisen, während sie über etwa 10 um in das Epoxidy Vergangenheit knöchernen Schicht. </li><li> Wenn die Charge beendet ist, haben die Nanoindentor erstellen Bezugsgedankenstrich mit einer maximalen Last von 100 mN bei der ersten und letzten Gedankenstrich, der in der Epoxy vor dem ganoine Schicht und nach der Knochenschicht bzw. sein sollte. Diese korrelieren mit den Start-und Endpunkt für jede Zeile der Gedankenstrich. </li><li> Nach Nanoindentierung, legen Sie die Probe wieder in der PBS-Lösung zur weiteren Austrocknung zu vermeiden. </li><li> Verwenden Sie die Nanoindentierung Software, um den Modul und die Härte auf der Basis der Oliver-Pharr Methode 13 bestimmen, ob ein zeitunabhängiges Material Reaktion beobachtet wird. Andernfalls wird die Haltezeit muss verlängert werden, um die zu schnell Entladen beobachtet Kriechen überwunden werden. </li></ol> 3. Ortsaufgelöste ATR-FTIR-Spektroskopie Die Verwendung eines Aufschiebe-ATR-Zubehör auf einem FTIR-Mikroskop angebracht ist eine vorgeschlagene Methode zur ortsaufgelösten Fourier Transformations sammeln Infrarot (FTIR)-Spektren des laAnwälten in einem Fisch-Skala Probe. Die ATR-Zubehör ermöglicht die Sammlung von hoher Qualität Spektren mit sehr kleinen (~ 10 um 2) räumliche Auflösung, die nicht erreichbar ist, mit einem anderen FTIR-Technik. Das gleiche polierten Probe Nanoindentierung Experimente hergestellt (Fig. 2) wurde in diesen Experimenten verwendet. <ol><li> Wählen Sie eine Probe mit einer Oberfläche und Abmessungen für die FTIR-Mikroskop ist für die Analyse verwendet angebracht, sorgen für hohe Qualität Spektren von ATR-FTIR Spektromikroskopie erhalten. </li><li> Bereiten Sie die FTIR-Mikroskop, um Daten zu sammeln. FTIR-Mikrospektroskopie erfordert Kalibrierung des FTIR-Signal unter den gleichen Bedingungen genommen werden, wie es für die Messung der Probe verwendet werden. Typischerweise umfaßt dieser Kühl dem Detektor und damit Zeit für sie zu stabilisieren sowie die Sammlung aller Grundspektren und der Probenspektren unter denselben Umgebungsbedingungen. Dies kann besonders wichtig, weil CO 2 und Wasserdampf in der Luft sein, oder dramatically beeinflussen FTIR-Spektren. Es ist auch wichtig, um sicherzustellen, daß der Optik des Instruments ausgerichtet sind. </li><li> Sammeln Sie eine entsprechende Hintergrundspektrum, um die Probe gegen subtrahieren. Für diese Experimente wurde eine polierte, Gold beschichtete Mikroskop-Objektträger als Hintergrund für FTIR Spektromikroskopie verwendet. </li><li> Mit Hilfe eines geeigneten Ziel, den Schwerpunkt auf die Probe und wählen Sie einen Bereich von Interesse für die Analyse. </li><li> Sobald ein Gebiet von Interesse gefunden, schließen Sie das Zubehör für die ATR-FTIR Mikroskop-Objektiv, heben Sie die Probe, bis er engen Kontakt mit der ATR internen Reflexionselement macht, und sammeln ein Probenspektrum. </li><li> Nach dem Sammeln der FTIR-Spektren, führen die notwendige Standard-Datenverarbeitung erforderlich. </li></ol> 4. Röntgen-Computertomographie (CT) <ol><li> Erhalten und bereiten Skala, wie in Abschnitt 1.1 diskutiert </li><li> Scanner-Setup <ol><li> Aufwärmen der Röntgenquelle gemäß Herstellerangaben. </li><li> Set Röntgen Spannung und Strom auf 50 kV und 160 &amp;mgr; A sind. </li><li> Stellen Sie die Belichtungszeit auf 1450 ms. </li><li> Wählen Sie ein 1,0 mm Aluminiumfilter. </li><li> Vor dem Laden Probe, machen Sie eine Flat-Field-Korrektur, wenn die Röntgenquelle ausgeschaltet ist (Dunkelfeld) und (Hellfeld). </li></ol></li><li> Berg-und Last Specimen Waagen müssen so montiert werden, dass sie nicht verrutschen oder bewegen über die gesamte Länge des Scans. Diese Proben werden auch unter Verwendung von Materialien, die fast transparent für Röntgenstrahlen sind, montiert werden. Eine Kombination aus Styropor und Parafilm verwendet werden, um den Maßstab auf dem CT-Bühne zu sichern. <ol><li> Starr montieren Probe, so dass die längste Abmessung parallel zu dem Detektor ist. </li><li> Sichern Sie die Probe montiert an den Scanner Bühne. </li><li> Positionieren der Probe, so dass es in der Mitte der Drehung während des Zyklus sein. </li><li> Wählen Sie die höchste Auflösung, die die gesamte Skala im Sichtfeld (FOV) ermöglicht werden, in diesem Fall7,5 um. </li></ol></li><li> Acquisition Einstellungen Führen Sie Scans in dieser Studie mit einem Drehschritt von 0,25 ° und einer Bildmittelungswert von 15. Wenn niedrigeren Auflösungen sind akzeptabel, erhöhen Sie die Schrittgröße und / oder verringern Sie den Rahmen mit durchschnittlich um die Gesamtzykluszeit zu reduzieren. </li><li> Wiederaufbau Parameter Nachdem ein Datensatz erhalten wird, rekonstruiert die Röntgenprojektionsbilder, um einen Datensatz mit Querschnittsbildern zu erzeugen. Wählen Skyscan der NRecon Software Standardeinstellungen mit Ausnahme der folgenden. <ol><li> Ändern Sie den Ring Artefakt-Korrektur bis 20. </li><li> Ändern Sie den Strahlaufhärtungskorrektur zu 25%. </li><li> Passen Sie die CS Static Rotation um Querschnittsbild Ebene. </li></ol></li><li> Bildverarbeitung Verwenden Skyscan der CTAN-Software, um das endgültige Bild 3D Grau erhalten. Stellen Sie die Graustufenbereich auf ein angemessenes Niveau, um die Artefakte aus dem Styropor und Parafilm zu entfernen. </li></ol> Proben durch Polieren für Nanoindentierung und micro-/nano-structure Charakterisierung hergestellt wurden unter Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie (SEM) untersucht. Niedervakuum-Modus