This work was supported by grants from the Institute of Science and Technology of the Federal District (ICyTDF, 64/2012 to EO) and the Mexican Council for Science and Technology (Conacyt, 179895 to MS).

1. Errichtung und Wartung von E. histolytica Kulturen <ol><li> Wachsen axenisch (völlig frei von allen anderen Organismen kontaminiert) 1 x 10 5 Trophozoiten von Entamoeba histolytica Belastung HML: IMSS Klon A 18 in 16 x 125 mm Kulturröhrchen mit Teflon-Liner Schraubkappen (oder 1 x 10 6 Trophozoiten in einem Einweg-T- 25-Kolben) und 15 ml (oder 50 ml in T-25-Kolben) von TYI-S-33-Medium (TYI Brühe mit 3% Diamant-Vitamin-Mischung, 10% hitzeinaktiviertem Serum von erwachsenen Rindern, 0,5 IE / ml Penicillin und 35 ug ergänzt / ml Streptomycin) 19 in einem Brutschrank bei 37 ° C. </li><li> Ernte Trophozoiten während der logarithmischen Wachstumsphase, in der Regel bei 48-96 h Abständen (Fig. 1) durch Kühlen der Kulturröhrchen für 5-10 min in einem Eis-Wasserbad auf Trophozoiten an die Glaskulturröhrchen befestigt lösen. </li><li> Übertragen Sie die Kultur in einem konischen Rohr und invertieren es mehrmals, um die cel zerstreuenls. Bestimmen der Zellzahl mit einer Zählkammer (Neubauer-Kammer), und übertragen ein Inokulum in ein Kulturröhrchen mit frischem TYI-S-33-Medium. <ol><li> Verwenden geringen Anzahl von Amöben längere Inkubationszeiten (~ 3 × 10 5 Zellen für ungefähr 5 Tage) und einer höheren Zahl für kürzere Zeiträume (~ 1 × 10 6 Zellen für ca. 1 Tag). Während gezählt Inokula sind wünschenswert, etablierte Kulturen vorhersehbar, so dass geschätzte Volumen der Inokula sind möglich. </li><li> Daraufhin wird die Menge des Trophozoiten zu Zellzahlen für jedes Experiment zu optimieren. </li><li> Achten Sie auf eine parallel doppelte Kultur, eine Back-up im Falle einer unbeabsichtigten Kontamination oder Rohrbruch haben. </li></ol></li><li> Cap Rohre dicht und inkubieren sie bei 37 ° C in einem 5 ° geneigt horizontalen Winkel. </li><li> Überprüfen Kulturen durch visuelle Inspektion regelmäßig, da ein übermäßiges Wachstum der Kultur können viele lysierten Zellen enthalten. </li></ol> 2. Errichtung und Wartung von MDCK Kultur &lt;/ P&gt; <ol><li> Wachsen MDCK (Madin-Darby Canine Kidney)-Zellen vom Typ I (hoher Widerstand) in Einweg-T-75-Flaschen mit 10 ml DMEM-Medium mit Penicillin (100 IU / ml), Streptomycin (100 mg / ml) ergänzt, Insulin (0,08 U / ml) und 10% Neugeborenenkälberserum, in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 und 95% Luft bei 37 ° C. </li><li> Um die Zellen aufgeteilt, überprüfen Sie sie auf einem inversen Mikroskop. Split-Zellen, wenn sie ~ 85-100% konfluent. </li><li> Verwenden Sie eine Vakuumsauger in einer sterilen Haube und einer sterilen Pasteur-Glaspipette Medien aus der Kultur zu entfernen. Um Kratzen Zellen zu vermeiden, schalten Sie den Kolben auf den Kopf und saugen Medien aus der unteren Ecke. </li><li> Verzichten 10 ml vorgewärmtem PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4, pH 7,4) in eine T-75-Kolben (5 ml im Falle eines T-25-Kolben ) und vorsichtig die Flasche Rock, um die Zellen zu waschen. Entfernen PBS durch Vakuum Aspiration. Ausgiebigem Waschen erforderlich ist, da Serum inhibiert Trypsin. </li><li> Streifen 1,5 ml 0,05% Trypsin in eine T-75-Kolben (für T-25-Kolben verwenden, 0,5 ml) und schaukeln die Flasche, um die Zellschicht mit Trypsin zu decken. </li><li> Inkubation für 5-10 min in den Inkubator (genaue Zeit hängt von Trypsin-Aktivität). </li><li> Check für Zellablösung von Holdingflasche gegen das Licht und suchen fließt Zellen. Zellablösung (abgerundete Zellen) kann auch unter Verwendung eines Mikroskops überprüft werden. Oft Zellen schneller lösen mit einer schnellen, sanften Klaps auf die Seite des Kolbens. </li><li> 15 ml DMEM, ergänzt mit einem T-75-Kolben (5 ml für eine T-25-Kolben). Die Zellen durch Auf-und Abpipettieren 4 oder 5 mal. </li><li> Um Zellen zu propagieren, verdünnte Zellsuspension 1:5 mit frischem DMEM ergänzten. Cells Nummer kann auch an dieser Stelle mit einer Zählkammer bestimmt werden, aber dies ist in der Regel nur notwendig, wenn die Spaltung Zellen in speziellen Formaten für bestimmte Tests. </li></ol> 3. Vorbereitung der Trophozoiten Gesamt Lysate <ol><li> Nehmen Trophozoiten von culture Rohre durch Abkühlen des Rohres für 5-10 min in einem Eis-Wasser-Bad. Übertragung der Kultur aseptisch in einem konischen Röhrchen und Zentrifugieren bei 360 × g für 10 min bei 4 ° C. Vorsichtig den Überstand verwerfen durch Dekantieren, fügen eiskaltem PBS zu dem Pellet, das Röhrchen mehrmals, um die Zellen wieder und Zentrifuge bei 360 g für 10 min zu zerstreuen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal, um alle Spuren von TYI-S-33-Medium zu entfernen. </li><li> Bestimmen Sie Trophozoiten Zahl mit einer Zählkammer. </li><li> Lyse Trophozoiten durch Frost-Tau-Zyklen. Snap-einfrieren eine gemessene Inokulum von Trophozoiten (600.000 Trophozoiten / ml) in eiskaltem PBS verdünnt, in flüssigem Stickstoff für 1 min. Unfreeze die