1. Standard Operating Protocol 1.1 Einstellungen und Probenvorbereitung <ol><li> Schließen Sie das Gerät an einen Computer mit dem Izon Control Suite-Software installiert. </li><li> Wählen Sie die Nanoporengröße zu verwenden: für die Größe und Konzentrationsmessung von Elektrofahrzeugen ein NP150 (Zielgrößenbereich von 85 bis 300 nm) oder NP200 (Zielgröße Bereich 100 - 400 nm) werden am häufigsten verwendet. Beim Arbeiten mit Elektrofahrzeugen, die isoliert wurden, unter Verwendung eines Protokolls, das die Entfernung von größeren EVs beispielsweise beinhaltet, indem die Probe durch einen 220 nm-Filter, ein Poren NP100 (Zielgrößenbereich von 70 bis 200 nm) verwendet werden. Beim Arbeiten mit Elektrofahrzeugen in einer biologischen Probe oder EVs isoliert mit einem anderen Protokoll kann die NP200 verwendet werden, da es weniger häufig verstopft. Andere Nanoporen wie der NP300 (Zielgrößenbereich von 150 bis 600 nm) oder der NP400 (Zielgröße 200 - 800 nm) oder sogar größer Nanoporen, für größere Arten von Elektrofahrzeugen verwendet werden. </li><li> Wählen Sie die Polystyrol-Abgleichation Teilchen, die im Schritt 1.1.2 ausgewählt Nanopore ergänzen. Für eine NP100, NP150 und NP200 Nanopore verwenden Sie die CPC100, CP100 und CPC200 Partikel auf. Für eine genaue Größenabschätzung, sicherzustellen, dass die Kalibrierung Partikel haben eine ähnliche Größe wie die unbekannten Teilchen. </li><li> Um eine gute Homogenität der Kalibrierungspartikeln Wirbel kurz (30 Sekunden) zu gewährleisten. Optional gelten Beschallung, um Aggregate zu entfernen. </li><li> Verdünne die Eichpartikel in PBS auf die Zielkonzentration in einem Volumen von mindestens 40 ul. Hinweis: Die Zielkonzentration variiert in Abhängigkeit von dem in Schritt 1.1.2 ausgewählt Nanopore basiert. Zielkonzentrationen sind mit den Nanoporen geliefert. </li><li> Anzuwenden und direkt entfernen 78 ul PBS auf der unteren Flüssigkeitszelle; Diese Benetzung der unteren Fluidkammer verringert die Gefahr von Luftblasenbildung unter der Nanopore, wenn die Anwendung eines Elektrolyten auf der unteren Fluidkammer, wenn der Nanopore in Position ist. </li><li> Platzieren Sie die Nanopore auf die Arme 4 des Instruments. Verwendungdie digitale Messschieber, um den Abstand zwischen zwei gegenüberliegenden Armen messen, und geben Sie den Abstand in mm in den &quot;Stretch&quot; Eingabefeld ein und klicken Sie auf &quot;Kalibrieren strecken&quot;, um die Nanoporen-Strecke zu kalibrieren. </li><li> Strecken die Nanopore 47 mm, durch Drehen der Seitenscheibe und somit der Abstand zwischen den gegenüberliegenden Armen des Gerätes, bevor Sie das 78 ul PBS in der unteren Fluidzelle. Hinweis: Elektrische Störungen können die Qualität der Messungen wesentlich beeinflussen. Bei Verwendung eines Laptops, um die Izon Control Suite Software ausführen, stellen Sie sicher, dass der Laptop an das Stromnetz mit einer geerdeten Steckdose und Stecker. Mobiltelefon gehalten wird nahe dem Instrument kann auch eine Quelle für elektrische Störungen sein. Elektrische Störungen als ständig wiederholt Spitzen in der Baseline-Strom beobachtet, oft mit Root Mean Square (RMS) Lärm&gt; 10 pA. Hinweis: Fast alle Puffer kann verwendet werden, um die Kalibrierung Teilchen und EVs für trpS CHARAKTERI verdünnenrung. Die Anwesenheit von Salzen ist eine Voraussetzung für die Errichtung eines elektrischen Stroms. EV-Messungen verwenden PBS als Puffer. Kalibrierung Partikel sollten immer in dem gleichen Puffer verdünnt werden, da die Elektrofahrzeuge, um genaue Messungen zu gewährleisten. </li></ol> 1.2. Bestimmen Sie die optimalen Einstellungen für Mess Hinweis: Vor der Aufnahme ist es wichtig, eine optimale Messeinstellungen festzulegen. Die Blockade Größenordnung von einem Teilchen, das durch die Nanopore verursacht ist abhängig von der aufgebrachten Dehnung und der angelegten Spannung. Für zuverlässige Messungen sollte der RMS-Rauschen 0,1 nA &lt;10 pA und der Modus Blockade Größenordnung sollte&gt;. <ol><li> Legen Sie den oberen Flüssigkeitszelle und Schutzkäfig auf der Nanoporen-und einzuführen 40 ul verdünnt Kalibrierung Teilchen in der oberen Flüssigkeitszelle. Verwenden Sie die VPM zu ≥0.8 kPa Überdruck anzuwenden. </li><li> Reduzieren Sie die aufgebrachte Dehnung langsam in Richtung 44 mm, während die Analyse der Ereignisse Blockade durch die Kalibrierung verursachtPartikel. Hinweis: Wenn man den Porendurchmesser die Bewegung von Partikeln durch die Nanopore wird weniger wahrscheinlich, und somit die Partikelgeschwindigkeit abnehmen. Jedoch aufgrund der erhöhten relativen Blockade der Poren einen größeren Blockade Ereignis eintreten wird, was zu verbesserten Signal-zu-Rausch-Verhältnis. Erhöhung der Spannung kann weiter die Blockade Größenordnung zu erhöhen, sondern können auch die RMS-Rauschen zu erhöhen. </li><li> Reduzieren Sie die Strecke, bis geeignete Blockade Ereignisse (Abbildung 1c) werden im Bedienfeld &quot;Signal Trace&quot; beobachtet. (Modus&gt; 0,1 nA) und die entsprechende Partikelrate&gt; 100 / min. Anmerkung: Die Partikelgeschwindigkeit eine weniger strenge abgeschnittenen jedoch als Messungen von mindestens 500 Teilchen eignen, werden Partikelgeschwindigkeiten von &lt;100 / min führen Aufzeichnungsdauer von mindestens 5 min. Partikelraten über 2.000 / min in weniger genaue Messungen ergeben (wenn vorhanden, sollte die Probenverdünnung durchgeführt werden). </li></ol> 1.3 Messung der KalibrierungPartikel, Waschen der Uper Fluidzelle und Probenmessung <ol><li> In diesem Abschnitt EVs aus dem Zellkulturüberstand des Glioblastoma multiforme Zelllinie U87-MG / EGFRvIII sind gekennzeichnet. Die Isolierung und Herstellung dieser EVs wurde zuvor beschrieben und visualisiert 18. </li><li> Legen die Eichpartikel in der oberen Fluidzelle. Druck ausüben (zum Beispiel 0,8 kPa) unter Verwendung des VPM und Rekord&gt; 500 Partikel. </li><li> Bei Durchführung einer Multi-Druckmessung, erhöhen Sie den Druck (zum Beispiel auf 1,0 kPa) und nehmen Sie eine zweite Kalibrierungsdatei. Anmerkung: Ein Minimum von 0,2 kPa Differenz erforderlich. </li><li> Entfernen Sie die Eichstichprobe aus der oberen Flüssigkeitszelle. Waschen Sie die obere Fluidkammer 3 mal mit 100 ul PBS, um Restpartikel zu entfernen. Vor der Einführung der Probe in der oberen Flüssigkeitszelle, verwenden fusselfreien Tuch, um restliche PBS von der oberen Flüssigkeitszelle zu entfernen. </li><li> Einführung der Probe in den oberen Fluidzelle. Sicherzustellen, dass die Ausgangsstrom innerhalb 3% beobachtet bei der Messung der Eichpartikel Ausgangsstrom. Wenn nicht innerhalb von 3%, gelten die unten beschrieben, um die Basislinienstrom stabilisieren Strategie. Übernehmen Sie die genaue Druck, um den Eichpartikel aufgebracht und notieren Sie die Beispieldateien. Hinweis: Die Partikelrate Grundstück sollte konstant Partikeldetektion (Abbildung 2a) anzuzeigen. Im Fall einer plötzlichen Unterbrechung der Partikelerkennung, einem plötzlichen Abfall des Ausgangsstroms oder eine plötzliche Zunahme der RMS-Rauschen kann die Poren verstopft werden; damit die Aufzeichnung unterbrochen werden. Um die Grundlinie, tippen Sie auf Wiederherstellung oder verdrehen die Schirmkappe, gelten den Kolben oder vollständig zu entfernen die Nanoporen und waschen Sie es mit VE-Wasser und ersetzen Sie es auf dem Instrument. Hinweis: Alternativ erhöhen die Nanopore Strecke bis 47 mm in Kombination mit maximalen Druck von der VPM für etwa 5 min. </li></ol> 1.4 Datenanalyse <ol><li> Klicken Sie auf &quot;; Registerkarte Analysieren von Daten &quot;, um den Analyseteil der Software geben. Verarbeiten die Kalibrierung und Beispieldateien mit der rechten