wurde zur Dehydratisierung von Proben und die Notwendigkeit für den Einsatz von leitfähigen Beschichtungen zu minimieren. Lokale chemische Analyse wurde an polierten Proben in Verbindung mit SEM-Bildgebung mittels energiedispersiver Röntgenspektroskopie (EDX) durchgeführt. EDX-Analysen wurden in der gleichen Zeile / Raster, das durch Nanoindentierung, um Korrelationen zwischen den chemischen und mechanischen Eigenschaften untersucht wurde durchgeführt. Frisch Bruchflächen wurden auch von SEM untersucht, um bessere Informationen über die Morphologie und Orientierung der biomineralisierten in den Fischschuppen gegenwärtigen Strukturen zu schaffen. Um die Auflösung für die Beobachtung der Nano-Struktur auf Bruchflächen zu verbessern, wurden die Proben mit Sputter-Gold (Au) beschichtet und in Hochvakuum-Modus abgebildet. Die folgendebietet zusätzliche Informationen zu den verwendeten Verfahren. <ol><li> SEM-Imaging von polierten Oberflächen <ol><li> Zeigen poliert Probe in SEM Kammer und Pumpenkammer in Niedervakuum-Modus mit Kammerdruck von 0,1 bis 0,5 mbar. </li><li> Passen Arbeitsabstand auf ca. 5,0 mm. </li><li> Aktivieren Hochspannung (HV) und navigieren Sie zu Region von Interesse auf Probe, die die Übergangszone zwischen ganoine und knöchernen Unterschichten oder andere Bereiche von Interesse sind. </li><li> Erhalten Sie Bilder mit 15-kV-Hochspannungs-und Strahlstrom von etwa 3,9 nA. </li><li> Fokus Bild und führen Sie alle notwendigen Ausrichtungen und Stigma Anpassungen. </li><li> Machen Sie Bilder aus mindestens drei Regionen von Interesse an relevanten Vergrößerungen (typischerweise 250X zu 10.000 X) mit der Niedervakuum zurückgestreute Elektronen (BSE)-Detektor, um die Identifizierung von Veränderungen in Biomineral Gehalt und Dichte (dh dichten Knochen vs porösen Knochen helfen ). </li></ol></li><li> SEM-Imaging von Bruchflächen <ol><li> Bringen Sie frisch gebrochenen Probe in einem 90 ° SEM Stub mit doppelseitigem Kohlenstoffband mit der Bruchfläche nach oben zeigt. </li><li> Sputter-Mantel mit Au, eine sub-nm dicke leitfähige Schicht auf der Bruchfläche bieten. </li><li> Zeigen Probe in SEM Kammer und Pumpenkammer in Hochvakuum-Modus. </li><li> Passen Arbeitsabstand zwischen 3,0 und 5,0 mm. </li><li> Aktivieren HV und navigieren Sie zu interessierenden Bereiche auf der Probe. Primäre Bereiche von Interesse waren in diesem Fall die derzeitige Struktur in den ganoine-und Knochenschichten. </li><li> Erhalten Sie Bilder zwischen 5 kV und 15 kV HV und einer niedrigeren Strahlstrom von 0,24 nA, um die Auflösung zu verbessern. </li><li> Probe zunächst konzentrieren und führen vorläufigen Ausrichtungen. </li><li> Vergrößerung erhöhen, um mehr als 5.000 X und Switch von normalen Feldemissions Linse in Tauch-/ ultra-hochauflösenden (UHR) Objektiv. </li><li> Führen UHR Ausrichtungen und Stigma Anpassungen. </li><li> Machen Sie Bilder aus mindestens drei Regionen of Interesse an relevanten Vergrößerungen (in der Regel 5.000 bis 250.000 X X) mit der durch die Linse Detektor (TLD) in Sekundärelektronen (SE)-Modus betrieben. </li></ol></li><li> Die EDX-Analyse der polierten Oberflächen (in Verbindung mit SEM-Bildgebung durchgeführt wird). Diese Parameter sind materialabhängig und müssen so eingestellt werden, der EDX-Wechselwirkungsvolumen ist in der Größe auf die Nanoindentierung Wechselwirkungsvolumen durch Moser 14 diskutiert. <ol><li> Navigieren Sie zum Bereich von Interesse auf polierten Probe, die von Markierungszeichen am Ende jeder Zeile der Gedankenstrich angegeben Nanoindentierung Gitter enthält. </li><li> Sicherzustellen HV mindestens 15 kV, Strahlstrom ist mindestens 3,9 nA, und der Arbeitsabstand größer als 5,0 mm ist. </li><li> Erfassen BSE Bild der Region mit EDX analysiert werden. </li><li> Mit EDX-Analyse-Software, erfassen das gleiche Bild, um bei der Suche nach Bereichen der chemischen Analyse auf der Linie der Gedankenstrich durchführen zu helfen. </li><li> Mit der &quot;Linie Analysis&quot;-Technik, poabgehoben und eine Linie der chemischen Analyse auf der Linie der Interessen der Gedankenstrich ab dem ersten Gedankenstrich und endend bei dem letzten Gedankenstrich durchzuführen. </li><li> Geben Sie die Anzahl von Analysepunkten entlang der Linie platziert werden. Es ist am besten, um die gleiche Anzahl von Analysepunkte und Gedankenstriche, die vorhanden, um einen direkten räumlichen Zusammenhang zwischen der chemischen Zusammensetzung und mechanischen Eigenschaften sind zu verwenden. </li><li> Wenn die Zeile positioniert und die Punkte richtig angegeben, initiieren die Online-Analyse mit EDX-Software. </li><li> Wenn die Online-Analyse abgeschlossen ist, identifizieren Elemente von Interesse, von dem Punkt Spektren entlang der angegebenen Zeile auf der polierten Oberfläche der Probe erhalten quantifiziert werden. </li><li> Sobald Elemente von Interesse identifiziert werden, führen Sie eine Hintergrundkalibrierung für Bremsstrahlung und andere Effekte zu berücksichtigen. </li><li> Wählen Sie Dekonvolutionsanalyse Option der Software, um quantitative Analysen zu jedem Punkt entlang der angegebenen Zeile zu quantifizieren zu erhaltentifizieren die chemische Zusammensetzung an jedem Punkt. </li><li> Sparen quantitativen chemischen Analyse-Ergebnisse zusammen mit dem Bild der angegebenen Zeile, die analysiert wurde, um in der räumlichen Korrelation mit mechanischen Eigenschaften gemessen mit Nanoindentierung unterstützen. </li></ol></li></ol>

