Dieses Protokoll bietet eine strenge und reproduzierbare Technik zur Extraktion und Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus ganzen Gewebeproben für nachgeschaltete Ex-vivo-Analysen. Mit einem der höchsten Reinheitsgrade, die derzeit erreichbar sind, erleichtert diese Methode die direkte morphologische, immunphenotypic, und tiefe Charakterisierung der interstitiellen Vesikel in verschiedenen Gewebeproben, einschließlich Tumoren sezerniert. Hier zeigen wir die Isolierung von Gewebe-EVs von Hirn- und Lungentumorproben.
Diese Technik kann jedoch auch auf Studien mit verschiedenen, gutartigen oder anderen Tumorproben angewendet werden. Zu Beginn 10 Milliliter Dissoziationspuffer im Hibernate-E-Medium für jedes 0,4 bis 1,0 Gramm Gewebe vorbereiten. Fügen Sie das gesamte frische oder gefrorene Gewebe in einem 50-Milliliter-Rohr in den Puffer und in einem warmen Wasserbad bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten inkubieren.
Danach protease und Phosphatase-Inhibitoren für eine endgültige 1x Konzentration im Dissoziationspuffer hinzufügen. Gießen Sie die Lösung mit dem Gewebe in einen lockeren Fit-Down-Homogenisator. Verwenden Sie etwa 30 langsame Striche pro Probe, um das Gewebe sanft zu dissoziieren.
Übertragen Sie dann die dissoziierte Gewebe- und Pufferlösung in ein 50 Milliliter konisches Rohr. Zentrifugieren Sie bei 500x g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten, um die Zellen und die restlichen Fasern oder kohäsiven Gewebefragmente zu pellet. Übertragen Sie den Überstand auf ein sauberes 50 Milliliter konisches Rohr und Zentrifugen bei 2.000x g und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten, um die großen Zellablagerungen zu pellet und zu entsorgen.
Übertragen Sie diesen Überstand auf ein sauberes 50 Milliliter konisches Rohr und Zentrifugen bei 10.000x g und bei vier Grad Celsius für 40 Minuten, um unerwünschte größere Vesikel oder kleine apoptotische Körper zu pellet. Dekantieren Sie den Überstand durch einen 0,45-Mikrometer-Filter in ein sauberes 12-Milliliter-Ultrazentrifugationsrohr. Als nächstes ultrazentrifugieren Sie die Probe bei 100, 000x g und bei vier Grad Celsius für zwei Stunden, um kleine Elektrofahrzeuge zu pellet.
Dekantieren Sie den Überstand und lassen Sie die Ultrazentrifugationsrohre fünf bis zehn Minuten invertiert, indem Sie häufig tippen, um Restflüssigkeit an den Seiten der Rohre zu entfernen. Dann setzen Sie das EV-Pellet in 1,5 Milliliter 0,25 Molsukrosepuffer wieder aus. Bedecken Sie die Rohre mit Parafilm, und wirbeln Sie dann die Elektrofahrzeuge in Lösung.
Die Ultrazentrifugenrohre 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur schaukeln. Und dann noch einmal Wirbel. Zentrifugieren Sie die Rohre kurz mit einer Geschwindigkeit von weniger als 1.000x g, um die Flüssigkeitssuspension an der Unterseite des Rohres zurückzugewinnen.
Bei Bedarf die Suspension bei vier Grad Celsius über Nacht aufbewahren. Fügen Sie zunächst 1,5 Milliliter 60%Iodixanol zu den 1,5 Millilitern des Saccharose-Tris-Puffers hinzu, der die EVs enthält, um eine endige Lösung mit 30% Iodixanol zu erstellen. Pipette auf und ab mehrmals, um die Lösung gründlich zu mischen.
Übertragen Sie diese Lösung auf den Boden eines 5,5 Milliliter Ultrazentrifugationsrohrs. Als nächstes mischen Sie den 60%iodixanol Stock mit ultrareinem Wasser, um mindestens 1,5 Milliliter von 20% und einer 10%iodixanol Lösung vorzubereiten. Mit einer Spritze und einer 18-Meter-Nadel 1,3 Milliliter der 20%iodixanol-Lösung messen und sorgfältig auf den unteren Farbverlauf schichten.
Halten Sie die Nadelfase in Kontakt mit der Innenseite des Rohres, direkt über dem Meniskus und fügen Sie die Lösung Tropfen weise, um zu vermeiden, mischen Sie die Schichten an der Dichte-Schnittstelle. Schicht 1,2 Milliliter der 10%iodixanol Lösung auf der Oberseite der 20%-Schicht, mit der gleichen Technik. Wägen Und laden Sie die Ultrazentrifugationsrohre sorgfältig in Rotorschaufeln.