Maustaste auf das &quot;Unverarbeitete Dateien&quot; und wählen Sie &quot;Dateien verarbeiten&quot;. </li><li> Klicken Sie auf das Kontrollkästchen neben der Probe in der Spalte &quot;kalibrierte&quot; zu koppeln, die Beispieldateien auf der Eichaufnahmen. Wählen entsprechenden Probe und Kalibrierungsdateien und klicken Sie auf &quot;OK&quot;. Hinweis: Wenn Sie die Option Multi-Druckkalibrierung wählen Sie die &quot;Multi-Druck Kalibrierung&quot; Registerkarte auf der linken Seite zu koppeln mehrere Proben auf mehrere Kalibrierungsdateien. </li><li> Einmal erfolgreich gekoppelt, wird der Izon Control Suite Software verschiedene Proben Eigenschaften wie Größenverteilung zeigen (Abbildung 2b), Baseline-Laufzeiten, Halbwertsbreite (FWHM) und eine Konzentrationsanalyse. Optional: Für jede Probe, einzelne Datenpunkte können exportiert werden als kommagetrennte Datei. </li></ol> 2.lternative Protocol - Spick Proben mit Kalibrierungskügelchen Hinweis: In der Regel können die Standard-Betriebsverfahren bei der Arbeit mit isolierten Elektrofahrzeugen verwendet werden. Bei der Arbeit mit nicht-isolierten Elektrofahrzeuge in biologischen Proben, oder isoliert EV Vorbereitungen mit großen Proteinaggregaten kontaminiert ist, mit dem Instrument kann eine Herausforderung sein. Diese Herausforderungen bestehen vor allem aus einer hohen Rate von Nanoporen-Sperrung (plötzlicher Abfall der Ausgangsstrom), die Unfähigkeit, Baseline-Ströme innerhalb von 3% der Kalibrierungsmessung oder signifikante Unterschiede in der Partikelraten zwischen identischen Proben (Abbildung 3a) erholen. Für Proben, die Anzeige dieser Schwierigkeiten ein alternatives Protokoll zu quantifizieren wurde EVs 17 entwickelt. Diese Methodik beruht auf der Einführung von größeren Polystyrol-Kalibrierung Perlen in der Probe von Interesse (Bild 3b). Ein detailliertes Verfahren für diese alternative Protokoll wird unten diskutiert. 2.1. ProbeVorbereitung Hinweis: Bei der Herstellung von Proben mit der alternativen Methode, ist es wünschenswert, einen EV-zu-Wulst-Verhältnis von rund 1. Auch zu etablieren, ist es wichtig, eine &quot;Perle der Kalibrierung nur&quot; umfassen Probe, um eine genaue &quot;Gating&quot; der erlauben Kalibrierungsperlen und die Anzahl der Hintergrundpartikel (zB Proteinaggregate) im Puffer vorhanden bestimmen. <ol><li> Zentrifuge 100 ul Zellkulturüberstand für 7 min bei 300 xg </li><li> Fügen Sie 20 ul der Überstand auf 20 ul PBS und 10 ul 75 fach verdünnt 335 nm Polystyrol-Kügelchen (Aktien 7E10 / ml). </li></ol> 2.2. Probenmessung <ol><li> Verwenden Sie die in Abschnitt 1.2 beschriebene Strategie, um die optimalen Geräteeinstellungen zu bestimmen. </li><li> Messen Sie den &#39;Kalibrationsbeadsets nur &quot;Probe zuerst. Sicherzustellen, dass die Hintergrunderkennung von kleinen nicht-Bead-Partikel so niedrig wie möglich ist (&lt;10% der Kügelchen). </li><li> Messen Sie jeden einzelnen sample einmal vor der Aufnahme repliziert, um Schwankungen in Nanoporen-Bedingungen gleich auf die verschiedenen Proben zu verteilen. Messung mindestens 3 Wiederholungsversuche für jede Probe. </li><li> Wiederholen Sie die &#39;Perle der Kalibrierung nur &quot;Probe nach Beendigung der Aufnahme aller Proben. </li></ol> 2.3. Datenanalyse Hinweis: Bei Verwendung der alternativen Protokoll, hat die exklusive Nutzung des Izon Control Suite Software, die nicht für die Berechnung der Konzentration ausreichen. Zusätzliche Tabellenkalkulationssoftware erforderlich ist. Tabelle 1 zeigt ein Beispiel für die Berechnung der Konzentration der in 3 dargestellten Muster. <ol><li> Öffnen Sie die &quot;Perle Kalibrierung nur&quot; Probe und ein oder mehrere Beispieldateien. </li><li> Bestimmen Sie, welche Blockade Ereignisgröße (in nA) als Cut-off für EVs und Unterscheidung zwischen Polystyrolkügelchen verwendet werden kann. Bestimmung der Blockade Wert (NA) entsprechend dem linken Fuß des Polystyrolkügelchen Population ( <strong&gt; Abbildung 3b). Hinweis: die Gleich Einstellung der bin-Größen aller Messungen (in &#39;ViewSettings &quot;, die durch Klicken auf die&quot; Pop-up &quot;Button&quot; Individuelle Blockade Trace &quot;zugegriffen wird, eingestellt werden). </li><li> Rufen Sie die Werte der Gesamtpartikelzahl für jede Probe, indem Sie auf das &quot;Particle Analysis Summary&quot; Reiter der Probe. </li><li> Filtern Sie die Datensätze mit Hilfe der Cut-Off-Wert in Schritt 2.3.2 bestimmt. durch die Auswahl der &quot;Datenfilterung&quot; Pop-up. Display nur Partikel kleiner als die cut-off. </li><li> Rufen Sie die Werte der EV Zahl für jede Probe aus der &quot;Particle Analysis Summary&quot;. </li><li> Subtrahieren der Menge an Elektrofahrzeugen aus der gesamten Teilchen, die Menge von Kalibrierungsperlen zu bestimmen. </li><li> Bestimmen Sie die EV-zu-Wulst-Verhältnis durch Division EV Zahl durch Kalibrationsbeadsets Zahl. </li><li> Bestimmen Sie die durchschnittliche Hintergrundverhältnis durch Mittelung der Verhältnisse für jede &amp; bestimmt# 8220; Wulst nur &quot;Eichprobe. Ziehen Sie diesen Wert aus jeder einzelnen Probe. </li><li> Multiplizieren Sie die eingestellte EV-zu-Wulst-Verhältnis durch die Konzentration der Kalibrierung Perlen, um die Konzentration von Elektrofahrzeugen für jede Probe zu bestimmen. </li><li> Multiplizieren Sie die Konzentration in Schritt 2.3.9 von der durch die Zugabe von Kalibrierungsperlen auf die Probe eingeführt EV EV Verdünnungsfaktor gefunden. Hinweis: Im Beispiel Probe-Setup, die Gesamt Verdünnung der Probe in PBS und Kalibrierung Perlen ist 2,5-mal und damit die Konzentration in Schritt 2.3.9 wurde, sollten von 2,5 multipliziert, um die Roh-EV Probenkonzentration zu bestimmen. </li><li> Statistiken berechnen, wie die Durchschnittswerte, Standardabweichung und der Standardfehler des Mittelwerts für jede Gruppe von Wiederholungen. Hinweis: In einigen Fällen überlappen zwischen EVs und Stachel Polystyrol-Kügelchen beobachtet. Wenn die Korrektur für die Unterschätzung der EV Konzentration, die erforderlich ist, sollten die Proben ohne Stachel Polystyrol-Kügelchen gemessen werden. Verwenden Sie die gleiche Schneidab, wie in Schritt 2.3.2 entschlossen, einen &quot;Wulst zu EV&quot;-Verhältnis zu bestimmen, um das Verhältnis von Elektrofahrzeugen, die im Bereich der Stachel Polystyrol-Kügelchen fallen zu berechnen. Dieser Wulst-zu-EV-Verhältnis sollte dem EV-zu-Kügelchen-Verhältnis in Schritt 2.3.8 bestimmt zugesetzt werden. </li></ol> 2.4. Optional: EV Größe Verteilung über die alternative Methode. <ol><li> Zweimal öffnen Sie eine Sample-Aufnahme in der Control Suite-Software. </li><li> Stellen Sie die Filtermöglichkeiten von einer der Proben nur aus Teilchen größer als der Cut-off-oben bestimmt. Dies wird die Kalibrierung Partikel nur anzuzeigen. </li><li> Stellen Sie die filtrierte Probe zu &quot;Kalibrierungsdatei&quot; und geben Sie den Modus Größe der Kalibrierung Perlen. </li><li> Koppeln die Beispieldatei und die &quot;Kalibrierung&quot; in Schritt 2.4.3 erstellt, wie in 1.4.2 beschrieben. Die Beispieldatei zeigt nun eine Größenverteilung von beiden EVs und Kalibrierung Perlen auf der Basis der Stachel Kalibrierung Perlen. Hinweis: Die Standard-Operting-Protokoll wird meist genügen für die Bestimmung der Größe-Distributionen von Elektrofahrzeugen. Manchmal jedoch sind exakte Pufferkomponenten unbekannt (zum Beispiel in Plasma oder Urin), die es unmöglich ist, eine Probe der Kalibrierung Perlen in dem gleichen Puffer wie die Elektrofahrzeuge von Interesse vorzubereiten macht. Für EV Größe Schätzung in diesen besonderen Bedingungen kann eine EV Probe mit Partikeln versetzt Kalibrierung verwendet werden. </li></ol>