Probe bei 4 ° C und kräftig vortexen. Wiederholen Einfrieren und Auftauen 3 mal zu Zell-Lyse zu vervollständigen. </li><li> Aktivieren Sie in den Lysaten mit 0,02% β-Mercaptoethanol vorhandenen Proteasen. </li></ol> 4. Vorbereitung der Trophozoiten Secreted Produkte <ol><li> Führen Sie die Schritte 3.1 und 3.2. </li><li> BestimmenAnzahl Zellen und Lebensfähigkeit an dieser Stelle mit einer Zählkammer und Anlegen einer Trypanblau-Ausschluss-Test 20: <ol><li> Verdünnen 9 x 10 &amp;sup6; Trophozoiten in 3 ml eiskaltem PBS und Transfer-Zellen in einem 50 ml konischen Röhrchen. Nehmen Sie sich 10 ul dieser Suspension und fügen 1 ul von 0,4% Trypanblau-Stammlösung pH 7,2. </li><li> Verwenden Sie eine Neubauer-Kammer, um Zellen bei geringer Vergrößerung zu zählen. </li><li> Zählen Sie alle Zellen und trennen Sie die Anzahl der blauen Zellen, da blauen Zellen haben den Farbstoff genommen und muss als tot betrachtet werden. </li><li> Berechnen des Prozentsatzes von lebensfähigen Zellen, indem die Anzahl der lebensfähigen Zellen von der Gesamtzahl der Zellen und mit 100 multipliziert. </li></ol></li><li> Übertragung der konischen Röhrchen, die Trophozoiten Suspension in den Inkubator bei 37 ° C für 2 h in einem 5 ° geneigt horizontalen Winkel. </li><li> Um die Produkte abgesondert, Zentrifugenröhrchen bei 360 g für 10 min zu sammeln. Verwenden Sie eine Einweg-und sterile Spritze und sorgfältig sammeln supernatant, Vermeidung von Kontamination der Proben mit Trophozoiten aus dem Pellet. Beseitigen Sie alle Zellen übertragen, indem der Überstand durch ein 0,22 um Celluloseacetat-Membran. Aktivieren Proteasen mit 0,02% β-Mercaptoethanol. </li><li> Um vermeintliche unerwünschte Verunreinigung mit Molekülen aus toten Zellen freigesetzt zu verwerfen, erneut die Trypanblau-Ausschluss-Test für die Lebensfähigkeit der Zellen. Und die Gesamtzahl lebensfähiger Zellen sollten die gleichen sein wie in Schritt 4.2 erhalten. Ist dies nicht der Fall ist, kann der Überstand gesammelt enthalten nicht nur sekretierte Proteine ​​und sollte verworfen werden. </li></ol> 5. Interaktion von MDCK-Zellen mit Trophozoiten, Trophozoiten Lysate oder Secreted Produkte <ol><li> Inkubieren konfluenten MDCK Zellmonoschichten mit Live-Trophozoiten (ein MDCK-to-Amöbe Verhältnis von 1:1), Trophozoit Lysate (ein MDCK-to-Amöbe Verhältnis 1:2) oder sezerniert Produkte (ein MDCK-to-Amöben-Verhältnis von 1 : 10) bei 37 ° C für 2 min und 30 (Fig. 2A). </li><li> Waschen Epithelzellen fünfmal mit eiskaltem PBS, um ungebundene Moleküle oder Trophozoiten zu beseitigen. </li></ol> 6. Herstellung von Proben für die Immunfluoreszenz <ol><li> Kultur MDCK Zellen auf sterile Deckgläschen in einer 24-Multiwell-Zellkulturschale gegeben. Überprüfen Sie die Zellen auf dem inversen Mikroskop, bis sie 100% des Zusammenflusses zu erreichen. Dann ersetzen Medium mit 1 ml frischem DMEM-Medium, ergänzten und übertragen Sie die Platte mit einem 37 ° C Inkubator für 24 h mehr. </li><li> Entfernen des Mediums unter Verwendung einer Vakuumpumpe und einer sterilen Pasteurpipette aus Glas und 1 ml warmem PBS zu jeder Vertiefung. PBS entfernen und wiederholen Sie die Wäsche mit frischem PBS. Achten Sie darauf, Zellen vom Boden der gut mit der Glaspipette zu kratzen. </li><li> In verschiedenen Bedingungen von Trophozoiten in 1 ml warmem PBS: Live-Trophozoiten (T), Trophozoit Gesamtlysate (TL) und sezerniert Produkte (SP). <ol><li> Setzen Sie die Kulturplatte im Brutschrank für 2 oder 30 min. </li><li> Bereiten Sie zwei Kontrollbedingungen: eine namens Zeitpunkt 0 min, wobei MDCK-Zellen sollten nicht mit E. inkubiert werden histolytica, sondern nur mit 1 ml warmem PBS; und ein anderer Zustand als Sekundärantikörper Steuerung, in diesem Fall inkubieren MDCK mit T, TL oder SP 2 oder 30 min und lassen Inkubation mit primären Antikörpern. </li></ol></li><li> Waschen Epithelzellen fünfmal mit kaltem PBS, um ungebundene Moleküle oder Trophozoiten zu beseitigen. </li><li> Beheben und Permeabilisierung der Zellen mit 1 ml 96% Ethanol für 30 min bei -20 ° C. </li><li> Um Ethanol zu entfernen, führen drei Schnellwaschschritten mit 1 ml PBS bei Raumtemperatur. </li><li> Führen Sie die folgenden Schritte in einer feuchten Kammer, um Austrocknen der Proben zu vermeiden: <ol><li> Verwenden Sie einen flachen Kasten verfügbar, die geschlossen und mit einem feuchten Papiertuch auf dem Proben kann sicher gestellt werden, gefüllt werden kann. Beispielsweise dient eine leere Pipettenspitze Feld diesen Zweck sehr gut. </li><li> In der Kammer, gleichmäßig legen Parafilm Schicht und Pipette 25 ul Blocking (0,5% BSA) für jede Deck. </li><li> Nehmen Deckgläser aus den Brunnen mit einer feinen Pinzette vorsichtig entfernen überschüssige Flüssigkeit vom Rand mit einem Filterpapier und legte Deckglas in den Tropfen enthalten Blocking-Lösung (0,5% BSA) mit den Zellen vor der Blockierlösung. Inkubieren der Proben für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li></ol></li><li> Vorbereitung einer Mischung von primären