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	<li>Allison, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+and+structure+of+the+biological+multilayered+material+system,+Atractosteus+spatula+scales.">Mechanical properties and structure of the biological multilayered material system, Atractosteus spatula scales.</a> Acta Biomater. 9, 5289-5296 (2013).</li><li>Bruet, B. J. F., Song, J., Boyce, M. C., Ortiz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+design+principles+of+ancient+fish+armour.">Materials design principles of ancient fish armour.</a> Nat. Mater. 7, 748-756 (2008).</li><li>Lin, Y. S., Wei, C. T., Olevsky, E. A., Meyers, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+and+the+laminate+structure+of+Arapaima+gigas+scales.">Mechanical properties and the laminate structure of Arapaima gigas scales.</a> J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 4, 1145-1156 (2011).</li><li>Marino Cugno Garrano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanical+behavior+of+scales+from+Cyprinus+carpio.">On the mechanical behavior of scales from Cyprinus carpio.</a> J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 7, 17-29 (2012).</li><li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microstructural+studies+of+the+armor+of+the+marine+threespine+stickleback+(Gasterosteus+aculeatus).">Quantitative microstructural studies of the armor of the marine threespine stickleback (Gasterosteus aculeatus).</a> J. Struct. Biol. 171, 318-331 (2010).</li><li>Wang, L., Song, J., Ortiz, C., Boyce, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+design+of+a+multilayered+biological+exoskeleton.">Anisotropic design of a multilayered biological exoskeleton.</a> J. Mater. Res. 24, 3477-3494 (2009).</li><li>Ikoma, T., Kobayashi, H., Tanaka, J., Walsh, D., Mann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstructure,+mechanical,+and+biomimeetic+properties+of+fish+scales+from+Pagrus+major.">Microstructure, mechanical, and biomimeetic properties of fish scales from Pagrus major.</a> 142, 327-333 (2003).</li><li>O'Connell, M. T., Shepherd, T. D., O'Connell, A. M. U., Myers, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+declines+in+two+apex+predators,+bull+sharks+(Carcharhinus+leucas)+and+alligator+gar+(Atractosteus+spatula),+in+Lake+Pontchartrain,+an+Oligohaline+estuary+in+southeastern+Louisiana.">Long-term declines in two apex predators, bull sharks (Carcharhinus leucas) and alligator gar (Atractosteus spatula), in Lake Pontchartrain, an Oligohaline estuary in southeastern Louisiana.</a> Estuar. Coast. 30, 567-574 (2007).</li><li>Long Jr, J. H., Hale, M. E., McHenry, M. J., Westneat, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+fish+skin:+flexural+stiffness+and+steady+swimming+of+longnose+gar+Lepisosteus+osseus.">Functions of fish skin: flexural stiffness and steady swimming of longnose gar Lepisosteus osseus.</a> J. Exp. Biol. 199, 2139-2151 (1996).</li><li>Page, L. M., Burr, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A field guide to freshwater fishes. The Peterson field guide series. , (1991).</li><li>Thompson, K. S., McCune, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+scales+in+Lepisosteus+as+a+model+for+scale+formation+in+fossil+fishes.">Development of the scales in Lepisosteus as a model for scale formation in fossil fishes.</a> J. Linn. Soc. Longdon, Zool. 82, 73-86 (1984).</li><li>Yang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+fracture+resistance+of+alligator+gar+(Atractosteus+spatula)+armored+fish+scales.">Structure and fracture resistance of alligator gar (Atractosteus spatula) armored fish scales.</a> Acta. Biomater. 9, 5876-5889 (2013).</li><li>Moser, R. D., Allison, P. G., Chandler, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Impact+Damage+in+Ultra-High+Performance+Concrete+Using+Spatially+Correlated+Nanoindentation/SEM/EDX.">Characterization of Impact Damage in Ultra-High Performance Concrete Using Spatially Correlated Nanoindentation/SEM/EDX.</a> J. Mater. Eng. Perf. 22, 1-7 (2013).</li><li>Oliver, W. C., Pharr, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+technique+for+determining+hardness+and+elastic+modulus+using+load+and+displacement+sensing+indentation+experiments.">An improved technique for determining hardness and elastic modulus using load and displacement sensing indentation experiments.</a> J Mater Res. 7, 1564-1583 (1992).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Agilent Technologies Nano Indenter G200 User's Guide. , (2012).</li><li>Ulm, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+indentation+techniques+for+hydrated+nanocomposites:+concrete,+bone,+and+shale.">Statistical indentation techniques for hydrated nanocomposites: concrete, bone, and shale.</a> J. Amer. Cer. Soc. 90, 2677-2692 (2007).</li><li>Randall, N. X., Vandamme, M., Ulm, F. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoindentation+analysis+as+a+two-dimensional+tool+for+mapping+the+mechanical+properties+of+complex+surfaces.">Nanoindentation analysis as a two-dimensional tool for mapping the mechanical properties of complex surfaces.</a> J. Mater. Res. 24, 679-690 (2009).</li><li>Oyen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoindentation+of+Biological+and+Biomimetic+Materials.">Nanoindentation of Biological and Biomimetic Materials.</a> Exper. Tech. 37, 73-87 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Aus experimenteller Sicht, müssen die Forscher zu bedenken, dass bei der Arbeit mit natürlich vorkommenden biologischen Materialien wie mineralisierten Fischschuppen, die Berichterstattung über die räumliche Lage der Skala auf dem Fisch ist kritisch, da Forschung hat vor mechanischen Eigenschaften der mineralisierten Fischschuppen gezeigt sind abhängig wo die Skalen auf den Fisch 4 angeordnet. Mechanische Eigenschaften von mineralisierten biologischen Materialien wurde auch gezeigt, abhängig von der Hydratisierung der Proben 4 sein. Dies schränkt den Nutzen dieser Technik, wenn sie versuchen, um frische Proben, die ordnungsgemäß veröffentlicht Ergebnisse in der offenen Literatur, die versteinerten trockenen Proben verwenden hydratisiert haben vergleichen. Daher müssen längere Testzeiten zu vermeiden, um die Effekte der Entwässerung auf einer Probe während der mechanischen Eigenschaften Nanoindentierung minimieren. Materialspezifische Pilotstudien werden empfohlen, um die Erfahrung zu gewährleistenment Laufzeit minimal ist genug, um das mechanische Verhalten des Materials nicht ändern. Nasszelle Nanoindentierung würde eine bevorzugte Methode, um eine konstante Hydratation Zustand des Materials zu halten, wenn das Testgerät ermöglicht es. Die Nano-Eindruckverfahren in dieser Studie verwendet, die den E-Modul aus der Entlastungskurve berechnet, geht das Material verhält sich wie ein linear elastisches isotropes Material. Das Verfahren kann mit einer Vielzahl von Spitzen der Verzahnungen verwendet werden. Jedoch wurde die dreiseitige Berkovich-Spitze mit einem Halbwinkel von 65,35 ° in dieser Studie verwendet. Alternative Tipps, wie die Würfelecken (Halbwinkel = 35,36 °) sind für die in diesem Manuskript vorgestellte Verfahren, aber da die Würfelecken Spitze spitzer ist als die Spitze Berkovich Risse in der Probe bei viel geringeren Belastungen als mit erzeugt werden Berkovich die Spitze. Polieren ist ein wesentlicher Schritt, um eine glatte und ebene Oberfläche mit einer minimierten surfac erhaltenE Rauheit nicht auf die Nanoindentierung Ergebnisse. Die Polierschritte in diesem Manuskript präsentiert eine vorgeschlagene Verfahren, die eventuell, je nach der Art der verwendeten Polier geändert werden. Allerdings ist der entscheidende Schritt, um genaue Daten zu gewährleisten, dass Nanoindentierung Oberflächenrauhigkeit minimiert wird, und aus diesem speziellen Material eine 50 nm letzten Schliff war erforderlich, um eine glatte, ebene Oberfläche an den Eindringtiefen, die geprüft wird erhalten. Der Abstand der Gedankenstrich sorgt auch für präzise Nanoindentierung Daten, die nicht durch die Materialverformung von früheren Gedankenstrich auftretenden beeinflusst wird. Die Nanoindentor Bedienungsanleitung für das Gerät in dieser Studie vorgeschlagen, dass Gedankenstrich Abstand sollte mindestens 20-30x die maximale Eindringtiefe Berkovich Eindringkörpern 15 sein. Alternative Werkstoffe wird das erforderliche Einzugsabstand benötigen, um auf der Basis der aufgebrachten Last und die maximale Eindringtiefe bestimmt, wie zuvor in der offenen diskutiertLiteratur 16,17. Zusätzlich wurde die Haltezeit für dieses Material entschieden, keine für die verschiedenen Materialphasen untersucht unter Berücksichtigung der Nanoindentor Software Oliver-Pharr Analysemethode verwendet werden beobachtet Kriechen überwinden. Wie jedoch von Oyen 18 diskutiert alternative Analyseverfahren für biologische Materialien, wenn zeitabhängige Material-Antworten können mit geeigneten Haltezeiten überwunden werden, zur Verfügung. Um hochauflösende Ergebnisse von Röntgen-CT zu erreichen, müssen einige Einstellungen optimiert werden. Dieses Papier umreißt eine Reihe von sehr spezifischen Parameter für die Verwendung auf einem Fischschuppen mit einer einzigartigen Größe und Schichtdicke. Mit unterschiedlichen Stichprobengrößen, werden diese Einstellungen müssen angepasst werden, um eine Datenmenge von höchster Qualität zu erhalten. Der Prozess der Auswahl der einzelnen Parameter sollte in der Bedienungsanleitung, die mit der Maschine, die verwendet wird, stammt eindeutig definiert werden. Scan-Einstellungen (Spannung, Strom, Belichtung, Filterauswahl) und die Rekonstruktion Einstellungen(Ringartefakte, Strahlverfestigung) müssen möglicherweise modifiziert werden, um eine Vielzahl von anderen Probengrößen und Geometrien anzupassen. Röntgen-CT ein Bild des gesamten angelegten Morphologie Identifizieren eines ganoine Schicht, die eine Knochenmaterialschicht nur, wenn die Waage nicht überlappen. Die Röntgen-CT-Bildern identifiziert, dass das ganoine Schicht bestand aus einer nicht gleichförmigen Dicke über der Skala, und selbst wies Vertiefungen, die die ganoine Schicht fehlte gänzlich. Interessanterweise sind die Nanoindentierung Daten räumlich an die SEM / EDX chemische Analyse korreliert identifiziert eine scharfe diskreten Übergang zwischen den zwei Schichten statt einer von den mineralisierten Fischschuppen des P. beobachtet allmählicher Übergang senagalus (in Bruet et al. 2). Eine Kombination von Nanoindentierung, FTIR, EDX und SEM vorgesehen mechanische Eigenschaft, chemische Analyse und Strukturinformationen, um zu bestätigendie äußere Schicht als ganoine mit Emaille-ähnliche Morphologie und Chemie. Darüber hinaus bestätigt diese Techniken die innere Schicht als Knochenmaterialschicht. Abschließend werden die in dieser Studie beschriebenen Methoden identifiziert das Verfahren und die entsprechenden Ergebnisse, um die mineralisierte Fisch Skala von A. prüfen Spachtel aus der Volumenstruktur auf der Nanostruktur und die chemische Zusammensetzung.

