Die systematische Scoring-Analyse ist eine Technik zur Bewertung von Schleimhautverletzungen, die eine histologische Interpretation erleichtert, die von ausgebildeten Forschern durchgeführt werden kann. Die Wichtigsten Vorteile dieser Methode ist, dass es kostenlos und einfach zu bedienen ist. Es ermöglicht eine quantitative Analyse von histologischen Daten aus dem Darm von Mäusen mit Kolitis erhalten.
Dieses Protokoll bietet eine schnelle und reproduzierbare Möglichkeit, die Schwere der Krankheit des gesamten Dickdarms zu interpretieren, die für den Vergleich von Krankheiten von Tieren unterschiedlichen genetischen Hintergrunds notwendig ist. Für die Gewebeaufbereitung ist es wichtig, alle Reagenzien und Materialien zu organisieren. Beginnen Sie, indem Sie eine eingeschläferte Maus auf einem Sezieren Pad in einer Supine-Position und immobilisieren Sie die Maus Extremitäten mit 20 Gauge 1,5 Zoll Nadeln.
Mit Zangen und Schere, machen Sie einen kleinen Schnitt auf der Bauchhaut und ziehen Sie es zur Seite, um das Peritoneum auszusetzen, dann öffnen Sie die Bauchhöhle mit einem Mittellinienschnitt im Peritoneum vom Schambein bis zu den Seiten des Bauches. Entfernen Sie vorsichtig Gewebe und Organe, bis der Dickdarm visualisiert ist. Schneiden Sie den Beckenknochen auf beiden Seiten des Dickdarms, um das Organ vollständig zu visualisieren, vom Anus bis zum Cecum.
Entfernen Sie vorsichtig Fett, kleine Venen und Arterien, die am Dickdarm befestigt sind, während Sie das Organ vorsichtig sezieren, nur proximal zum Anus schneiden und distal zum Cecum. Spülen Sie den Doppelpunkt vorsichtig mit PBS, um fäkalen Inhalt mit einer flexiblen Kunststoff-Gavage-Nadel zu entfernen, die durch den Anus eingeführt wird. Positionieren Sie den Doppelpunkt in einer geraden Linie und öffnen Sie längs entlang der mesenterischen Arterie.
Bisect den Kolon längs vom distalen bis zum proximalen Ende. Verwenden Sie die Hälfte des Gewebes für die histologische Analyse und die andere Hälfte für Western Blot, PCR, oder gerollt in eine zweite Schweizer Rolle für die frisch gefrorene Immunfluoreszenzmikroskopie. Schneiden Sie zusätzliches Gewebe aus dem proximalen Dickdarm mit einer Rasierklinge, bis ungefähr die gleiche Breite entlang der Länge des gesamten Dickdarms erhalten wird.
Richten Sie den Dickdarm aus, um das Lumen freizulegen, und glätten Sie das Gewebe vollständig mit einer flexiblen Gavage-Nadel. Fügen Sie bei Bedarf weitere PBS hinzu, um das Gewebe während des gesamten Verfahrens feucht zu halten. Entfernen Sie die überschüssige PBS mit einem Papierwisch.
Mit einer Spritze und gavage Nadel, fügen Sie 10%neutral gepufferte formalin Lösung für zwei bis drei Minuten, um das Gewebe zu fixieren und abzuflachen, dann verwenden Sie gerade Zange, um das Ende des distalen Dickdarms zu greifen und drehen Sie den Dickdarm in konzentrische Kreise vom distalen zu proximalen Ende. Legen Sie eine 27-Spur-Nadel ein, um den Doppelpunkt in der Mitte zu fixieren und halten Sie die Schweizer Rolle, und legen Sie die Schweizer Rolle dann in eine Einbettkassette in einen histologischen Probenbehälter, der das Gewebe parallel zur Kassette orientiert. Fixieren Sie das Gewebe in 10%neutral gepufferter Formalinlösung über Nacht bei vier Grad Celsius.
Waschen Sie das Gewebe nach der nächtlichen Fixierung dreimal mit PBS. 70% Ethanol vor dem Paraffin-Einbettungsprozess hinzufügen und die Nadel von der Schweizer Rolle entfernen, bevor Sie fortfahren. Das Gewebe kann in Ethanol bei Raumtemperatur bis zur Paraffineinbettung gelagert werden.
Nachdem Sie die gescannten Bilder in der Bildverarbeitungssoftware geöffnet haben, stellen Sie sicher, dass der gesamte Doppelpunkt sichtbar ist und keine Bereiche der Probe fehlen. Aktivieren Sie die Etikettenbildr- und Skalenleistenwerkzeuge, um gescannte Folien ordnungsgemäß zu identifizieren, indem Sie auf Etikettenbildr klicken. Öffnen Sie das Anmerkungswerkzeug, indem Sie auf Anmerkungen klicken, und erstellen Sie drei verschiedene Layer, indem Sie auf eine neue Ebene klicken, um die Gesamtlänge der Schweizer Rolle, Entzündung oder Verletzung sowie Erosion oder Ulzeration zu quantifizieren.