Antikörpern in PBS: IgM Maus-Anti-EhCPADH112 (M &amp;agr;-EhCPADH112, 1:10 Verdünnung) und IgG Kaninchen anti-ZO-1 (P &amp;agr;-ZO-1, Verdünnung 1:100). </li><li> Legen Sie ein neues Blatt Parafilm in der feuchten Box und Pipette 25 ul Antikörper-Lösung für jedes Deckglas. </li><li> Heben Sie die Deckgläser aus der Sperr Lösung, trocknen überschüssige Flüssigkeit an den Rändern mit einem Filterpapier und legen Sie sie in den Tropfen mit den Zellen vor der Antikörperlösung. Die Proben über Nacht bei 4 ° C inkubieren </li><li> Setzen jedes Deckglas in eine Vertiefung einer 24-Multiwell (Zellseite nach oben) und 1 ml PBS. <ol><li&gt; Fünfmal Waschen mit 1 ml PBS, um ungebundene Moleküle zu entfernen. </li></ol></li><li> Vorbereitung einer Mischung von fluoreszierenden sekundären Antikörpern in PBS: Ziege-anti-Maus-IgM-FITC gekoppelt (1:100 Verdünnung) und Ziege-anti-Kaninchen-IgG zu TRITC (1:50 Verdünnung) gekoppelt ist. </li><li> Legen Sie ein neues Blatt Parafilm in der feuchten Box und Pipette 25 ul der Sekundärantikörper-Lösung für jedes Deckglas. </li><li> Übertragen Sie die Proben in 6,10 und Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur im Dunklen, um die Bleich der fluoreszierenden Farbstoffe zu vermeiden. Wiederholen Sie Schritt 6.11.1. </li><li> Für die Kernfärbung, Inkubation für 3 min mit 200 ul 0,05 mM DAPI-Lösung bei Raumtemperatur und vor Licht schützen. Wiederholen Sie Schritt 6.11.1. </li><li> Um die Fluoreszenzfarbstoffe zu sparen, setzen Sie die Deckgläser (Zellen nach unten) in 5 ul Vecta Schild Antifade Montagelösung auf Glasobjektträgern. Verschließen Sie die Deckgläser mit Nagellack Probe Austrocknen zu verhindern. </li><li> Für langfristige Lagerung, halten Sie gleitet in eineMikroskop-Objektträger-Box bei -20 ° C </li><li> Analysieren Vorbereitungen durch konfokale Mikroskopie durch Z-Stapel-Sektionen und xz-Ebenen (2A). </li></ol> 7. Inkubation von Trophozoiten mit Protease-Inhibitoren oder spezifische Antikörper <ol><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.1 und 3.2. Für jede experimentelle Bedingung, Inkubation 1 x 10 5 Trophozoiten (in 50 &amp;mgr; l PBS resuspendiert) mit Proteaseinhibitoren (1 mM Vollständige und 40 &amp;mgr; g / ml E-64) oder 30 &amp;mgr; g monoklonalem Antikörper gegen EhCPADH112 (mαEhCPADH112) 21 für 20 min bei 4 º C (Fig. 2B). Mit diesen Vorbereitungen für Co-Inkubation Assays wie in Schritt 8.5 beschrieben. </li></ol> 8. Messung des transepithelialen elektrischen Widerstandes (TER) <ol><li> Kultur MDCK Zellen auf sterile Transwell durchlässigen Träger (0,4 um Porengröße). In der oberen Kammer gibt man 100 ul der Zellsuspension und im unteren Fachlegen 600 ul DMEM-Medium ergänzt. <ol><li> Überprüfen Sie die mittlere Ebene in regelmäßigen Abständen. Frisches Medium kann nach Bedarf zugegeben werden. </li><li> Überprüfen Sie die Zellen auf einem inversen Mikroskop, bis sie 100% der Zusammenfluss erreichen. Ändern Medium alle 2-3 Tage. </li><li> Zur Verbesserung der Zellen (falls erforderlich), die ins Gleichgewicht Transwell-Filter über Nacht bei 37 ° C in DMEM vor Zugabe der Zellsuspension. </li></ol></li><li> Sterilisieren STX2 Elektroden in der Haube durch Eintauchen in Ethanol und dann in sterilem PBS für 15 Minuten jeweils, unter UV-Licht. Schließen Elektroden mit einer EVOM epithelialen voltohmmeter und wählen Widerstandsmodus. </li><li> Sammeln Medium aus dem oberen Fach der einzelnen Transwell und bündeln sie. Bis zu 50 &amp;mgr; l dieser Mischung Medien und es mit 50 ul Trophozoiten Suspension (1 x 10 5 Trophozoiten in PBS) oder nur mit PBS (Kontrolle). Verwenden Sie eine ähnliche Mischung für jeden Transwell. </li><li> In Mischungen mit der oberen Kammer eines jeden Transwell containing die MDCK-Zellen. Versuchsbedingungen gehören MDCK Zellen ohne Trophozoiten (Kontrolle), eine Co-Kultur mit Trophozoiten oder Trophozoiten mit Proteaseinhibitoren oder mαEhCPADH112 vorinkubiert. Um den Widerstand von Filtern versehen zu beseitigen, verwenden Transwells nur mit Medium inkubiert. Für jede Versuchsbedingung Verwendung mindestens drei Transwells. </li><li> Sofort messen TER durch Eintauchen der Elektroden in jedem STX2 Transwell. <ol><li> Sicherzustellen, dass die längere Elektrode den Boden der unteren Kammer berührt, und dass die kürzere Elektrode von Medium in der oberen Kammer abgedeckt (siehe Fig. 2B). </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Elektroden senkrecht jeder Zeit zu halten. Dadurch wird die Reproduzierbarkeit zu verbessern, deutlich. Vermeiden Sie es, oder Kippen der Elektrode während der Messungen, da dies zu Veränderung von Daten führen. </li></ol></li><li> Diese Messung sollte als die erste TER-Wert werden. Dann überwachen die TER während des folgenden30 min. </li><li> Um die endgültige TER-Wert zu berechnen, subtrahieren Sie die TER-Wert von nur Filter. Um die Ergebnisse von verschiedenen Experimenten vergleichen normalisieren jeden Datenpunkt auf die Ausgangswerte, wobei diese als 100% (Abbildung 2B). </li></ol>