Forscher untersuchen Struktur Biomaterialien und versuchen, die Design-Prinzipien, die Struktur Biomaterialien mit verbesserten mechanischen Eigenschaften, wie viel höhere Zähigkeit und Festigkeit im Vergleich zu ihren einzelnen Bestandteilen bereitzustellen aufzuklären. Die Untersuchungen an den Design-Prinzipien von gepanzerten Fischschuppen für Pagrus Haupt 7, Polypterus senagalus 2,6, Arapaima gigas 3, Cyprinus Carpio 4 und Atractosteus Spatel 1 haben die Notwendigkeit, die Anwendung der bestehenden experimentellen Methoden erweitern, um die Strukturantworten Studie zeigte, und mikrostrukturellen Eigenschaften, da detaillierte Standardverfahren sind für diese Arten von Materialien und Experimente zur Verfügung. Unter den verschiedenen Panzerfischschuppen diskutiert, A. Spatel ist eine historisch Raub Spitze des zentralen US-8 und ist eine Art mit hoherly mineralisierten Skalen. Die Art Austausch Muskelmasse für die Haut, eine verbesserte Massenraubabwehrsystem im Vergleich zu den Fischen vergleichbarer Größe zuvor erwähnten 9 erhalten. Laut Seite 10 und Burr, A. Spachtel ist die drittgrößte Süßwasserfische in Nordamerika mit dem weißen Stör (Acipenser transmontanus) und Atlantic Stör (Acipenser oxyrhynchus) größer Arten. Die hoch-mineralisierten Fischschuppen von A. Spachtel sind erst vor kurzem untersucht. Thompson und McCune 11 vorgeschlagen, dass die Morphologie der gar Skalen haben einen dreischichtigen Aufbau, bestehend aus einer ganoine äußere Schicht, eine diffuse Knochenschicht und Lamellenknochenschicht. Die aktuelle Forschung auf dem A. Spachtel Skalen haben nicht unterschieden die Knochenschicht in diffuse oder Lamellenknochen Regionen, sondern hat gerade die Knochenbereich studierte als eine einzige innere Schicht 1,12. In dieser Studie, die Verfahren für die investigating die Mikrostruktur, Nanostruktur, die chemische Zusammensetzung und die räumliche Verteilung der mechanischen Eigenschaften der Waage A. Spatel auf Ergebnisse der FTIR-Spektroskopie, REM, Röntgen-CT und Nanoindentierung Techniken vorgestellt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epoxy resin</td>
			<td style="width:71px;">Buehler</td>
			<td style="width:119px;">701-501512</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epoxy hardener</td>
			<td style="width:71px;">Buehler</td>
			<td style="width:119px;">703-501528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Samplkups</td>
			<td style="width:71px;">Buheler</td>
			<td style="width:119px;">20-8180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SamplKlips I</td>
			<td style="width:71px;">Buehler</td>
			<td style="width:119px;">20-4100-100S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High precision cut-off saw</td>
			<td style="width:71px;">Buehler</td>
			<td style="width:119px;">Isomet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UltraMet 2002 sonic cleaner</td>
			<td style="width:71px;">Buehler</td>
			<td style="width:119px;">B2510R-MT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polisher</td>
			<td style="width:71px;">Buehler</td>
			<td style="width:119px;">49-1750-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1200 grit (15-um) SiC paper</td>
			<td style="width:71px;">Struers</td>
			<td align="right" style="width:119px;">40400012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4000 grit (6-um) SiC paper</td>
			<td style="width:71px;">Struers</td>
			<td align="right" style="width:119px;">40400014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50-nm colloidal silica</td>
			<td style="width:71px;">Buehler</td>
			<td style="width:119px;">40-10075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Chemomet polishing pad for 50-nm suspension</td>
			<td style="width:71px;">Buehler</td>
			<td style="width:119px;">40-7918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nanoindenter</td>
			<td style="width:71px;">MTS</td>
			<td style="width:119px;">G200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FTIR continuum microscope</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Nicollet</td>
			<td align="right" style="width:119px;">6700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">X-ray Computed Tomography</td>
			<td style="width:71px;">Skyscan</td>
			<td style="width:119px;">Skyscan 1173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SEM</td>
			<td style="width:71px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;">NovaNanoSEM 630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EDX</td>
			<td style="width:71px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">AXS Xflash detector 4010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sputter Coater</td>
			<td style="width:71px;">Denton</td>
			<td style="width:119px;">Desk II</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of multi-layered fish scales (atractosteus spatula) using nanoindentation, x-ray ct, ftir, and sem

