Die Patch-Clamp-Aufnahme ist ein äußerst nützliches Verfahren zur Untersuchung der biophysikalischen Eigenschaften der Ionenkanäle, die die neuronale Aktivität steuern.
Das Verfahren beinhaltet das Drücken einer Mikropipette aus Glas gegen eine Zelle, um einen kleinen "Patch" der Membran zu isolieren, der einen oder mehrere Ionenkanäle enthält.
Der experimentelle Aufbau erlaubt Wissenschaftlern die elektrische Umgebung des Patches durch die genaue Steuerung der Spannung an der Zellmembran festzuklemmen, abhängig von den vorliegenden Ionenkanälen wird die Strömung der Ionen durch die Membran beeinflusst und dadurch eine komplexe Erforschung dieser Kanäle ermöglicht.
Dieses Video gibt einen Überblick über die Grundlagen hinter der Patch-Clamp-Technik, eine Beschreibung der notwendigen Schritte um ein Experiment durchzuführen und schließlich einige der Anwendungen dieser Methode.
Zuerst wollen wir die Grundlagen hinter der Patch-Clamp-Aufzeichnung besprechen.
Die Anzahl der positiv und negativ geladenen Ionen im Neuron unterscheidet sich von denen außerhalb.
Dieses Ungleichgewicht erzeugt einen Spannungsunterschied oder Membranpotential von etwa -70 mV, was bedeutet, dass das Innere negativer ist als das Äußere.
Die Ionenkanäle unterstützen die Aufrechterhaltung des Gradienten aufgrund der Steuerung der Ionenbewegung durch die Zellmembran, die hauptsächlich elektrische Ströme sind.
Mit der Patch-Clamp-Technik können Wissenschaftler Fragen über die Eigenschaft des Potenzials und der Strömung stellen.
Die Patch-Clamp-Anlage besteht aus einer Mikropipette aus Glas, die sowohl eine ionische Lösung als auch eine chlorierte Silberelektrode zur Messung von Spannungen und Ströme enthält.
Die Spitze der Mikropipette hat eine polierte, ein Mikrometer Öffnung, die einen kleinen Bereich der Membran umschließt.
Um Hintergrundrauschen von Ionen innerhalb der Badlösung zu eliminieren, wird eine hochohmige Versiegelung zwischen der Pipette und dem Membranpatch gebildet. Da der Widerstand der Versiegelung im Gigaohm-Bereich ist, ist es als Gigaohmseal bekannt.
Die Elektrode innerhalb der Pipette ist mit einem Verstärker verbunden, der Strom- und Spannungsschwankungen verstärken kann, welches eine Folge der Ionenbewegungen durch die Kanäle in der Plasmamembran ist.
Mit dem Verstärker können die Wissenschaftler das Membranpotential festklemmen oder zu einer bestimmten Spannung verändern.
Der Verstärker reguliert, wie viel Strom durch die Silberelektrode hinzugefügt werden muss, um die Spannung konstant zu halten.
Da verschiedene spannungsabhängige Ionenkanäle bei spezifischen Spannungen geöffnet werden, sind die Öffnungsvorgänge durch die Veränderungen des gemessenen Strömungsprofils dargestellt.
Alternativ können die Wissenschaftler einen bestimmten Strom durch die Elektrode vorgeben und daraus die resultierenden Änderungen des Potenzials erfassen.
In dieser "Stromzangen" Konfiguration können die Aktionspotentiale aufgezeichnet werden.
Nun wollen wir einen Blick auf die fünf wichtigsten Arten der Patch-Clamp-Konfigurationen werfen.
Als Erstes ist die Cell-Attached-Konfiguration, wobei die Mikropipette an die Membran einer intakten Zelle angeheftet wird.
Als Zweitens ist die Whole-Cell-Konfiguration, wobei die Membran in der Mikropipette aufgebrochen wird, um Zugriff auf das Innere der Zelle bereitzustellen.
Als Drittens ist die Perforierte-Patch-Konfiguration. Hierbei werden Chemikalien wie Antibiotika zur Mikropipette zugegeben um kleine Löcher in der Membran zu machen, um Zugang zum Cytosol zu bekommen.
Die vierte Konfiguration ist der Inside-Out-Patch. Um dies zu erreichen, bildet die Mikropipette zuerst eine Abdichtung mit der Zelle und wird dann schnell wieder zurückgezogen, dadurch wird ein Stück der Membran entfernt und die Innenseite wird der Badlösung ausgesetzt.
Dies ermöglicht den Kanälen
auf der zytoplasmatischen Seite verschiedenen Chemikalien ausgesetzt zu sein, die dem Bad zugegeben werden.
Zum Schluß, ähnlich zum Inside-Out beginnt das Outside-Out-Patch als Gesamtzellkonfiguration. Die Mikropipette wird langsam herausgezogen bis ein Stück Membran eine konvexe Abdichtung über die Spitze bildet.
In dieser Konfiguration kann die extrazelluläre Seite des Kanals experimentellen Behandlungen ausgesetzt werden.
Da wir nun die Grundlagen besprochen haben, wollen wir die erforderlichen Schritte besprechen um eine Patch-Clamp-Aufzeichnung auszuführen.