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MDCK+variety+pack:+choosing+the+right+strain.">The MDCK variety pack: choosing the right strain.</a> BMC Cell Biol. 12, (2011).</li><li>Espinosa-Cantellano, M., Martinez-Palomo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+intestinal+amebiasis:+from+molecules+to+disease.">Pathogenesis of intestinal amebiasis: from molecules to disease.</a> Clin Microbiol Rev. 13, 318-331 (2000).</li><li>Martinez-Palomo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+bases+of+the+cytolytic+mechanisms+of+Entamoeba+histolytica.">Structural bases of the cytolytic mechanisms of Entamoeba histolytica.</a> J Protozool. 32, 166-175 (1985).</li><li>Martinez-Lopez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EhADH112+recombinant+polypeptide+inhibits+cell+destruction+and+liver+abscess+formation+by+Entamoeba+histolytica+trophozoites.">The EhADH112 recombinant polypeptide inhibits cell destruction and liver abscess formation by Entamoeba histolytica trophozoites.</a> Cell Microbiol. 6, 367-376 (2004).</li><li>Ocadiz-Ruiz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+silencing+of+the+Ehcp112+gene+on+the+in+vitro+virulence+of+Entamoeba+histolytica.">Effect of the silencing of the Ehcp112 gene on the in vitro virulence of Entamoeba histolytica.</a> Parasit Vectors. 6, 248 (2013).</li><li>Johnson, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+imaging+techniques+to+studies+of+epithelial+tight+junctions.">Applications of imaging techniques to studies of epithelial tight junctions.</a> Adv Drug Deliv Rev. 57, 111-121 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Um in vitro Wirt-Pathogen-Interaktionen während epithelialen Infektion durch E. studieren histolytica, ist es entscheidend, mit etablierten Kulturen beider Epithelzellen und Trophozoiten zu arbeiten. Zum Beispiel, früher, E. histolytica Kulturen waren in der Regel in Verbindung mit bestimmten Arten von Bakterien oder Trypanosomatiden 22,23 etabliert. Jedoch Kokultivierung von E. histolytica Kulturen ist kontraproduktiv für das Studium der Wirt-Pathogen-Interakti...