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Die Entwicklung der skizzierten Protokoll und das Schreiben des Manuskripts wurde finanziell unterstützt, zum Teil, von der niederländischen Gehirn-Stiftung, Schumacher Kramer-Stiftung, und Bohnenn Fund. Produktion von diesem Video-Artikel wurde teilweise durch Izon sponsorted.

Die in diesem Angebot Manuskript Methoden zur Quantifizierung und Charakterisierung von Größe EVs mit trpS beschriebenen Protokollen. Die wichtigsten Vorteile der trpS Plattform sind die geringen Stichprobengröße relativ kurze Messdauer und das Fehlen der erforderlichen Probenmanipulation. Voraussetzung für eine genaue Messung ist trpS gleichen Bedingungen zwischen Kalibrierung und Probenmessungen zu halten. Dies umfasst die Verwendung von identischen Puffern sowie identische Geräteeinstellungen, wie beispielsweise Nanoporengröße, Spannung und Druck aufgebracht. Die ursprüngliche VPM fehlt ein Mechanismus für die exakte Einstellung der aufgebrachte Druck, wodurch kleine Unterschiede in der angewandten Druck zwischen den Proben verursacht. Außerdem kann die Verdampfung der Flüssigkeit in der Grundierung VPM geringe Druckdifferenzen zu induzieren, wenn die Messung zu unterschiedlichen Zeitpunkten und das VPM daher oft neu grundiert werden. Diese Einschränkungen haben möglicherweise durch die Einführung des VPM2, gelöst worden, diehat einen Klick-basierte Skalierung und Luftdruck. Die in diesem Manuskript beschrieben alternatives Protokoll ist besonders geeignet für die Messung von EVs in nicht gereinigten biologischen Proben 17. Wir glauben, daß Pufferkomponenten, wie beispielsweise Zucker, Lipide, Proteine ​​und andere Grobschmutz kann in einigen Fällen die Messbedingungen zu viel für das Standardprotokoll beeinflussen anwendbar. Neben der Kalibrierung Perlen auf die Probe und nicht den Vergleich von zwei separaten Messungen führt &quot;Echtzeit-Kalibrierung &#39;. Dieses Verfahren eignet sich insbesondere bei einem Vergleich Proben (zB Blutplasma von verschiedenen Spendern), die verschiedene und / oder unbekannten Fluidhintergrundgehalte haben. Obwohl die Unterschiede zwischen Elektrofahrzeugen und Polystyrol-Partikel (zB Partikeldichte und Oberflächenladung), theoretische Modelle als auch experimentelle Daten vorhanden sind unterstreichen die Benutzerfreundlichkeit von Polystyrol-Kügelchen für die Quantifizierung und Größe Profilierung von Elektrofahrzeugen,unter der Voraussetzung, dass erhebliche Druck ausgeübt wird, 15,19. Um den Einfluss von elektrokinetische Kräfte zu minimieren, ist die Nutzung der relativ größeren NP150 / NP200 Nanoporen und signifikant positiven Druck geraten. EVs und Kalibrierung Perlen werden nach Größe unterschieden. Folglich hat der Nanopore durch Anlegen Strecke bis zu einem Durchmesser, bei dem Nachweis beider EVs und die größeren Partikel Kalibrierung beobachtet geöffnet werden. Seit der Eröffnung des Poren wird die Empfindlichkeit in Richtung kleinerer Partikel zu verringern, EVS nur größer als eine bestimmte Größe aufgezeichnet (oft EVs&gt; 120 nm bei Verwendung eines 335 nm Kalibrationsbeadsets). Die Nachweisgrenze für Elektrofahrzeuge auf etwa 90 nm verringert werden kann, mit 203 nm Kalibrierung Perlen auf einer NP150 Nanoporen. Dies kann jedoch nicht lebensfähig sein, wenn Setup größeren EVs induzieren häufige Verstopfung der Nanoporen. Das Vorhandensein dieser Behinderung EVs kann die Verwendung einer Einrichtung zwingen, wenn eine Population von EVs, zu klein, um reach die Detektionsschwelle, werden nicht erkannt. Die Schwierigkeit für den Betrieb des Systems erhöht sich, wenn versucht wird, die kleiner als 100 nm Größe zu messen. In solchen Fällen kann der Nachweis durch Erhöhung der Salzkonzentration des Elektrolyten verbessert werden. Eine erhöhte Ionenkonzentration relativ erhöht Blockade Grßen für kleine Teilchen (größeres Signal-zu-Rausch-Verhältnis) zu induzieren. Die Lebensfähigkeit dieser Technik für Messungen von Elektrofahrzeugen muss aber überprüft werden, da erhöhte Salzkonzentrationen kann die Lautstärke von Elektrofahrzeugen beeinflussen. Abschließend kann trpS Plattform für den direkten Quantifizierung und Charakterisierung von Elektrofahrzeugen Größe verwendet werden. Da keine Isolation oder EV Manipulation (Antikörper-Bindungs ​​oder Fluoreszenzmarkierung) erforderlich ist, ist die Plattform für die direkte Quantifizierung EV in biologischen Flüssigkeiten. Eine alternative Protokoll vorgesehen ist, die vorteilhaft für Proben werden kann, wo Pufferkomponenten induzieren signifikante Poren clogging Ereignisse, so dass zuverlässige Nutzung des Standard-Protokoll nicht lebensfähig.