Begonnen wird mit dem Ziehen eines Borosilikat Glasrohrs in eine Mikropipette mit einem Pipettenzieher.
Als nächstes wird die Spitze hitzepoliert, um den passenden Durchmesser und die Widerstandsfähigkeit zu erhalten.
Nach dem Polieren wird die Mikropipette mit einer ionischen Lösung gefüllt und sanft geschnipst um Luftblasen zu entfernen.
Danach schiebt man die Mikropipette über die Elektrode, die an einer Halterung befestigt ist.
Sobald sie befestigt ist wird mit einer Spritze positiver Druck auf die Pipette ausgeübt, dies hindert andere Lösungen in die Spitze einzudringen.
Nun platzieren wir unsere Zellen oder Gewebe von Interesse auf den Objekttisch des Mikroskops und bewegen die Mikropipette zu einer Zelle.
Mit dem Verstärker werden Testspannungsimpulse erzeugt und der Widerstand wird notiert, der zunehmen wird, wenn die Spitze die Zelle berührt.
Um die Gigaohm Abdichtung zu bilden wird mit Hilfe der Spritze sanft von Über- zu Unterdruck gewechselt.
Die Bildung der Abdichtung wird zu einem schnellen Anstieg des Widerstands führen, der größer als 1 Gigaohm sein wird.
Da nun eine Cell-Attached-Konfiguration hergestellt wurde, wollen wir es zu einer Whole-Cell-Konfiguration konvertieren und ein Experiment durchführen!
Bei der Whole-Cell-Konfiguration ist die Membran durchbrochen.
Das Aufbrechen wird durch das Hinzufügen von Unterdruck auf die Mikropipette vollendet.
Sobald die Membran bricht wird die Form des Testimpulses eine große Stromspitze haben, da die Zellmembran wie ein Kondensator wirkt, die mit dem Testimpuls aufgeladen wird.
Die Eigenschaften eines einzelnen Ionenkanaltyps in einem gegebenen Neuron kann durch das Blockieren der Aktivität von anderen Kanälen pharmakologisch untersucht werden.
Ein Schrittspannungsprotokoll wird verwendet, um evozierte Ionenkanalströme durch die Abstufung der Spannung an eine Reihe von verschiedenen Haltepotentialen zu untersuchen.
Die Strom-Spannungs- oder IV-Kurve zeigt die Abhängigkeit der Spannung vom Strom der durch einen Ionenkanal fließt und gibt einen Einblick bei welchen Spannungen der Kanal geöffnet oder geschlossen ist.
Nun wollen wir uns einige Anwendungen anschauen, um zu erkunden, was Neurowissenschaftler mit dieser Technik machen können.
Manchmal können Ionenkanäle in Neuronen in einer nicht-zellulären Umgebung untersucht werden.
Dafür haben Wissenschaftler Ionenkanalproteine zu einer künstlichen Lipidmembran hinzugefügt um diese Kanäle in Isolierung zu studieren.
Diese Kanäle können dadruch experimentellen Molekülen ausgesetzt werden, wie das Paprika Derivat Capsaicin, um ihre Auswirkungen auf die Kanalaktivität zu untersuchen.
Weil sie der extrazellulären Umgebung ausgesetzt sind und einen wesentlichen Einfluss auf die Zellfunktion haben, sind Ionenkanäle ausgezeichnete Angriffspunkte für Arzneimittel. Wenn die Testverbindungen in die Mikropipette oder Badlösung hinzugefügt werden, kann die Patch-Clamp-Technik verwendet werden um die Wirkung der Medikamente direkt zu testen, wie zum Beispiel Nikotin auf die neuronale Aktivität. Das Prinzip der Anwendung von Unterdruck um eine hohe Widerstandsabdichtung zu bilden, wurde auch angewendet, um Hochdurchsatzgeräte zu konstruieren, die zahlreiche Zellen gleichzeitig aufnehmen können zum Beispiel für Anwendungen im Wirkstoffscreening.
Das Whole-Cell-Patch-Clamp ist ein wertvolles Werkzeug zur Messung der Reaktion einzelner Zellen auf Reize.
Weiterhin können verkuppelte Aufnahmen eingesetzt werden, um die Auswirkungen des signalgebenden Neurons auf erregbare Zielzellen zu untersuchen, wie bei Muskeln. In diesem Beispiel wird die Whole-Cell Patch Clamp zur Reizauslösung eines Motoneurons verwendet während gleichzeitig Aufzeichnungen der Muskelfaser zur Kontrolle gemacht werden. Dabei werden klare Zusammenhänge zwischen der neuronalen Erregung und der Muskelaktivität beobachtet.
Das war die JoVE-Einführung der Patch-Clamp-Aufzeichnung, in der die Prinzipien hinter der Technik und die Schritte in einem Experiment besprochen wurden.
Mit ihrer höchst zeitlichen Empfindlichkeit gegenüber Veränderungen in der Spannung und in Strömungen, ist die Patch-Clamp-Aufzeichnung weiterhin hilfreich für das Verständnis der Biophysik von Kanälen und Neuronen.