Die hierarchische Architektur des Schutz biologischen Materialien wie mineralisierten Fischschuppen, Schneckenschalen, Widderhorn, Geweih und Schildkrötenpanzer bietet einzigartige Design-Prinzipien mit Potentialen zur Führung der Gestaltung der Schutz Materialien und Systeme in der Zukunft. Das Verständnis der Struktur-Eigenschafts-Beziehungen für diese Materialsysteme auf der Mikronanobereich und bei denen ein Versagen initiiert ist unerlässlich. Derzeit experimentellen Techniken wie Nanoindentierung, Röntgen-CT und SEM den Forschern ein Weg, um das mechanische Verhalten mit hierarchischen Mikrostrukturen dieser Materialsysteme 1-6 korrelieren. Allerdings ist eine gut definierte Standardverfahren für die Probenvorbereitung von mineralisierten Biomaterialien derzeit nicht verfügbar. In dieser Studie wurden die Verfahren zur Untersuchung räumlich korrelierten chemischen, strukturellen und mechanischen Eigenschaften des Mehrschicht Skala von A. Spachtel mit Nanoindentierung, FTIR, SEM, mit enEnergie-dispersive Röntgen-(EDX)-Mikroanalyse und Röntgen-CT dargestellt.

Abbildung 3 zeigt die durchschnittlichen Ergebnisse von räumlich korreliert nanoinidentation / SEM / EDX-Analysen über die etwa 800 um lang Kurzachsenquerschnitt durchgeführt. In der etwa 60 um dick ganoine Schicht, der Nanoindentor berechnet eine durchschnittliche E-Modul von 69,0 GPa und Härte von 3,3 GPa. Die Nanoindenters bestimmt eine durchschnittliche Modul von 14,3 GPa und Härte von 0,5 GPa für die rund 740 um dicken Knochenschicht. EDX bestimmt Kohlenstoff, Sauerstoff, Calcium und Phosphor, die in der Regel in mineralisierten Skalen gefunden werden. Allerdings enthielten die ganoine und Knochenschichten quantifizierbare Unterschiede in der chemischen Zusammensetzung. Die beobachtete C-Spitze in der Knochenschicht auf, dass nicht in der Region als hoch mineralisiert, was zu einem leichten Anstieg der Kohlenstoff, der verursachte auch die beobachtete Abnahme der Gesamthelligkeit des BSE-Bild ergibt zugeschrieben werden. Insbesondere die ganoine Schicht &#39;, S bedeuten Atomkonzentrationsverhältnis von Ca: P von 1,71 erschien ähnlich Hydroxylapatit mit einem theoretischen Verhältnis von 1,67. Durchschnittliche Ca des Knochenschicht: P-Verhältnis sank auf 1,51, was einem Rückgang in Höhe von Mineralisierung aus der ganoine Schicht. FTIR-Spektren in Abbildung 4 für die Knochenschicht und ganoine Schicht wurden die wichtigsten funktionellen Gruppen wie Amid-, Carboxyl-, Phosphat-und Carbonyl. Insbesondere bestätigt FTIR die visuelle Beobachtung von Hydroxylapatit-Signaturen in den äußeren (ganoine)-Schicht und Kollagen Unterschriften in der Innen (Knochen-) Schicht. Spitzen bei 3,500-3,000 cm -1 durch NH-Streck und NH Biege zwischen 1.550 und 1.500 cm -1 darstellen Amid-Gruppen in der Knochenschicht. Peaks im Bereich der Wellenzahl 1,470-1,365 cm -1 repräsentieren Amid substituierte Alkylgruppen. Zusätzlich wurde eine ausgeprägte C = O-Streckschwingung bei 1.641 cm -1 auf der Knochenschicht beobachtet. Erbseks von 3,000-2,500 cm -1 darstellen Carbonsäuregruppen. Sowohl die Knochen und ganoine Schichten &#39;Spektren erzeugt einen unverwechselbaren Höhepunkt in der Nähe von 1,079.33 cm -1 bezeichnend für Stretching Phosphat. Röntgen-CT-Bilder in Abbildung 5 erfasst, dass die ganoine Schicht nicht die Knochenschicht, wo die Schuppen überlappen zu decken. Die helleren grau ganoine Schichten zeigen, dichter, härter und steifer Phasen während dunklere Grau Knochenschichten zeigen, weniger dicht und weniger steif Phasen. Zusätzlich kann die Röntgen-CT-Bildern bei der Ermittlung der Ungleichförmigkeit ganoine Schichtdicke unterstützt. In der Tat sind klar Gruben beobachtet nahe dem Zentrum des ganoine Schicht, die die Knochenschicht nicht decken überhaupt. Das REM-Bild in Fig. 6A der Bruchfläche mit H 3 PO 4 weggeätzt ergab Nanostrukturen in einer Schichtmuster für die ganoine Schicht organisiert. Diese Nanostäbchen organisiertStruktur korreliert mit dem Hydroxyapatit Signaturen aus dem FTIR zur ganoine Bereich erhalten. Fig. 6A zeigt eine typische geringere Vergrößerung REM-Aufnahme einer Bruchfläche eindeutig identifiziert, den Übergang zwischen den ganoine und Knochenschichten mit der gestrichelten Linie. 6B stellt die höhere Vergrößerung REM-Aufnahmen der Bruchfläche nach dem Ätzen mit H 3 PO 4. Nach dem Ätzen orientierten Nanostäbchen in der äußeren Schicht ganoine eindeutig identifizierbar sind, während eine faserartige Nanostruktur im Knochenschicht beobachtet. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51535/51535fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51535/51535fig3.jpg" /> Abbildung 3. Modul und Härte Daten aus Nanoindentierung räumlich SEM / EDX chemische Zusammensetzung korreliert. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51535/51535fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51535/51535fig4.jpg" /> Abbildung 4. FTIR-Spektren von der Außen (ganoine) und inneren (knöcherne)-Schichten gesammelt. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51535/51535fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51535/51535fig5.jpg" /> 5. Röntgen-CT-Bilder, die Lochfraß auf der äußeren (ganoine) Schicht, die die innere (knöchernen) Schicht. <img alt="Fig. 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51535/51535fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51535/51535fig6.jpg" /> 6. (A) Nieder Vergrößerung SEM-Bild von typischen Bruchfläche, (B) Bilder mit höherer Vergrößerung des Nanostäbchen in der äußeren (ganoine) und Fasern in der inneren (bony)-Schichten .. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51535/51535fig6highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Characterization Of Multi-layered Fish Scales Atractosteus spatula Using Nanoindentation, X-ray CT, FTIR, and SEM