Stellen Sie die Beschleunigungs- und Verzögerungsgeschwindigkeiten eines Schwenkschaufelrotors auf die Mindestgeschwindigkeiten und zentrifugieren Sie für 50 Minuten auf 268.000x g und auf vier Grad Celsius. Während die Probe zentrifugiert wird, beschriften Sie 10 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohre für jede Probe, die den Fraktionen eins bis 10 des Dichtegradienten entsprechen. Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, entfernen Sie die Rohre vorsichtig aus den Rotorschaufeln und legen Sie sie in einen stabilen Halter.
Pipette 10 Serielle Fraktionen von 490 Mikrolitern von der Oberseite des Farbverlaufs in die entsprechenden Rohre. Messen Sie mit einem Refraktometer die Brechungsindizes der Brüche. Übertragen Sie dann jede Fraktion in ein sauberes 12-Milliliter-Ultrazentrifugationsrohr.
Fügen Sie fünf Milliliter 1x PBS zu jedem Rohr und Pipette nach oben und unten langsam zu mischen. Fügen Sie weitere sechs Milliliter 1x PBS an die Oberseite des Rohres und sorgfältig mischen. Ultrazentrifugieren Sie die Rohre bei 100, 000x g und bei vier Grad Celsius, um die kleinen Vesikel neu zu pellet.
Dekantieren Sie den Überstand und tippen Sie auf die Rohre trocken, bevor Sie die Vesikel zur Proteinanalyse lysieren oder die Elektrofahrzeuge für die morphologische Analyse resuspendieren. Um die Elektrofahrzeuge für die Proteinanalyse zu lysieren, fügen Sie 40 Mikroliter starken Lysepuffers, der Proteaseinhibitor enthält, in die EV-Pellets ein. Parafilm über jedes Rohr legen und kräftig wirbeln.
Als nächstes die Rohre für 20 Minuten bei Raumtemperatur und Wirbel wieder schaukeln. Zentrifugieren Sie die Probe kurz 30 bis 60 Sekunden lang bei 1.000x g, um das gesamte Probenvolumen wiederherzustellen. Jede Probe in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr geben und bei einer Temperatur zwischen 20 und 80 Grad Celsius lagern, bis sie zur Weiterverarbeitung bereit ist.
Um die gereinigten Lysate für die Immunoblot-Analyse vorzubereiten, fügen Sie den Proben 5x Laemmli-Probenpuffer für eine Endkonzentration von 1x hinzu. Kochen Sie die Probe bei 95 Grad Celsius für fünf bis zehn Minuten. Laden Sie dann ein gleiches Volumen von Brüchen eins bis zehn in ein 10%SDS-Seitengel.
Belasten Sie eine gleiche Masse von Gewebe homogenat. Führen Sie Elektrophorese und Western Blot-Analysen durch, um EV-Proteine in den gereinigten Lysaten zu bestätigen und die relative EV-Fülle in Fraktionen zu vergleichen. In dieser Studie werden extrazelluläre Vesikel extrahiert und aus ganzem Gewebe gereinigt.
Nach der Ultrazentrifugation des 10 bis 30%iodixanol Gradienten kann eine Population von Licht-EVs gesehen werden, die bis zu Bruchteil zwei migrieren, während eine Population von dichten Elektrofahrzeugen gesehen werden kann, die je nach Gewebetyp bis zu Bruchteil fünf wandert. Repräsentative Immunoblots der Gradientenfraktionen weisen die effiziente Trennung und Reinigung kleiner tumorabgeleiteter Elektrofahrzeuge in Fraktion fünf auf. Bemerkenswert ist, dass Lungentumorproben in dichten Elektrofahrzeugen angereichert erscheinen, verglichen mit Licht-EVs, die zuvor aus ganzem Hirngewebe geerntet wurden.
Repräsentative Nanopartikel-Tracking-Analysen und Elektronenmikroskopie von gewebeabgeleiteten Vesikeln in der vorherrschenden Vesikel-haltigen Fraktion zeigen die Anreicherung und Konservierung ganzer Vesikel. Im Einklang mit der bekannten Größe und Struktur von kleinen Elektrofahrzeugen. Interstitielle Elektrofahrzeuge stellen vielversprechende Ziele für die Entwicklung neuartiger diagnostischer oder prognostischer Biomarker-Assays dar.
Diese Technik stellt Forschern Werkzeuge für die Extraktion und Reinigung von Vesikeln für nachgeschaltete Nutzen zur Verfügung. Nach extraktion von ganzen oder lysierten Gewebe-EVs kann eine breite Charakterisierung von Vesikeln einschließlich proteomischer, genomischer und lipidomischer Analysen durchgeführt werden. Darüber hinaus können Stichproben für gezieltere Ansätze verwendet werden.
Vesikel, die direkt aus Gewebeproben isoliert werden, können weitere Einblicke in Krankheitsmechanismen, einschließlich der Tumorgenese, liefern und in Zukunft wichtige diagnostische oder prognostische Werkzeuge liefern.