Entamoeba histolytica ist eine einzelne Zelle des menschlichen Protozoen verantwortlich Amöbenruhr, eine Darminfektion, die Entzündungen und Durchfall. E. histolytica infiziert, bis zu 50 Millionen Menschen jährlich, aber nur etwa 10% der Infizierten entwickeln die Symptome zu Amöbenruhr 1 zugeordnet. Infektion bei Einnahme von kontaminierten Lebensmitteln oder Wasser mit E. auftritt histolytica Zysten. Im Darm, Zysten produzieren Live-Trophozoiten, die zu Dickdarm-Mucin haften und sich vermehren 2. Trophozoiten bilden Zysten, die in der Regel über Stuhl ausgeschieden werden. In anderen Fällen und für noch unbekannten Gründen Trophozoiten brechen die Darm Epithelschicht und dringen in das darunter liegende Gewebe. Im schlimmsten Fall, den Blutkreislauf gelangen und sie auf andere Organe wie die Leber 3. Brechen der epithelialen Barriere erfordert Störung der epithelialen transmembranalen Strukturen, die Zellen miteinander verbunden zu halten. EpithelzellenKontakte nach apikal junctional Komplex, bestehend aus fest (TJ) gebildet werden und Adhärenzverbindungen (AJ) und Desmosomen 4. Die apikal Gänge sind TJ, und deshalb sind sie die erste Barriere, die durch E. beleidigt histolytica und einige andere Krankheitserreger während der Host-Invasion. TJ aus transmembranären Adhäsionsrezeptoren wie Claudinen, Occludin und junctional Adhäsionsmoleküle (JAM), die Homo-oder heterophile Interaktion mit Rezeptoren der benachbarten Zelle in Eingriff besteht. Sie werden intrazellulär durch Gerüstmoleküle der Zonula occludens (ZO)-Familie, die die Haftung Rezeptoren an Aktin-Zytoskelett eine Verbindung zu weiteren mechanischen Festigkeit des Epithels bieten gebunden. TJ sind für die Abdichtung Darmgewebe von den Darmlumen, eine übermäßige Wasser-und Stoffleck verantwortlich. So, nach TJ sind durch den Parasiten gestört, Gewebe eingedrungen. E. histolytica sondert mehrere Moleküle, wie: (i) die in Adhäsion Amöben targ beteiligtenet Zellen 5; (Ii) die Membran-aktiven Faktoren, die an Tötung von Wirtszellen durch Exocytose, beispielsweise die Ionenkanal-bildende Peptide bezeichnet Amoebapores 6,7; und (iii) Proteasen, die extrazelluläre Matrixproteine ​​abbauen und vermitteln Gewebe Zerfall 5,8,9. Die Cysteinprotease EhCP112 und das Adhäsionsmolekül EhADH112, die zusammen den Komplex bilden EhCPADH112 zwei E. histolytica Virulenz Proteine, die bei der Demontage von TJ 10 eine wichtige Rolle spielen. Live-Trophozoiten, ihre Gesamtlysate und sezernierten Produkte induzieren molekularen Veränderungen in der TJ komplexe und funktionelle Störung der epithelialen Barriere. In dieser Studie wird gezeigt, dass EhCP112 und EhADH112 Interaktion mit Occludin und Claudin-1-Proteine, die zu der Internalisierung und Abbau von Zellproteinen und erleichtert E. histolytica Eingang durch den parazellulären Weg. Unsere Daten und die of anderen Gruppen 11-17 stark darauf hin, die Notwendigkeit von spezifischen Wirt-Pathogen-Interaktionen, die Parasiteninvasion zu ermöglichen. Die Aufklärung der molekularen Grundlagen dieser Wechselwirkungen ist von größter Bedeutung für ein besseres Verständnis der Pathogenese Amöbenruhr. Selektive Störung des TJ-Trophozoiten, gekennzeichnet durch erhöhte parazelluläre Permeabilität kann durch eine Abnahme der transepithelialen elektrischen Widerstands (TER) gemessen werden. Die Übertragung von parasitären Proteinen in Richtung Host Epithelien kann durch Immunfluoreszenzfärbung und konfokale Lasermikroskopie, einer Methode, die auch Co-Lokalisation von Amöben Virulenzfaktoren mit Epithel-Junction-Markierungen, die mögliche direkte Interaktionen zeigen, bestimmt werden kann. In diesem Artikel beschreiben wir ausführlich, wie Epithelzellen und Trophozoiten angebaut, geerntet und manipuliert, um Wirt-Pathogen-Interaktionen und ihre Folgen zu untersuchen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A&#160;</td>
			<td>IMSS Hospital, Mexico</td>
			<td>Without/number</td>
			<td>Virulent trophozoites18&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="8">TYI broth</td>
			<td rowspan="8">Becton, Dickinson and Company 
			Merck 
			Merck 
			Merck 
			J.T. Baker 
			Reproquifin 
			SIGMA-Aldrich 
			SIGMA-Aldrich</td>
			<td rowspan="8">211862 
			K35625437 626 
			21578 
			4873 
			3252-01 
			CAS 50-81-7 
			C7880 
			F-5879</td>
			<td rowspan="8">3.45% BBL Biosate peptone 
			58 mM glucose 
			39 mM NaCl 
			5 mM KH2PO4 
			6.5 mM K2HPO4 
			16.3 mM ascorbic acid 
			8.1 mM L-cysteine 
			&#160;0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum adult</td>
			<td>Microlab , Labs., Mex.</td>
			<td>SU146</td>
			<td>Use at 10% and inactivated to 56&#176; C for 30 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond&#160; vitamin&#160; mixture- Tween 80</td>
			<td>In vitro</td>
			<td>SR-07</td>
			<td>Use at 3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#160;</td>
			<td>Lakeside,&#160; M&#233;x.</td>
			<td>34564SSA IV</td>
			<td>0.5 IU/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin&#160;</td>
			<td>Lakeside,&#160; M&#233;x.</td>
			<td>75757SSA IV</td>
			<td>35 &#181;g/ mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex 15 mL screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps</td>
			<td>Corning-Pyrex</td>
			<td>9826-16X</td>
			<td>16x125 mm, capacity 15 mL and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 6 Well</td>
			<td>Corning-Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td>Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2.&#160; Rings on lid prevent cross-contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25cm2 cell culture flask</td>
			<td>Corning-Costar</td>
			<td>430168</td>
			<td>Canted neck flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDCK (Madin Darby canine kidney) type I</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CCL34</td>
			<td>Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>12800-017</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium with high glucose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonate Calf Serum</td>
			<td>In vitro</td>
			<td>S-02</td>
			<td>Use at 10%.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin mixture&#160;</td>
			<td>In vitro&#160;</td>
			<td>A-01</td>
			<td>Stock solution 10,000 U/&#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;&#160;</td>
			<td>AMSA</td>
			<td>398MJ94SSA IV</td>
			<td>Stock solution 100 IU/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin solution&#160;</td>
			<td>In vitro</td>
			<td>EN-005</td>
			<td>0.05% enzyme solution without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75cm2 cell culture flask</td>
			<td>Corning-Costar</td>
			<td>430720</td>
			<td>Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell permeable supports</td>
			<td>Corning-Costar</td>
			<td>3470</td>
			<td>0.4. &#181;m polyster membrane, 6.5 mm insert in 24 well plate, growth area 0.3 cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well cell culture dish&#160;&#160;</td>
			<td>Corning-Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td>Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Mini</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836 153 001</td>
			<td>Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64)</td>
			<td>SIGMA-Aldrich</td>
			<td>E3132</td>
			<td>Cystein protease inhibitor, final concentration 40 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p&#945;ZO-1&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>402200</td>
			<td>IgG rabbit policlonal&#160; antibody&#160; against&#160; a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>m&#945;EhCPADH112</td>
			<td>Homemade antibody</td>
			<td>Without/ Number</td>
			<td>IgM mouse monoclonal antibody&#160; against&#160; 444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-goat anti-mouse IgM</td>
			<td>Zymed</td>
			<td>62-6811</td>
			<td>Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary&#160; antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Zymed</td>
			<td>816114</td>
			<td>Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled&#160; goat anti-rabbit IgG&#160; secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STX2 Electrode</td>
			<td>World Precision Instrument&#160;</td>
			<td>102711</td>
			<td>Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM epithelial voltohmmeter</td>
			<td>World Precision Instrument&#160;</td>
			<td>12111</td>
			<td>Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>MEARIENFELD</td>
			<td>610610</td>
			<td>Hemocytometer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS_SP5_MO</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Without/number</td>
			<td>Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories, Inc.</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Mounting medium for fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#180;, 6-diamino-2-phenylindole (Dapi)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D-9542</td>
			<td>0.05 mM final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>A-1310</td>
			<td>0.5%&#160; final concentration for blocking solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of the epithelial damage produced by entamoeba histolytica infection