Vesikel aus zellulären Ursprungs sind sehr reichlich in Körperflüssigkeiten 1. Diese sogenannten extrazellulären Vesikeln (EFD) (50 - 1.000 nm in der Größe) werden entweder durch Fusion von Mehr vesikulären Körper mit der Zellmembran oder durch eine direkte außen knospe der Zellmembran gebildet. In den letzten Jahren hat das wissenschaftliche Interesse an Elektrofahrzeugen stark erhöht, was zu einer Fülle von EV orientierte Publikationen, in denen neue Funktionen und Eigenschaften von Elektrofahrzeugen werden beschrieben 1. EVs sind nun angenommen, dass in einer breiten Palette von physiologischen und pathologischen Prozessen wie Signaltransduktion, Immunregulation und Blutgerinnung 1-4 einbezogen werden. Bei Krebs, Elektrofahrzeuge scheinen eine Rolle bei der Bildung von 5,6 premetastatic Nischen, die Übertragung von Pro-Krebs Inhalt 7,8 und Anregung der Angiogenese 8 zu spielen. Daneben werden EVs als Zusteller von Therapeutika 9 erforscht. Trotz dieser deEntwicklungen bleibt zuverlässige Quantifizierung von Elektrofahrzeugen eine Herausforderung. Traditionell sind indirekte Verfahren zur Quantifizierung verwendet, die auf der Bestimmung des Gesamtproteingehalts oder spezifischen Proteinen beruhen. Obwohl allgemein verwendet, müssen diese Techniken nicht für die Protein-per-EV Unterschiede ausmachen, und nicht zwischen gefährdend Proteinaggregate und Proteinen in EVs unterscheiden. Darüber hinaus erfordern diese Techniken Isolierung von Elektrofahrzeugen, die in vielen Fällen einen Vergleich der EV-Konzentrationen in biologischen Proben, nicht möglich ist. Daher werden Anstrengungen unternommen, um neue Methoden, die für mehr präzise und direkte Messung EV 10 erlauben zu entwickeln. Dieser Bericht beschreibt die Verwendung von einstellbaren Pulswiderstandserkundung (TRP) für eine zuverlässige Quantifizierung und Größe Profilierung der Elektrofahrzeuge. Derzeit ist die qNano Gerät an (Abbildung 1a) ist das einzige kommerziell verfügbare Plattform für trpS. In TRP, punktiert eine nicht-leitende elastische Membran witen einer Nano-Poren trennt zwei Fluidzellen. Einer der Fluidkammern ist mit der interessierenden Probe gefüllt, während die andere Zelle mit partikelfreien Elektrolyten gefüllt. Durch Anlegen einer Spannung wird ein Ionenstrom / elektrischem Strom geschaffen, das bei der Übertragung von Teilchen durch die Poren verändert wird (Abbildung 1b). Die Stärke dieses Stroms Blockade (&quot;resistive pulse&quot;) ist proportional zu dem Volumen des Teilchens 11 (Figur 1c). Die Blockade Dauer kann verwendet werden, um das Zeta-Potential der Teilchen, die auf die Partikeleigenschaften wie Ladung oder die Form 12 verlässt bewerten. Größe Profilierung unbekannter Partikel kann durch Vergleich der Widerstandsimpulse, die durch den unbekannten Teilchen mit den Widerstandsimpulse, die durch Kalibrierung Teilchen mit einem bekannten Durchmesser verursacht geführt werden. Neben der Größe einer Blockade Fall wird die Rate von denen diese auftreten, gemessen. Diese Zählrate relies von der Partikelkonzentration. Da die Konzentration und die Geschwindigkeit der Blockaden linear proportional 13, unter Verwendung eines einzigen Kalibrierungsprobe mit Partikeln bekannter Konzentration und Teilchengrße ermöglicht die Messung der Konzentration 14 und Größenverteilung 11 einer unbekannten Probe. Die Bewegung der Teilchen durch die Nanopore wird elektro kinetisch (elektrophoretische und elektroosmotische) und Fluidkräfte 15 bestimmt. Durch Verwendung der variablen Druckmodul (VPM) eine Druckdifferenz zwischen den Fluidzellen können als zusätzliche Kraft induziert werden. Aufbringen von Überdruck erhöht sich die Strömungsrate der Teilchen, die von Nutzen sein können, wenn die Partikelkonzentration niedrig ist. Auch kann Druck aufgebracht werden, um die Wirkung der elektrokinetischen Kräfte zu reduzieren. Dies ist besonders wichtig bei der Verwendung von Nanoporen mit relativ kleinen Porendurchmesser (NP100, NP150 und NP200 möglicherweise) so oft für den Nachweis von EVs verwendet.Für diese Nanoporen, auch bei der Anwendung erheblichen Druck, die elektrokinetische Kräfte, je nach Partikeloberflächenladung, bleiben nicht vernachlässigbare 16. Durch die Messung der Partikelrate bei Mehrfachbelastungen, ein elektro kinetisch korrigiert und damit genauer, kann EV-Konzentration berechnet werden. Hier werden detaillierte Protokolle bereitgestellt, um die Größenverteilung und Konzentration von Elektrofahrzeugen zu ermitteln. Neben dem regulären Betrieb Protokoll wird ein alternativer Ansatz beschrieben, bei dem Proben mit Polystyrol-Kügelchen bekannter Größe und Konzentration 17 versetzt. Diese Echtzeit-Kalibrierungsverfahren kann verwendet werden, zu überwinden einige der technischen Probleme auftreten, wenn die Messung EVs direkt in biologischen Flüssigkeiten, wie Urin, Plasma und Zellkulturüberstand, oder wenn die Stabilität der Nanopore über einen langen Zeitraum der Messzeit kann nicht sichergestellt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td><a href="http://www.izon.com/trps-with-qnano/">qNano instrument</a></td>
			<td>Izon Science Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.izon.com/products/components-and-consumables/vpm/">Variable pressure module</a></td>
			<td>Izon Science Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.izon.com/products/components-and-consumables/nanopores/">Nanopore</a></td>
			<td>Izon Science Ltd.</td>
			<td>NP100, NP200</td>
			<td>Choice of nanopore varies based on target particle. Different nanopores are available for different target sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibration Particles</td>
			<td>Izon Science Ltd.</td>
			<td>CPC100, CPC200, CPC400</td>
			<td>Calibration particles are available in different sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonication bath</td>
			<td>Multiple available</td>
			<td></td>
			<td>Basic sonication bath is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Mini) vortexer</td>
			<td>Multiple available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lift-free tissues</td>
			<td>Multiple available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Multiple available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows based computer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Izon Control Suite 2.2</td>
			<td>Izon Science Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet Software</td>
			<td>Multiple available</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification and size-profiling of extracellular vesicles using tunable resistive pulse sensing