Dieses Papier zeigt die zum Sondieren räumlich korrelierten chemischen, strukturellen und mechanischen Eigenschaften des Mehrschicht Maßstab Atractosteus Spatel (A. Spatel) mit Nanoindentierung Methoden, Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR), Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und Röntgen Strahl-Computertomographie (Röntgen-CT). Die experimentellen Ergebnisse wurden verwendet, um die Konstruktionsprinzipien der Schutz biologischen Materialien zu untersuchen.

Charakterisierung von mehrschichtigen Fischschuppen (<em&gt; Atractosteus Spachtel</em&gt;) Verwendung Nanoindentierung, Röntgen-CT-, FTIR-und SEM

The hierarchical architecture of protective biological materials such as mineralized fish scales, gastropod shells, ram&#8217;s horn, antlers, and turtle ...

characterization-multi-layered-fish-scales-atractosteus-spatula-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Characterization Of Multi-layered Fish Scales (Atractosteus spatula) Using Nanoindentation, X-ray CT, FTIR, and SEM

15.1K Aufrufe.  U.S. Army Engineer Research and Development Center.  Dieses Papier zeigt die zum Sondieren räumlich korrelierten chemischen, strukturellen und mechanischen Eigenschaften des Mehrschicht Maßstab Atractosteus Spatel (A. Spatel) mit Nanoindentierung Methoden, Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR), Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und Röntgen Strahl-Computertomographie (Röntgen-CT). Die experimentellen Ergebnisse wurden verwendet, um die Konstruktionsprinzipien der Schutz biologischen Materialien z...

Serie: Characterization Of Multi-layered Fish Scales Atractosteus spatula Using Nanoindentation, X-ray CT, FTIR, and SEM

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT)

Various techniques of cardiac tissue engineering have been pursued in the past decades including scaffolding strategies using either native or bioartificial scaffold materials, entrapment of cardiac myocytes in hydrogels such as fibrin or collagen and stacking of myocyte monolayers 1. These concepts aim at restoration of compromised cardiac function (e.g. after myocardial infarction) or as experimental models (e.g. predictive toxicology and substance screening or disease modelling). Precise monitoring of cell survival after implantation of engineered heart tissue (EHT) has now become possible using in-vivo bioluminescence imaging (BLI) techniques 2. Here we describe the generation of fibrin-based EHT from a transgenic rat strain with ubiquitous expression of firefly luciferase (ROSA/luciferase-LEW Tg; 3). Implantation is performed into the greater omentum of different rat strains to assess immune responses of the recipient organism following EHT implantation. Comparison of results generated by BLI and the Enzyme Linked Immuno Spot Technique (ELISPOT) confirm the usability of BLI for the assessment of immune responses.

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue EHT

This video demonstrates the use of in vivo bioluminescence imaging to study immune responses after implantation of Engineered Heart Tissue (EHT) in rats.

Biolumineszenz-Bildgebung für die Beurteilung von Immunantworten nach der Implantation von Engineered Heart Tissue (EHT)

Various techniques of cardiac tissue engineering have been pursued in the past decades including scaffolding strategies using either native or ...