Entamoeba histolytica ist der Erreger der menschlichen Amöbenruhr, eine Hauptursache für Durchfall und Leber Abszess in tropischen Ländern. Infektion durch Wechselwirkung des Pathogens mit Darmepithelzellen eingeleitet. Diese Wechselwirkung führt zu einer Störung der interzellulären Strukturen wie tight junctions (TJ). TJ sicherzustellen Abdichtung der Epithelschicht auf das Wirtsgewebe von Darmlumen trennen. Neuere Studien belegen, dass eine Unterbrechung der TJ durch die parasitäre Protein EhCPADH112 ist eine Voraussetzung für E. histolytica Invasion, die von epithelialen Barrierestörung begleitet wird. Eine Analyse der molekularen Mechanismen in TJ Demontage während E. beteiligten histolytica Invasion ist von größter Bedeutung für unser Verständnis der Pathogenese Amöbenruhr zu verbessern. Dieser Artikel stellt eine einfache Modell, das die Beurteilung der ersten Wirt-Pathogen-Interaktionen und den Parasiten Invasionspotential ermöglicht. Parameter analysiert werden umfassen transepithelial elektrischen Widerstand, Interaktion von EhCPADH112 mit epithelialen Oberflächenrezeptoren, Veränderungen in der Expression und Lokalisation von epithelialen Marker junctional und Lokalisierung von Parasiten Moleküle innerhalb Epithelzellen.