Extrazellulären Vesikeln (EVS), einschließlich &quot;Mikrovesikeln&quot; und &quot;Exosomen&quot;, sind sehr reichlich in Körperflüssigkeiten. Die letzten Jahre haben einen enormen Anstieg der Zinsen in EVs erlebt. EVs sind gezeigt worden, um eine wichtige Rolle in verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen, einschließlich Gerinnung, Immunreaktionen und Krebs. Darüber hinaus haben EVs Potential als therapeutische Mittel, beispielsweise als Arzneimittelabgabevehikel oder der regenerativen Medizin. Aufgrund ihrer geringen Größe (50 bis 1.000 nm) genaue Quantifizierung und Größe Profilierung der Elektrofahrzeuge ist technisch anspruchsvoll. Dieses Protokoll beschreibt abstimmbaren Widerstandserfassungsimpuls (TRP)-Technologie unter Verwendung des qNano System kann verwendet werden, um die Konzentration und Größe EVs bestimmen. Das Verfahren, das durch eine Nanoporengröße auf der Detektion von EVs auf ihre Übertragung beruht, relativ schnell ist, reicht die Verwendung von kleinen Probenmengen und nicht PUR erfordernkation und Konzentration von Elektrofahrzeugen. Neben dem regulären Betrieb Protokoll ein alternativer Ansatz beschrieben, unter Verwendung von Proben gespickt mit Polystyrol-Kügelchen bekannter Größe und Konzentration. Diese Echtzeit-Kalibrierungstechnik kann verwendet werden, um technische Hürden überwunden werden, die auftreten, wenn die Messung direkt EVs in biologischen Flüssigkeiten.