Forschung

Biotechnik

Small and Wide Angle X-Ray Scattering Studies of Biological Macromolecules in Solution

In this paper, Small and Wide Angle X-ray Scattering (SWAXS) analysis of macromolecules is demonstrated through experimentation. SWAXS is a technique where X-rays are elastically scattered by an inhomogeneous sample in the nm-range at small angles (typically 0.1 - 5&deg;) and wide angles (typically &gt; 5&deg;). This technique provides information about the shape, size, and distribution of macromolecules, characteristic distances of partially ordered materials, pore sizes, and surface-to-volume ratio. Small Angle X-ray Scattering (SAXS) is capable of delivering structural information of macromolecules between 1 and 200 nm, whereas Wide Angle X-ray Scattering (WAXS) can resolve even smaller Bragg spacing of samples between 0.33 nm and 0.49 nm based on the specific system setup and detector. The spacing is determined from Bragg's law and is dependent on the wavelength and incident angle.
In a SWAXS experiment, the materials can be solid or liquid and may contain solid, liquid or gaseous domains (so-called particles) of the same or another material in any combination. SWAXS applications are very broad and include colloids of all types: metals, composites, cement, oil, polymers, plastics, proteins, foods, and pharmaceuticals. For solid samples, the thickness is limited to approximately 5 mm.
Usage of a lab-based SWAXS instrument is detailed in this paper. With the available software (e.g., GNOM-ATSAS 2.3 package by D. Svergun EMBL-Hamburg and EasySWAXS software) for the SWAXS system, an experiment can be conducted to determine certain parameters of interest for the given sample. One example of a biological macromolecule experiment is the analysis of 2 wt% lysozyme in a water-based aqueous buffer which can be chosen and prepared through numerous methods. The preparation of the sample follows the guidelines below in the Preparation of the Sample section. Through SWAXS experimentation, important structural parameters of lysozyme, e.g. the radius of gyration, can be analyzed.

The demonstration of the small and wide angle X-ray scattering (SWAXS) procedure has become instrumental in the study of biological macromolecules. Through the use of the instrumentation and procedures of specific angle methods and preparation, the experimental data from the SWAXS displays the atomic and nano-scale characterization of macromolecules.

Kleine und Wide Angle X-Ray Scattering Studium der biologischen Makromolekülen in Lösung

In this paper, Small and Wide Angle X-ray Scattering (SWAXS) analysis of macromolecules is demonstrated through experimentation. SWAXS is a technique ...

Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should mimic the human tissues they are aiming to replace; to provide the required anatomical shape, the materials must be able to sustain the mechanical forces they will experience when implanted at the defect site. Although the mechanical properties of tissue-engineered scaffolds are of great importance, many human tissues that undergo restoration with engineered materials have not been fully biomechanically characterized. Several compressive and tensile protocols are reported for evaluating materials, but with large variability it is difficult to compare results between studies. Further complicating the studies is the often destructive nature of mechanical testing. Whilst an understanding of tissue failure is important, it is also important to have knowledge of the elastic and viscoelastic properties under more physiological loading conditions.
This report aims to provide a minimally destructive protocol to evaluate the compressive and tensile properties of human soft tissues. As examples of this technique, the tensile testing of skin and the compressive testing of cartilage are described. These protocols can also be directly applied to synthetic materials to ensure that the mechanical properties are similar to the native tissue. Protocols to assess the mechanical properties of human native tissue will allow a benchmark by which to create suitable tissue-engineered substitutes.

Tissue biomechanics is important for maintaining cell shape and function and for determining phenotype. This report demonstrates non-destructive mechanical protocols for characterizing elastic and viscoelastic properties of human soft tissues, which can be directly applied to tissue-engineered substrates to allow a close matching of engineered materials to native tissue.

Biomechanische Charakterisierung humaner Weichgewebeproben mit Einrückungen und Zugprüfung

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Nachweis von Endotoxin im Nano-Rezepturen mit Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Use of Micro X-ray Computed Tomography with Phosphotungstic Acid Preparation to Visualize Human Fibromuscular Tissue

Manual dissection and histological observation are common methods used to investigate human tissues. However, manual dissection can damage delicate structures&#160;while processing and histological observation provide limited information through cross-sectional imaging. Micro X-ray computed tomography (microCT) is an effective tool for obtaining three-dimensional information without damaging specimens. However, it shows limited efficiency in differentiating soft tissue parts. Use of contrast-enhancing agents, like phosphotungstic acid (PTA), can solve this problem by improving soft tissue contrast. We implemented microCT with PTA to investigate the human orbicularis retaining ligament (ORL), which is a delicate structure in the orbit area. In this method, harvested specimens are fixed in formalin, dehydrated in serial ethanol solutions, and stained with a PTA solution. After staining, microCT scanning, 3D reconstruction, and analysis are performed. Skin, ligaments, and muscles can be clearly visualized using this method. The specimen size and duration of staining are essential features of the method. The suitable specimen thickness was about 5&#8211;7 mm, above which the process was slowed, and the optimum duration was 5&#8211;7 days, below which an empty hole in the central area occasionally occurred. To maintain the location and direction of small pieces during cutting, sewing on the same region of each part is recommended. Furthermore, preliminary analyses of the anatomical structure are needed to correctly identify each piece. Parafilm can be used to prevent drying, but care should be taken to prevent specimen distortion. Our multidirectional observation showed that the ORL is composed of a multilayered meshwork of continuous plates, rather than thread-like fibers, as reported previously. These results suggest that microCT scanning with PTA is useful for examining specific compartments within complex structures of human tissue. It may be helpful in the analyses of cancer tissues, nerve tissues, and various organs, like the heart and liver.

Micro X-ray computed tomography is effective in obtaining three-dimensional information from undamaged human specimens but has limited success in observing soft tissues. The use of phosphotungstic acid contrast agent can resolve this issue. We implemented this contrast agent to examine human delicate fibromuscular tissues (the orbicularis retaining ligament).

Verwendung von Mikro-Röntgentomographie mit Phosphotungstic Acid Preparation zur Visualisierung von humanem fibromuskulärem Gewebe

Manual dissection and histological observation are common methods used to investigate human tissues. However, manual dissection can damage delicate ...

Four-Dimensional CT Analysis Using Sequential 3D-3D Registration

Four-dimensional computed tomography (4DCT) provides a series of volume data and visualizes joint motions. However, numerical analysis of 4DCT data remains difficult because segmentation in all volumetric frames is time-consuming. We aimed to analyze joint kinematics using a sequential 3D-3D registration technique to provide the kinematics of the moving bone with respect to the fixed bone semiautomatically using 4DCT DICOM data and existing software. Surface data of the source bones are reconstructed from 3DCT. The trimmed surface data are respectively matched with surface data from the first frame in 4DCT. These trimmed surfaces are sequentially matched until the last frame. These processes provide positional information for target bones in all frames of the 4DCT. Once the coordinate systems of the target bones are decided, translation and rotation angles between any two bones can be calculated. This 4DCT analysis offers advantages in kinematic analyses of complex structures such as carpal or tarsal bones. However, fast or large-scale motions cannot be traced because of motion artifacts.