Für eine erfolgreiche E. histolytica Kultur, müssen zwei wichtige Bedingungen erfüllt sein: Wachstum in axenischen Bedingungen und Ernte im logarithmischen Phase. Zuvor Kulturen von E. histolytica wurden leicht in Verbindung mit bestimmten Arten von Bakterien oder Trypanosomatiden 22 etabliert. Allerdings ist es heutzutage üblich, axenischen Anbau dieser Parasiten bedeutet eine unbestimmte Subkultivierung von Amöben in einer Umgebung frei von metabolisierenden Bakterien, Pilze, Protozoe...

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Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Die Infektion des Menschen durch Entamoeba histolytica führt zu Amöbenruhr, eine Hauptursache für Durchfall in tropischen Ländern. Infektion durch Pathogen-Interaktionen mit Darmepithelzellen eingeleitet, provoziert die Öffnung der Zell-Zell-Kontakte und somit Durchfall, manchmal gefolgt von Leberinfektion. Dieser Artikel bietet ein Modell, um die frühen Wirt-Pathogen-Interaktionen zu bewerten, um unser Verständnis der Pathogenese Amöbenruhr zu verbessern.

Die Analyse der epithelialen Schäden Produziert von<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infektion

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

analysis-epithelial-damage-produced-entamoeba-histolytica

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

18.6K Aufrufe.  Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute.  Die Infektion des Menschen durch Entamoeba histolytica führt zu Amöbenruhr, eine Hauptursache für Durchfall in tropischen Ländern. Infektion durch Pathogen-Interaktionen mit Darmepithelzellen eingeleitet, provoziert die Öffnung der Zell-Zell-Kontakte und somit Durchfall, manchmal gefolgt von Leberinfektion. Dieser Artikel bietet ein Modell, um die frühen Wirt-Pathogen-Interaktionen zu bewerten, um unser Verständnis der Pathogenese Amöbenruhr zu verbesser...

Serie: Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) Enzyme

Protozoan parasites are among the most devastating infectious agents of humans responsible for a variety of diseases including amebiasis, which is one of the three most common causes of death from parasitic disease. The agent of amebiasis is the amoeba parasite Entamoeba histolytica that exists under two stages: the infective cyst found in food or water and the invasive trophozoite living in the intestine. The clinical manifestations of amebiasis range from being asymptomatic to colitis, dysentery or liver abscesses. E. histolytica is one of the rare unicellular parasite with 5-methylcytosine (5mC) in its genome. 1, 2 It contains a single DNA methyltransferase, Ehmeth, that belongs to the Dnmt2 family. 2 A role for Dnmt2 in the control of repetitive elements has been established in E. histolytica, 3 Dictyostelium discoideum 4,5 and Drosophila. 6 Our recent work has shown that Ehmeth methylates tRNAAsp, and this finding indicates that this enzyme has a dual DNA/tRNAAsp methyltransferase activity. 7 This observation is in agreement with the dual activity that has been reported for D. discoideum and D. melanogaster. 8 The functional significance of the DNA/tRNA specificity of Dnmt2 enzymes is still unknown. To address this question, a method to determine the tRNA methyltransferase activity of Dnmt2 proteins was established. In this video, we describe a straightforward approach to prepare an adequate tRNA substrate for Dnmt2 and a method to measure its tRNA methyltransferase activity.

In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 Ehmeth Enzyme

This protocol describes the preparation of a synthetic tRNA substrate for the Entamoeba histolytica DNA/tRNA methyltransferase 2 (Dnmt2) homolog Ehmeth and the measure of its methyltransferase activity. This experimental approach can be used for investigating the activity of other Dnmt2 proteins.

In-vitro-tRNA Methylierungs-Assay mit der Entamoeba histolytica DNA und tRNA Methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) Enzyme

Protozoan parasites are among the most devastating infectious agents of humans responsible for a variety of diseases including amebiasis, which is one of ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the up- and down-regulation of gene expression rely on the transfection of stably maintained plasmids. While these have increased our understanding of Entamoeba virulence factors, the capacity to integrate exogenous DNA into genome, which would allow reverse genetics experiments, would be a significant advantage in the study of this parasite. The challenges presented by this organism include inability to select for homologous recombination events and difficulty to cure episomal plasmid DNA from transfected trophozoites. The later results in a high background of exogenous DNA, a major problem in the identification of trophozoites in which a bona fide genomic integration event has occurred. We report the development of a negative selection system based upon transgenic expression of a yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyl transferase chimera (FCU1) and selection with prodrug 5-fluorocytosine (5-FC). The FCU1 enzyme converts non-toxic 5-FC into toxic 5-fluorouracil and 5-fluorouridine-5'-monophosphate. E. histolytica lines expressing FCU1 were found to be 30 fold more sensitive to the prodrug compared to the control strain.

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

We report development of a negative selection system in E. histolytica based upon transgenic expression of a chimeric protein (FCU1) and selection with the prodrug 5-fluorocytosine. The FCU1 protein is a fusion of yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyltransferase. Expression of FCU1 resulted in increased E. histolytica sensitivity towards 5-fluorocytosine.