Um trpS Instrument weist eine nichtleitende Nanopore auf die Arme 4 der Maschine (1a) angeordnet werden und eine Spannung (Abbildung 1b) aufgebracht werden. Sobald eine elektrische Ausgangsstrom hergestellt ist, werden resistive Impulse, die durch Partikel, die durch die Pore verursacht erkannt werden, wie in Abbildung 1c veranschaulicht. EVs wurden aus dem Zellkulturüberstand der Glioblastom-Zelllinie U87-MG / EGFRvIII durch Ultrazentrifugation gereinigt. Eine stabile Partikelrate-Grundstück wird beobachtet, wenn die Messung der isolierten Elektrofahrzeuge (Abbildung 2a) auf einem NP100 Nanoporen. Diese stabile Partikelrate-Grundstück ist für eine zuverlässige EV Konzentrationsmessung erforderlich. Nach der Kopplung der EV-Sample-Aufnahme auf einer Aufnahme von 115 nm Polystyrol-Kalibrierung Perlen, eine Größenverteilung (Abbildung 2b) und Konzentration Schätzung der EV-Probe erhalten werden (Daten nicht gezeigt). <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; EVs wurden auch direkt in Glioblastomzellkulturüberstand quantifiziert. Bei der Messung von EVs in biologischen Proben, Nanoporenverstopfung führt oft zu Unterbrechungen und / oder Schwankungen in der Partikelrate Parzellen (Figrue 3a). Dies führt zu ungenauen Schätzungen EV Konzentration. Durch Aufstocken der Probe mit Polystyrol-Kügelchen bekannter Konzentration und Größe kann eine EV-zu-Wulst-Verhältnis bestimmt werden. 3b veranschaulicht die nach Spick Zellkulturüberstand mit Polystyrol-Kügelchen von 335 nm groß erzielten Ergebnisse. Zwei klare Populationen beobachtet. Die Partikel induzieren eine Blockade von weniger als 0,46 nA sind entschlossen EVs, die größeren Partikel bestimmt Polystyrol-Kügelchen. Das Verhältnis von Elektrofahrzeugen zu Polystyrol-Kügelchen, die das Ausgangskonzentration von Elektrofahrzeugen (Tabelle 1) zu berechnen. 3c veranschaulicht die Größenabschätzung der beiden Populationen auf der Basis der Stachel Polystyrol-Kügelchen. Die Nanoporen-Setup verwendet Wiederkonsultiert bei der Erkennung von EVs&gt; 140 nm groß. Dies kann durch Verringerung der Nanoporenöffnung gesenkt werden, jedoch wird dies auch in mehr Verstopfung Ereignissen führen. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51623/51623fig1highres.jpg" width="600" /> Abbildung 1: qNano Instrument und Betriebsmodus. (A) Foto des Instruments. Ein Nanopore auf dem Instrument angeordnet ist, Abtrennen eines unteren Flüssigkeitszelle von einem oberen Fluidzelle. Die Fluidzellen werden aus Umwelt elektrische Störungen durch die Schirmkappe (B) Illustration skizziert abstimmbaren Widerstandspulserkennung (TRP) geschützt.. Eine nicht-leitfähige elastische Nanopore zwischen zwei Fluidkammern. Durch Anlegen einer Spannung ein elektrischer Strom durch die Pore in der Nanopore punktiert hergestellt. Als extrazelluläre Vesikel durch die Nanopore bewegen, wird der Ionenstrom verändert und als Widerstandsimpuls erkannt. In trpS die Öffnungsgröße der Nanopore kann durch Strecken der Nanopore, indem der Abstand zwischen den gegenüberliegenden Armen des Instruments oder Verringerung dieses Abstandes eingestellt werden (verringert oder erhöht). (C) Ausführungsbeispiel der Widerstandsimpulse. Die Größe eines einzelnen Widerstands Impuls ist proportional zum Volumen des Partikels. Größere Impulse geben größere Teilchen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51623/51623fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51623/51623fig2highres.jpg" width="600" /> Abbildung 2: Partikelanzahl-Grundstück und Größenverteilung von Mess isoliert EVs von U87-MG / EGFRvIII Zellkulturüberstand (A) erhaltenen Partikelzahl-Plot zeigt insgesamt konstanten Partikelerkennung.. Kurze Reduzierung der insbesonle Detektion wurde zwischen 80 und 100 Sekunden der Aufzeichnung beobachtet. Nach Unterbrechung der Aufzeichnung und die Erschließung der Abschirmung Kappe, stabilisierte sich die Partikelrate nach dem wurde die Aufnahme fortgesetzt. (B) Die Größenverteilung der isolierten Elektrofahrzeuge wird nach der Kalibrierung der unbekannten Probe (EVS) bis 115 nm Polystyrol-Kalibrierung Perlen aufgetragen. (5 nm bin Größe). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51623/51623fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51623/51623fig3highres.jpg" width="600" /> Abbildung 3: trpS Quantifizierung von Elektrofahrzeugen in Zellkulturüberstand mit dem alternativen Protokoll. (A) Typische Partikelrate Parzellen erhalten bei der Messung von Elektrofahrzeugen direkt in einer biologischen Flüssigkeit. Porenverstopfung verursacht kurze Unterbrechungen und Schwankungen in der Rate der Partikelerkennung. JederGrundstück stellt eine Wiederholungsmessung der gleichen Probe. (B) drei Wiederholungsgrößenverteilung Graphen nach Spick Zellkulturüberstand mit 335 nm Polystyrol-Kalibrierung Perlen erhalten. Alle Partikel induzieren eine Widerstands Puls von weniger als 0,46 nA als EVs ausgewählt. (C) Die Stachel Polystyrol-Kügelchen kann eine Größenverteilung der Probe zu erhalten. (5 nm bin Größe). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51623/51623fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Messung </td><td> Kalibrierung nur # 1 </td><td> Kalibrierung nur # 2 </td><td> Überstand # 1 </td><td> Überstand # 2 </td><td> Überstand # 3 </td></tr><tr><td> Durchschnittsstrom (NA) </td><td> 117 </td><td> 120 </td> &lt;td&gt; 116 </td><td> 118 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> Partikelgeschwindigkeit </td><td> 172 </td><td> 194 </td><td> 250 </td><td> 246 </td><td> 196 </td></tr><tr><td> Cutoff verwendet (na) </td><td> 0,46 </td><td> 0,46 </td><td> 0,46 </td><td> 0,46 </td><td> 0,46 </td></tr><tr><td> Gesamtpartikel </td><td> 303 </td><td> 317 </td><td> 489 </td><td> 488 </td><td> 454 </td></tr><tr><td> Extrazellulären Vesikeln </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 213 </td><td> 215 </td><td> 213 </td></tr><tr><td> Stachel Kalibrierung Perlen </td><td> 300 </td><td> 316 </td><td> 276 </td><td> 273 </td><td> 241 </td></tr><tr><td> EVs / Kalibrierung Perlen </td><td> 0,01 </td><td> 0,003 </td><td> 0,772 </td><td> 0,788 </td><td> 0,884 </td></tr><tr><td> Probe - Hintergrund </td><td></td><td></td><td> 0,765 </td><td> 0.781 </td><td> 0,877 </td></tr><tr><td> Extrazelluläre Vesikel (10 7) / Ml </td><td></td><td></td><td> 7.14 </td><td> 7,29 </td><td> 8.18 </td></tr><tr><td> Probe 2.5x verdünnt </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Raw Konzentration EVs (10 7) / ml </td><td></td><td></td><td> 17.85 </td><td> 18.22 </td><td> 20,46 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1:. Beispiel Berechnung des EV-Konzentration mit dem alternativen Protokoll Ein Cut-off-Wert ist entschlossen, EVs von der Kalibrierung Perlen zu unterscheiden. Anschließend kann die Gesamtzahl der EVs und Perlen abgerufen werden. Für jede Messung wird die EV-zu-Kügelchen-Verhältnis berechnet wird. Die Höhe der Hintergrund-Teilchen im Elektrolyten (zB Proteinaggregate) wird durch Mittelung der EV-zu-Wulst-Verhältnis für die einzelnen Messungen der &quot;Kalibrierung Perlen nur&quot; Probe berechnet. Für jede Probe der Hintergrund-Verhältnis von dem erhaltenen Verhältnis subtrahiert. Diese adjusted-Verhältnis wird durch die Konzentration der Kalibrierungskügelchen in der Probe (: 9.33e7 / ml in diesem Beispiel) multipliziert. Um die rohen Konzentration von Elektrofahrzeugen zu ermitteln, wird die erhaltene Konzentration durch die Gesamt EVs Verdünnungsfaktor (2,5 in diesem Beispiel) multipliziert.