Wählen Sie für jede Ebene eine andere Farbe aus, indem Sie auf die Layerfarbe klicken. Messen Sie die Länge jeder Ebene oder Kategorie, indem Sie auf das Stiftwerkzeug klicken, um eine Linie nach der Muskulatur zu zeichnen, und den Zeiger nach Bedarf bewegen, um den angrenzenden Bereich für die Analyse zu visualisieren. Sehen Sie sich das Bild mit 400 Mikrometer Zoom an, um eine adäquate Visualisierung der Muskulatur zu ermöglichen.
Jedes Mal, wenn der Stift angehalten wird, wird ein kleiner neuer Layer-Bereich generiert. Sie kann mit der Registerkarte Layer-Bereiche visualisiert und bearbeitet werden. Überprüfen Sie die Gesamtlänge, Entzündung oder Verletzung, und Erosion oder Ulzeration gemessen mit der Muskulatur Schleimhaut als Referenz.
Nachdem alle Layer definiert sind, exportieren Sie die Daten mithilfe des Exportrasters in die Textdateischaltfläche innerhalb der Layer-Regionsoptionen. Öffnen Sie die Textdateien, und kopieren Sie die Daten in eine Tabellenkalkulationssoftware. Alle Segmente aus jeder Region zusammen und berechnen den Prozentsatz der Schädigung und Ulzeration in Bezug auf die Gesamtlänge.
Betrachten Sie drei Hauptmerkmale, um den histologischen Colitis-Score zu berechnen und den Schweregrad der Krankheit zu bewerten. Suchen Sie nach einer gesunden Darmschleimhaut, die sich durch organisierte Epithelzellen in der Krypta-Luminalachse, Lamina-Propria mit wenigen Immunzellen und subjacent-muskuläre Schleimhaut auszeichnet. Als nächstes überprüfen Sie auf Entzündungen oder Verletzungen, die durch epitheliale Krypten gekennzeichnet sind, die abgeschwächt sind oder teilweise fehlen Epithelzellen und Schleimhautentzündung mit neutrophiler Infiltration in Krypten.
Schließlich überprüfen Sie das Vorhandensein von Erosion oder Ulzeration, die durch Bereiche ohne Oberflächenepithel oder Bereiche ohne Epithelkrypten mit oder ohne assoziierte Leukozyten gekennzeichnet ist. Um die Zuverlässigkeit dieser histologischen Kolitis-Score-Analyse im Zusammenhang mit Schleimhautschäden zu veranschaulichen, wurden 2,5%DSS fünf Tage lang im Trinkwasser von acht C57BL6-Wildtypmäusen verabreicht, gefolgt von einer Erholungsphase mit regelmäßigem Wasser für fünf Tage. Das Körpergewicht blieb während der akuten Verabreichung von DSS konstant, nahm aber dramatisch ab, als Mäuse begannen, regelmäßiges Leitungswasser zu trinken.
Blut und weiche Stühle erschienen nach drei Tagen DSS-Verabreichung und dauerten bis zum achten Tag des Experiments. Diese Beobachtungen legten nahe, dass die nachteiligsten Auswirkungen der Exposition gegenüber DSS während des Erholungszeitraums zwischen den Tagen fünf und acht beobachtet wurden. Die Messung der Dickdarmlänge am 10. Tag bestätigte eine signifikante Verkürzung am Ende des Experiments.
Die Kolons wurden am Tag null, zwei, fünf, sieben, acht und zehn geerntet, um Paraffin-Schweizer Brötchen herzustellen. Das Gewebe wurde mit H&E befleckt und High-Definition-Scans wurden analysiert, um den histologischen Colitis-Score und den Prozentsatz der Verletzungen und Geschwüre zu berechnen. Normale Kryptoarchitektur wurde bei unbehandelten Mäusen beobachtet.
Nach zwei Tagen DSS-Verabreichung wurde die Rekrutierung von Immunzellen beobachtet. Am fünften Tag scheinen Epithelzellen beschädigt zu sein und es gab eine Infiltration von Neutrophilen über das Epithel, das mit Epithelverletzungen verbunden war. Vom fünften bis achten Tag wurden Epithelverluste mit Entzündungen und Geschwüren beobachtet.
Am 10. Tag begannen Epithelzellen zu regenerieren und ulzerierte Bereiche wieder zu bevölkern, wodurch die Kolonschleimhaut langsam wiederhergestellt wurde. Beim Versuch dieses Protokolls ist es wichtig, eine richtig orientierte und gut erhaltene Schweizer Rolle zu schaffen sowie Schleimhautentzündungen oder Verletzungen sowie Geschwüre oder Erosion richtig zu identifizieren. Diese Methode kann verwendet werden, um Verletzungen entlang der gesamten Länge der Kolonschleimhaut in anderen Modellen der Kolitis, wie TMS oder T-Zell-Transfermodell, quantitativ zu bewerten.