Entwicklung eines Negativ Selektionsmarker für Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Die Anwendung eines Maus Ligierte Peyer-Patch-Darmschlinge Assay zu bakterielle Aufnahme von M-Zellen auswerten

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

Durchflusszytometrische Isolation of Primary Murine Type II Alveolarepithelzellen für Funktionelle und Molekulare Studien

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Mimicking and exploiting virus properties and physicochemical and physical characteristics holds promise to provide solutions to some of the world's most pressing challenges. The sheer range and types of viruses coupled with their intriguing properties potentially give endless opportunities for applications in virus-based technologies. Viruses have the ability to self- assemble into particles with discrete shape and size, specificity of symmetry, polyvalence, and stable properties under a wide range of temperature and pH conditions. Not surprisingly, with such a remarkable range of properties, viruses are proposed for use in biomaterials 9, vaccines 14, 15, electronic materials, chemical tools, and molecular electronic containers4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
In order to utilize viruses in nanotechnology, they must be modified from their natural forms to impart new functions. This challenging process can be performed through several mechanisms including genetic modification of the viral genome and chemically attaching foreign or desired molecules to the virus particle reactive groups 8. The ability to modify a virus primarily depends upon the physiochemical and physical properties of the virus. In addition, the genetic or physiochemical modifications need to be performed without adversely affecting the virus native structure and virus function. Maize rayado fino virus (MRFV) coat proteins self-assemble in Escherichia coli producing stable and empty VLPs that are stabilized by protein-protein interactions and that can be used in virus-based technologies applications 8. VLPs produced in tobacco plants were examined as a scaffold on which a variety of peptides can be covalently displayed 13. Here, we describe the steps to 1) determine which of the solvent-accessible cysteines in a virus capsid are available for modification, and 2) bioconjugate peptides to the modified capsids. By using native or mutationally-inserted amino acid residues and standard coupling technologies, a wide variety of materials have been displayed on the surface of plant viruses such as, Brome mosaic virus 3, Carnation mottle virus 12, Cowpea chlorotic mottle virus 6, Tobacco mosaic virus 17, Turnip yellow mosaic virus 1, and MRFV 13.

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

A method to analyze the solvent accessibility of the thiol group of cysteine residues of Maize rayado fino virus (MRFV)-virus-like particles (VLPs) followed by a peptide cross-linking reaction is described. The method takes advantage of the availability of several chemical groups on the surface of the VLPs that can be targets for specific reactions.

Analyse der Solvent Zugänglichkeit des Cystein Rückstände auf<em&gt; Mais rayado fino-Virus</em&gt; Virus-ähnliche Partikel Produziert in<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; Pflanzen und Vernetzung der Peptide an VLPs

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the &#8216;gold standard&#8217; Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective. 
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Latex agglutination testing is a simple, rapid and inexpensive method for serotyping Streptococcus pneumoniae, and has also been widely applied in diagnostic microbiology. This manuscript describes the in-house production of latex agglutination reagents, quality control procedures and the application of this technique to pneumococcal serotyping.

Kapsel Serotypisierung<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Durch Latexagglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

Schnelle Analyse von Chromosomenaberrationen in Maus-B-Lymphozyten durch PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, including work with bacteriophages and bacteriocins, proteinaceous antibacterial agents. This approach is relatively inexpensive, with minimal resource requirements. This technique consists of spotting supernatant from a donor strain (potentially harboring a toxic compound(s)) onto a solidified soft agar overlay that is seeded with a bacterial test strain (potentially sensitive to the toxic compound(s)). We utilized this technique to screen a library of Pseudomonas syringae strains for intraspecific killing. By combining this approach with a precipitation step and targeted gene deletions, multiple toxic compounds produced by the same strain can be differentiated. The two antagonistic agents commonly recovered using this technique are bacteriophages and bacteriocins. These two agents can be differentiated using two simple additional tests. Performing a serial dilution on a supernatant containing bacteriophage will result in individual plaques becoming less in number with greater dilution, whereas serial dilution of a supernatant containing bacteriocin will result a clearing zone that becomes uniformly more turbid with greater dilution. Additionally, a bacteriophage will produce a clearing zone when spotted onto a fresh soft agar overlay seeded with the same strain, whereas a bacteriocin will not produce a clearing zone when transferred to a fresh soft agar lawn, owing to the dilution of the bacteriocin.

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

Die Nutzung der Soft-Agar-Overlay-Technik zur Leinwand für bakteriell Hemmstoffe Produziert

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ cytosolic concentrations, linked to release from internal stores or an influx through plasma membrane channels, regulate cortical cell processes. Pathogens that adhere to or invade host cells trigger a reorganization of the actin cytoskeleton underlying the host plasma membrane, which likely affects both global and local Ca2+ signaling. Because these events may occur at low frequencies in a pseudo-stochastic manner over extended kinetics, the analysis of Ca2+ signals induced by pathogens raises major technical challenges that need to be addressed.
Here, we report protocols for the detection of global and local Ca2+ signals upon a Shigella infection of epithelial cells. In these protocols, artefacts linked to a prolonged exposure and photodamage associated with the excitation of Ca2+ fluorescent probes are troubleshot by stringently controlling the acquisition parameters over defined time periods during a Shigella invasion. Procedures are implemented to rigorously analyze the amplitude and frequency of global cytosolic Ca2+ signals during extended infection kinetics using the chemical probe Fluo-4.

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Here, we present protocols to visualize calcium (Ca2+) responses elicited by HeLa cells infected by Shigella. By optimizing the parameters of bacterial infection and imaging with Ca2+ fluorescent probes, atypical global and local Ca2+ signals induced by bacteria over a large range of infection kinetics are characterized.

Ca2 + Antworten Imaging während der Shigella Infektion von Epithelzellen

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

Charakterisierung der menschliche Monocyte Teilmengen von Vollblut Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...