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Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Extrazellulären Vesikeln spielen eine wichtige Rolle in physiologischen und pathologischen Prozessen, einschließlich Gerinnung, Immunreaktionen und Krebs oder als potentielle therapeutische Mittel bei der Arzneimittelabgabe oder der regenerativen Medizin. Dieses Protokoll stellt Methoden zur Quantifizierung und Charakterisierung von Größe isoliert und nicht-isoliert extrazellulären Vesikeln in verschiedenen Flüssigkeiten mit abstimmbaren Widerstandspulsmessung.

Quantifizierung und Größe-Profilierung der extrazellulären Vesikeln Mit Tunable Resistive Pulse Sensing

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.2K Aufrufe.  University Medical Center Utrecht.  Extrazellulären Vesikeln spielen eine wichtige Rolle in physiologischen und pathologischen Prozessen, einschließlich Gerinnung, Immunreaktionen und Krebs oder als potentielle therapeutische Mittel bei der Arzneimittelabgabe oder der regenerativen Medizin. Dieses Protokoll stellt Methoden zur Quantifizierung und Charakterisierung von Größe isoliert und nicht-isoliert extrazellulären Vesikeln in verschiedenen Flüssigkeiten mit abstimmbaren Widerstandspulsmessung. 

Serie: Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Berührungslose, Label-freie Überwachung von Zellen und extrazellulären Matrix mittels Raman-Spektroskopie

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Forschung

Biotechnik

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals suffering from chronic medical conditions facile assessment of their immediate physiological state. Furthermore, it could serve as a research tool for analysis of complex, multifactorial medical conditions. In order for such a multianalyte sensor to be realized, it must be minimally invasive, sampling of interstitial fluid must occur without pain or harm to the user, and analysis must be rapid as well as selective.
Initially developed for pain-free drug delivery, microneedles have been used to deliver vaccines and pharmacologic agents (e.g., insulin) through the skin.1-2 Since these devices access the interstitial space, microneedles that are integrated with microelectrodes can be used as transdermal electrochemical sensors. Selective detection of glucose, glutamate, lactate, hydrogen peroxide, and ascorbic acid has been demonstrated using integrated microneedle-electrode devices with carbon fibers, modified carbon pastes, and platinum-coated polymer microneedles serving as transducing elements.3-7,8
This microneedle sensor technology has enabled a novel and sophisticated analytical approach for in situ and simultaneous detection of multiple analytes. Multiplexing offers the possibility of monitoring complex microenvironments, which are otherwise difficult to characterize in a rapid and minimally invasive manner. For example, this technology could be utilized for simultaneous monitoring of extracellular levels of, glucose, lactate and pH,9 which are important metabolic indicators of disease states7,10-14 (e.g., cancer proliferation) and exercise-induced acidosis.15

This article details the construction of a multiplexed microneedle-based sensor. The device is being developed for in situ sampling and electrochemical analysis of multiple analytes in a rapid and selective manner. We envision clinical medicine and biomedical research uses for these microneedle-based sensors.

Hohle Mikronadel-basierten Sensor für Multiplex Transdermale elektrochemische Nachweis

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Sensing of Barrier Tissue Disruption with an Organic Electrochemical Transistor

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the passage of necessary ions and molecules. A breach in this barrier can be caused by a reduction in the extracellular calcium concentration. This reduction in calcium concentration causes a conformational change in proteins involved in the sealing of the barrier, leading to an increase of the paracellular flux. To mimic this effect the calcium chelator ethylene glycol-bis(beta-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetra acetic acid (EGTA) was used on a monolayer of cells known to be representative of the gastrointestinal tract. Different methods to detect the disruption of the barrier tissue already exist, such as immunofluorescence and&#160;permeability assays. However, these methods are time-consuming and costly and not suited to dynamic or high-throughput measurements. Electronic methods for measuring barrier tissue integrity also exist for measurement of the transepithelial resistance (TER), however these are often costly and complex. The development of rapid, cheap, and sensitive methods is urgently needed as the integrity of barrier tissue is a key parameter in drug discovery and pathogen/toxin diagnostics. The organic electrochemical transistor (OECT) integrated with barrier tissue forming cells has been shown as a new device capable of dynamically monitoring barrier tissue integrity. The device is able to measure minute variations in ionic flux with unprecedented temporal resolution and sensitivity, in real time, as an indicator of barrier tissue integrity. This new method is based on a simple device that can be compatible with high throughput screening applications and fabricated at low cost.

The Organic Electrochemical Transistor is integrated with live cells and used to monitor ion flux across the gastrointestinal epithelial barrier. In this study, an increase in ion flux, related to disruption of tight junctions, induced by the presence of the calcium chelator EGTA (ethylene glycol-bis(beta-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetra acetic acid), is measured.

Erkundung der Barrier Gewebestörung mit einem organischen Transistor Elektro

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the ...

Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. To this end, cells are grown in special culture chambers on top of opposing, circular gold electrodes. A constant small alternating current is applied between the electrodes and the potential across is measured. The insulating properties of the cell membrane create a resistance towards the electrical current flow resulting in an increased electrical potential between the electrodes. Measuring cellular impedance in this manner allows the automated study of cell attachment, growth, morphology, function, and motility. Although the ECIS measurement itself is straightforward and easy to learn, the underlying theory is complex and selection of the right settings and correct analysis and interpretation of the data is not self-evident. Yet, a clear protocol describing the individual steps from the experimental design to preparation, realization, and analysis of the experiment is not available. In this article the basic measurement principle as well as possible applications, experimental considerations, advantages and limitations of the ECIS system are discussed. A guide is provided for the study of cell attachment, spreading and proliferation; quantification of cell behavior in a confluent layer, with regard to barrier function, cell motility, quality of cell-cell and cell-substrate adhesions; and quantification of wound healing and cellular responses to vasoactive stimuli. Representative results are discussed based on human microvascular (MVEC) and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), but are applicable to all adherent growing cells.

This protocol reviews Electric Cell-substrate Impedance Sensing, a method to record and analyze the impedance spectrum of adherent cells for the quantification of cell attachment, proliferation, motility, and cellular responses to pharmacological and toxic stimuli. Detection of endothelial permeability and assessment of cell-cell and cell-substrate contacts are emphasized.

