Die Rasterkraftmikroskopie oder AFM-Cantilever-basierte Nanoindentation kann verwendet werden, um die nanoskaligen mechanischen Eigenschaften von Materialien mit einem Modulbereich von Kilopascal bis Gigapascal sowohl in Luft als auch in Flüssigkeit zu bestimmen. Die Freikörper-basierte Nanoindentation ermöglicht eine kolokalisierte topographische Bildgebung und quantitative In-situ-Messungen mechanischer Eigenschaften mit nanoskaliger Präzision und Auflösung auf einer Vielzahl von Materialien und relevanten Umgebungen. Mit Hilfe der freitragenden Nanoindentation auf AFM-Basis kann zwischen gesunden und kranken Strukturen, Geweben oder Zellen unterschieden werden, die unterschiedliche mechanische Eigenschaften aufweisen.
Die genaue Bestimmung der Kontaktfläche und der Kraft, die während der Cantilever-basierten Nanoindentation ausgeübt wird, erfordert eine sorgfältige Kalibrierung der AFM-Sonde, die eine Herausforderung darstellt, aber für quantitative Messungen der mechanischen Eigenschaften im Nanobereich unerlässlich ist. Wählen Sie zunächst eine geeignete Rasterkraftmikroskopie- oder AFM-Sonde für die Nanoindentation der gewünschten Probe basierend auf dem Medium, dem erwarteten Modul, der Probentopographie und den relevanten Strukturgrößen aus. Setzen Sie die Sonde auf die Sondenhalterung und befestigen Sie die Sondenhalterung am AFM-Scankopf.
Wählen Sie in der AFM-Software einen geeigneten Nanoindentationsmodus aus, der dem Benutzer die Kontrolle über einzelne Rampen ermöglicht. Richten Sie den Laser auf der Rückseite des Sonden-Cantilevers gegenüber der Position der Sondenspitze und in den positionsempfindlichen Detektor (PSD) aus. Zentrieren Sie den Laserstrahlpunkt auf der Rückseite des Cantilevers, indem Sie die Summenspannung maximieren.
Zentrieren Sie als Nächstes den reflektierten Laserstrahlpunkt auf dem PSD, indem Sie die vertikalen und horizontalen Ablenksignale so einstellen, dass sie so nahe wie möglich an Null liegen, wodurch der maximal erfassbare Ablenkbereich für die Erzeugung einer Ausgangsspannung bereitgestellt wird, die proportional zur Cantilever-Ablenkung ist. Kalibrieren Sie die Durchbiegungsempfindlichkeit (Deflection Sensitivität, DS) des Sonden-AFM-Systems. Richten Sie dazu DS-Kalibrierungseindrücke auf Saphir ein und führen Sie sie durch, um ungefähr die gleiche Sondenauslenkung wie die geplanten Probeneindrücke zu erreichen, da die gemessene Verschiebung eine Funktion des Ablenkwinkels der Spitze ist und bei großen Auslenkungen nichtlinear wird.
Wiederholen Sie die Rampe fünfmal. Bestimmen Sie die DS in Nanometern pro Volt oder die inverse Empfindlichkeit des optischen Hebels und die Volt pro Nanometer aus der Steigung des linearen Teils des Kontaktbereichs nach dem ersten Kontaktpunkt in der resultierenden Kraftverschiebungskurve (FD). Verwenden Sie den Mittelwert der Werte, um eine maximale Genauigkeit zu erzielen.
Wenn die relative Standardabweichung 1 % überschreitet, messen Sie den DS erneut, da die ersten FD-Kurven aufgrund der anfänglichen Einführung von Haftkräften manchmal nicht ideal sind. Wenn die Federkonstante K des Sondenauslegers werkseitig nicht kalibriert ist, kalibrieren Sie die Federkonstante. Wenn die Sonde nicht über eine werkseitig kalibrierte Spitzenradiusmessung verfügt, messen Sie den effektiven Spitzenradius R.Wenn Sie die Blindspitzenrekonstruktionsmethode verwenden, bilden Sie die Spitzencharakterisierung oder die Rauheitsprobe mit einer langsamen Abtastrate und hohen Rückkopplungsgewinnen ab, um die Verfolgung der sehr scharfen Merkmale zu optimieren.
Wählen Sie eine Bildgröße und Pixeldichte basierend auf dem erwarteten Spitzenradius. Verwenden Sie als Nächstes die AFM-Bildanalysesoftware, um die Sondenspitze zu modellieren und ihren Endradius und effektiven Spitzendurchmesser bei der erwarteten Probeneindrucktiefe abzuschätzen. Geben Sie nach Abschluss der Sondenkalibrierung die DS-, K- und R-Werte in die Software ein.
Geben Sie abschließend eine Schätzung des Poisson-Verhältnisses der Probe ein, um den gemessenen reduzierten Modul in den tatsächlichen Probenmodul umzurechnen. Bei Verwendung eines konischen oder konosphärischen Kontaktmechanikmodells, das auf der Spitzenform und der Eindrucktiefe basiert, ist die Eingabe des Spitzenhalbwinkels erforderlich. Navigieren Sie durch die Probe unter dem AFM-Kopf und greifen Sie auf den gewünschten Bereich von Interesse ein.