We analyzed joint kinematics from four-dimensional computed tomography data. The sequential 3D-3D registration method semiautomatically provides the kinematics of the moving bone with respect to the subject bone from four-dimensional computed tomography data.

Vierdimensionale CT-Analyse mit sequenzieller 3D-3D-Registrierung

Four-dimensional computed tomography (4DCT) provides a series of volume data and visualizes joint motions. However, numerical analysis of 4DCT data ...

3D Imaging of Soft-Tissue Samples using an X-ray Specific Staining Method and Nanoscopic Computed Tomography

We demonstrate a laboratory-based method combining X-ray microCT and nanoCT with a specific X-ray stain, which targets the cell cytoplasm. The described protocol is easy to apply, fast and suitable for larger soft-tissue samples. The presented methodology enables the characterization of crucial tissue structures in three dimensions and is demonstrated on a whole mouse kidney. The multiscale approach allows to image the entire mouse kidney and supports the selection of further volumes of interest, which are acquired with higher resolutions ranging into the nanometer range. Thereby, soft-tissue morphology with a similar detail level as the corresponding histological light microscopy images is reproduced. Deeper insights into the 3D configuration of tissue structures are achieved without impeding further investigations through histological methods.

A protocol for 3D visualization of microscopic tissue structures by using an X-ray specific staining method designed for X-ray computed tomography is presented.

3D-Bildgebung von Weichgewebeproben mit einer Röntgen-spezifischen Färbemethode und nanoskopischer Computertomographie

We demonstrate a laboratory-based method combining X-ray microCT and nanoCT with a specific X-ray stain, which targets the cell cytoplasm. The described ...

Patient-Specific Polyvinyl Alcohol Phantom Fabrication with Ultrasound and X-Ray Contrast for Brain Tumor Surgery Planning

Phantoms are essential tools for clinical training, surgical planning and the development of novel medical devices. However, it is challenging to create anatomically accurate head phantoms with realistic brain imaging properties because standard fabrication methods are not optimized to replicate any patient-specific anatomical detail and 3D printing materials are not optimized for imaging properties. In order to test and validate a novel navigation system for use during brain tumor surgery, an anatomically accurate phantom with realistic imaging and mechanical properties was required. Therefore, a phantom was developed using real patient data as input and 3D printing of molds to fabricate a patient-specific head phantom comprising the skull, brain and tumor with both ultrasound and X-ray contrast. The phantom also had mechanical properties that allowed the phantom tissue to be manipulated in a similar manner to how human brain tissue is handled during surgery. The phantom was successfully tested during a surgical simulation in a virtual operating room.
The phantom fabrication method uses commercially available materials and is easy to reproduce. The 3D printing files can be readily shared, and the technique can be adapted to encompass many different types of tumor.

This protocol describes the fabrication of a patient specific skull, brain and tumor phantom. It uses 3D printing to create molds, and polyvinyl alcohol (PVA-c) is used as the tissue mimicking material.

Patientenspezifische Polyvinylalkohol-Phantomfertigung mit Ultraschall- und Röntgenkontrast für die Planung von Hirntumorchirurgie

Phantoms are essential tools for clinical training, surgical planning and the development of novel medical devices. However, it is challenging to create ...

Experimental and Data Analysis Workflow for Soft Matter Nanoindentation

Nanoindentation refers to a class of experimental techniques where a micrometric force probe is used to quantify the local mechanical properties of soft biomaterials and cells. This approach has gained a central role in the fields of mechanobiology, biomaterials design&#160;and tissue engineering, to obtain a proper mechanical characterization of soft materials with a resolution comparable to the size of single cells (&#956;m). The most popular strategy to acquire such experimental data is to employ an atomic force microscope (AFM); while this instrument offers an unprecedented resolution in force (down to pN) and space (sub-nm), its usability is often limited by its complexity that prevents routine measurements of integral indicators of mechanical properties, such as Young&#39;s Modulus (E). A new generation of nanoindenters, such as those based on optical fiber sensing technology, has recently gained popularity for its ease of integration while allowing to apply sub-nN forces with &#181;m spatial resolution, therefore being suitable to probe local mechanical properties of hydrogels and cells.
In this protocol, a step-by-step guide detailing the experimental procedure to acquire nanoindentation data on hydrogels and cells using a commercially available ferrule-top optical fiber sensing nanoindenter is presented. Whereas some steps are specific to the instrument used herein, the proposed protocol can be taken as a guide for other nanoindentation devices, granted some steps are adapted according to the manufacturer&#39;s guidelines. Further, a new open-source Python software equipped with a user-friendly graphical user interface for the analysis of nanoindentation data is presented, which allows for screening of incorrectly acquired curves, data filtering, computation of the contact point through different numerical procedures, the conventional computation of E, as well as a more advanced analysis particularly suited for single-cell nanoindentation data.

The protocol presents a complete workflow for soft material nanoindentation experiments, including hydrogels and cells. First, the experimental steps to acquire force spectroscopy data are detailed; then, the analysis of such data is detailed through a newly developed open-source Python software, which is free to download from GitHub.

Experimenteller und Datenanalyse-Workflow für die Nanoindentation weicher Materie

Nanoindentation refers to a class of experimental techniques where a micrometric force probe is used to quantify the local mechanical properties of soft ...

Viscoelastic Characterization of Soft Tissue-Mimicking Gelatin Phantoms using Indentation and Magnetic Resonance Elastography

Characterization of biomechanical properties of soft biological tissues is important to understand the tissue mechanics and explore the biomechanics-related mechanisms of disease, injury, and development. The mechanical testing method is the most straightforward way for tissue characterization and is considered as verification for in vivo measurement. Among the many ex vivo mechanical testing techniques, the indentation test provides a reliable way, especially for samples that are small, hard to fix, and viscoelastic such as brain tissue. Magnetic resonance elastography (MRE) is a clinically used method to measure the biomechanical properties of soft tissues. Based on shear wave propagation in soft tissues recorded using MRE, viscoelastic properties of soft tissues can be estimated in vivo based on wave equation. Here, the viscoelastic properties of gelatin phantoms with two different concentrations were measured by MRE and indentation. The protocols of phantom fabrication, testing, and modulus estimation have been presented.

This article presents a demonstration and summary of protocols of making gelatin phantoms that mimic soft tissues, and the corresponding viscoelastic characterization using indentation and magnetic resonance elastography.