Elektro-Zell-Substrat-Impedance Sensing zur Quantifizierung der endothelialen Proliferation, Barrierefunktion und Beweglichkeit

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain nucleic acid and protein cargo and are increasingly recognized as a means of intercellular communication utilized by both eukaryote and prokaryote cells. However, due to their small size, current protocols for isolation of EVs are often time consuming, cumbersome, and require large sample volumes and expensive equipment, such as an ultracentrifuge. To address these limitations, we developed a paper-based immunoaffinity platform for separating subgroups of EVs that is easy, efficient, and requires sample volumes as low as 10 &#956;l. Biological samples can be pipetted directly onto paper test zones that have been chemically modified with capture molecules that have high affinity to specific EV surface markers. We validate the assay by using scanning electron microscopy (SEM), paper-based enzyme-linked immunosorbent assays (P-ELISA), and transcriptome analysis. These paper-based devices will enable the study of EVs in the clinic and the research setting to help advance our understanding of EV functions in health and disease.

This protocol details a method to isolate extracellular vesicles (EVs), small membranous particles released from cells, from as little as 10 &#956;l serum samples. This approach circumvents the need for ultracentrifugation, requires only a few minutes of assay time, and enables the isolation of EVs from samples of limited volumes.

Auf Papier basierende Vorrichtungen zur Isolierung und Charakterisierung von extrazellulärer Vesikel

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness and low bioactivity of metals. In this study, we have developed a new method towards fabricating a new type of bioactive and mechanically reliable porous metal scaffolds-densified porous Ti scaffolds. The method consists of two fabrication processes, 1) the fabrication of porous Ti scaffolds by dynamic freeze casting, and 2) coating and densification of the porous scaffolds. The dynamic freeze casting method to fabricate porous Ti scaffolds allowed the densification of porous scaffolds by minimizing the chemical contamination and structural defects. The densification process is distinctive for three reasons. First, the densification process is simple, because it requires a control of only one parameter (degree of densification). Second, it is effective, as it achieves mechanical enhancement and sustainable release of biomolecules from porous scaffolds. Third, it has broad applications, as it is also applicable to the fabrication of functionally graded porous scaffolds by spatially varied strain during densification.

Bioactive and mechanically reliable metal scaffolds have been fabricated through a method which consists of two processes, dynamic freeze casting for the fabrication of porous Ti, and coating and densification of the Ti scaffolds. The densification process is simple, effective and applicable to the fabrication of functionally graded scaffolds.

Herstellung von mechanisch Tunable und Bioactive Metallgerüste für biomedizinische Anwendungen

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Determination of Zeta Potential via Nanoparticle Translocation Velocities through a Tunable Nanopore: Using DNA-modified Particles as an Example

Nanopore technologies, known collectively as Resistive Pulse Sensors (RPS), are being used to detect, quantify and characterize proteins, molecules and nanoparticles. Tunable resistive pulse sensing (TRPS) is a relatively recent adaptation to RPS that incorporates a tunable pore that can be altered in real time. Here, we use TRPS to monitor the translocation times of DNA-modified nanoparticles as they traverse the tunable pore membrane as a function of DNA concentration and structure (i.e., single-stranded to double-stranded DNA).
TRPS is based on two Ag/AgCl electrodes, separated by an elastomeric pore membrane that establishes a stable ionic current upon an applied electric field. Unlike various optical-based particle characterization technologies, TRPS can characterize individual particles amongst a sample population, allowing for multimodal samples to be analyzed with ease. Here, we demonstrate zeta potential measurements via particle translocation velocities of known standards and apply these to sample analyte translocation times, thus resulting in measuring the zeta potential of those analytes.
As well as acquiring mean zeta potential values, the samples are all measured using a particle-by-particle perspective exhibiting more information on a given sample through sample population distributions, for example. Of such, this method demonstrates potential within sensing applications for both medical and environmental fields.

Here we use a polyurethane tunable nanopore integrated into a resistive pulse sensing technique to characterize nanoparticles surface chemistry via the measurement of particle translocation velocities, which can be used to determine the zeta potential of individual nanoparticles.

Bestimmung des Zetapotentials über Nanoparticle Translokation Geschwindigkeiten durch eine Tunable Nanopore: Die Verwendung von DNA-modifizierten Partikel als Beispiel

Nanopore technologies, known collectively as Resistive Pulse Sensors (RPS), are being used to detect, quantify and characterize proteins, molecules and ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Tunable Hydrogele aus Pulmonary Extrazellulärmatrix für 3D-Zellkultur

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical development, not only their pharmaceutical activity is important but also their production needs to be evaluated. In this context, research focuses on the isolation of EVs, their characterization, and their storage. The present manuscript aims at providing a facile procedure for the assessment of the effect of different storage conditions on EVs, without genetic manipulation or specific functional assays. This makes it possible to quickly get a first impression of the stability of EVs under a given storage condition, and EVs derived from different cell sources can be compared easily. The stability measurement is based on the physicochemical parameters of the EVs (size, particle concentration, and morphology) and the preservation of the activity of their cargo. The latter is assessed by the saponin-mediated encapsulation of the enzyme beta-glucuronidase into the EVs. Glucuronidase acts as a surrogate and allows for an easy quantification via the cleavage of a fluorescent reporter molecule. The present protocol could be a tool for researchers in the search for storage conditions that optimally retain EV properties to advance EV research toward clinical application.

Here we present a readily applicable protocol to assess the storage stability of extracellular vesicles, a group of naturally occurring nanoparticles produced by cells. The vesicles are loaded with glucuronidase as a model enzyme and stored under different conditions. After storage, their physicochemical parameters and the activity of the encapsulated enzyme are evaluated.

Bewertung der Speicherstabilität von extrakellulären Bläschen

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the major glial cells of the PNS, play a vital role in promoting PNS regeneration by dedifferentiating into a regenerative cell phenotype following injury. However, the dedifferentiated state of SCs is challenging to maintain through the time-period needed for regeneration and is impacted by changes in the surrounding extracellular matrix (ECM). Therefore, determining the complex interplay between SCs and differing ECM to provide cues of regenerative potential of SCs is essential. To address this, a strategy was created where different ECM proteins were adsorbed onto a tunable polydimethylsiloxane (PDMS) substrate which provided a platform where stiffness and protein composition can be modulated. SCs were seeded onto the tunable substrates and critical cellular functions representing the dynamics of SC phenotype were measured. To illustrate the interplay between SC protein expression and cellular morphology, differing seeding densities of SCs in addition to individual microcontact printed cellular patterns were utilized and characterized by immunofluorescence staining and western blot. Results showed that cells with a smaller spreading area and higher extent of cellular elongation promoted higher levels of SC regenerative phenotypic markers. This methodology not only begins to unravel the significant relationship between the ECM and cellular function of SCs, but also provides guidelines for the future optimization of biomaterials in peripheral nerve repair.

This methodology aims to illustrate the mechanisms by which extracellular matrix cues such as substrate stiffness, protein composition and cell morphology regulate Schwann cell (SC) phenotype.

Vorbereitung von tunable Extracellular Matrix Microenvironments zur Bewertung der Schwann Cell Phänotyp Specification

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the ...