Überwachen Sie das vertikale Ablenksignal oder führen Sie eine kleine erste Rampe durch, um zu überprüfen, ob sich Spitze und Probe berühren. Passen Sie die Position des AFM-Kopfes leicht nach oben an und fahren Sie erneut. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die Spitze und die Probe keinen Kontakt mehr haben, was durch eine nahezu flache Rampe und eine minimale vertikale Auslenkung des Cantilevers belegt wird.
Sobald keine offensichtliche Wechselwirkung zwischen der Spitze der Probe vorhanden ist, senken Sie den AFM-Kopf um einen Betrag ab, der etwa 50 % der Rampengröße entspricht, um sicherzustellen, dass die Sondenspitze beim manuellen Bewegen des AFM-Kopfes nicht gegen die Probe stößt. Wiederholen Sie die Rampe erneut, bis eine gute Kurve beobachtet wird. Passen Sie die Rampenparameter an.
Wählen Sie je nach Probe und gewünschter Eindringtiefe eine geeignete Rampengröße. Wählen Sie dann eine geeignete Rampenrate aus. Ein Hertz ist ein guter Ausgangspunkt für die meisten Proben.
Stellen Sie die Anzahl der Samples pro Rampe ein, um die gewünschte Auflösung der Messung zu erreichen. Stellen Sie die X-Drehung ein, um die Scherkräfte auf die Probe und die Spitze zu reduzieren, indem Sie die Sonde gleichzeitig leicht in X-Richtung bewegen, während sie in Z-Richtung einrückt. Verwenden Sie für die X-Drehung einen Wert, der dem Versatzwinkel des Sondenhalters relativ zur Oberflächennormalen entspricht.
Wählen Sie als Nächstes aus, ob eine ausgelöste oder nicht ausgelöste Rampe verwendet werden soll. Wenn eine getriggerte Rampe ausgewählt wird, legen Sie den Trigger-Schwellenwert so fest, dass die gewünschte Einkerbung in das Sample erzielt wird. Führen Sie einen Einzug an der ausgewählten Stelle durch.
Wählen Sie die zu analysierenden Daten aus und laden Sie sie in die Software. Geben Sie kalibrierte Werte für die Federkonstante, DS oder inverse optische Hebelempfindlichkeit und den Radius der Sondenspitze ein, zusammen mit einer Schätzung für das Poisson-Verhältnis der Probe. Wählen Sie ein Modell mit Nanoindentationskontaktmechanik, das für die Spitze und die Probe geeignet ist.
Führen Sie den Anpassungsalgorithmus aus. Prüfen Sie, ob die FD-Kurven richtig passen. Ein kleiner Restfehler, der einem durchschnittlichen R-Quadrat nahe Eins entspricht, weist auf eine gute Anpassung an das gewählte Modell hin.
Falls gewünscht, können Sie einzelne Kurven stichprobenartig überprüfen, um die Kurve, die Modellanpassung und die berechneten Kontaktpunkte visuell zu überprüfen. Es werden nahezu ideale FD-Kurven gezeigt, die in der Luft an einer in Harz eingebetteten Loblolly-Kiefernprobe und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung an einem mesenchymalen Stammzellkern erhalten wurden. Bei der Siliziumsonde erfuhr die Spitze während der gesamten Bildgebung einen erheblichen Verschleiß im Vergleich zu ihrem ursprünglichen makellosen Zustand.
Mit jedem weiteren Bild wird die Spitze immer runder. Im Gegensatz zur Diamantsonde veränderte sich der Spitzenradius nicht innerhalb der Grenzen der Blindspitzenrekonstruktionsmethode, was die extreme Verschleißfestigkeit des Diamanten unterstreicht. Ein AFM-Topographiebild, das mehrere Zellen abdeckt, mit einer Pseudo-3D-Darstellung und einer entsprechenden Modulkarte einer Loblolly-Kiefernprobe ist hier dargestellt.
Die AFM-abgeleitete Modulkarte, die während der Aufnahme eines AFM-Bildes erstellt wurde, zeigt, dass der Mineraleinschluss in der Bildmitte deutlich härter ist als die umgebende organische Matrix. Der Einfluss des Radius und der Form der Sondenspitze auf das Erscheinungsbild von Merkmalen mit hohem Aspektverhältnis einer Bakken-Schieferprobe wird gezeigt. Cantilever-basierte Nanoindentation auf mesenchymalen Stammzellen und isolierten Zellkernen zeigte keinen statistischen Unterschied im Elastizitätsmodul.
Die Morphologie und die mechanischen Eigenschaften von cholesterinhaltigen Lipiddoppelschichten, die von AFM untersucht wurden, werden hier demonstriert. Die richtige Sondenkalibrierung und die Auswahl geeigneter Rampenparameter in Modellen der Kontaktmechanik sind für genaue nanomechanische Messungen unerlässlich. Neben elastischen modularen Messungen kann die AFM-Cantilever-basierte Nanoindentation verwendet werden, um die Bruchfestigkeit oder Durchbruchkraft von Phospholipid-Doppelschichten unter physiologisch relevanten Bedingungen zu untersuchen.
Die auf AFM basierende Cantilever-basierte Nanoindentation hat es ermöglicht, die Auswirkungen von strukturellen Knockouts, pharmazeutischen Behandlungen und Vibrationen geringer Intensität zu untersuchen, um das Training auf die mechanischen Eigenschaften von mesenchymalen Stammzellkernen zu simulieren.
