Name: highly efficient ligation of small rna molecules for microrna quantitation by high-throughput sequencing
Uploaded: 2014-11-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 15 s
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The authors would like to thank members of the Yi laboratory especially Zhaojie Zhang for fruitful discussions regarding linker design and ligation efficiencies, as well as the American Cancer Society for supporting this work through a postdoctoral fellowship (#125209) to J.E.L. Research reported in this publication was also supported by the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under Award Number R01AR059697 (to R.Y.) and a research grant from the Linda Crnic Institute for Down Syndrome. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.

Hinweis: Es ist wichtig, RNase-freien Bedingungen während des gesamten Verfahrens aufrechterhalten. 1. Adenylierung 3 &#39;Linker <ol><li> Verdünnte DNA-Oligonukleotid 3 &#39;Ligationsreaktionen bis 100 &amp; mgr; M in Nuklease-freiem H 2 O ausgebildet Hinweis: Das Oligonukleotid sollte eine 5&#39;-Phosphatgruppe, eine randomisierte Dinukleotid am 5&#39;-Ende und ein 3&#39;-Didesoxycytosin haben. Die 5&#39;-Phosphatgruppe ist eine Anforderung des Mth Enzym für effiziente 5&#39;Adenylierungs 10. Das Phosphat kann durch Vorbehandlung des Oligonukleotids mit einer Polynucleotid-Kinase mit der Modifikation direkt zugegeben werden, oder geordnet. Die randomisierte Dinukleotid am 5&#39;-Ende ist wichtig für die Minimierung der Sequenz Bevorzugung, die RNA Ligasen weisen bestimmte End-End-Verbindungsreaktionen über andere 6. Das 3&#39;-Didesoxycytosin stellt ein Sperrelement an dem 3&#39;-Ende des Oligonukleotids to hemmen die Bildung von Linker-Linker Concatemeren während der anschließenden Ligationsschritte und auch dazu dient, das 3&#39;-Ende des miRNA-Linker-Molekül am Ende der 3 &#39;ausgebildet Ligationsreaktion 11 blockieren. Die Oligonukleotid-Linker-Sequenz für die unvoreingenommene miR-Seq Methode gewählt ist wie folgt: 5&#39;PO 4 NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-dideoxyC3 &#39;. </li><li> Montieren Sie das folgende Reaktions Adenylierungs: 200 pmol 3&#39;-Linker-Oligonucleotid, 4 ul 10x 5 &#39;DNA Adenylierungs Puffer, 4 &amp; mgr; l 1 mM ATP, 4 &amp; mgr; M-ten RNA-Ligase, Nuklease-freiem H 2 O auf ein Endvolumen von 40 ul. </li><li> Inkubieren Reaktion bei 65 ° C für 1 Stunde. Beenden Reaktion durch Erhitzen auf 85 ° C für 5 min. </li><li> Auszufällen adenylierte Linker durch Zugabe von 2,5 Volumen 100% Ethanol und 1/3 Volumen von 10 M Ammoniumacetat, um Rest ATP zu entfernen und um unvorhergesehene Ligationen in zukünftigen Reaktionen zu vermeiden. <ol><li> Kurz gesagt, mischen die alkohol, Salz und Oligo-Lösung bis zur Homogenität, Spinnen bei voller Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge (~ 15.000 xg) bei 4 ° C für 20 min. Waschen des Pellets in 70% Ethanol, an der Luft trocknen, und resuspendieren in dem entsprechenden Volumen Nuklease-freies H 2 O auf 50-100 uM adenylierte Oligo ergeben. </li></ol></li><li> Adenylierung bestätigen, indem Sie einen 18% Polyacrylamid-Gel. <ol><li> Vorbereitung des Gels durch Vermischen der folgenden zusammen: 6,3 g Harnstoff, 6,75 ml 40% Acrylamid und 1,5 ml 10x TBE. H In 2 O auf 15 ml. </li><li> Mischen, bis der Harnstoff vollständig gelöst und mit 150 ul 10% (w / v) Ammoniumpersulfat (APS) und 15 ul tetramethlyethylenediamine (TEMED). </li><li> Sobald Gel, Vorlauf für 30 min mit 1x TBE-Laufpuffer bei Raumtemperatur eingestellt, bei 24 V / cm Gel Breite. Nachdem 30 min ist bündig Wells mit Laufpuffer. </li><li> Mischungs 5 ​​pmol der Oligonukleotide mit adenylierte und gleichen Volumen 2x denaturierenden RNA-Ladepuffer (95% (v / v) Formamid,0,02% (w / v) SDS, 0,02% Bromphenolblau (w / v), 0,01% (w / v) Xylencyanol, 1,0 mM EDTA), kurz erhitzen auf 75 ° C und rasten auf Eis gekühlt. Dispense gesamte Probe in die Vertiefung des Gels. Auch eine identische Menge an nicht-adenylierte Kontrolle und niedrige Standards Molekulargewicht Größe. </li><li> Die Elektrophorese bei 24 V / cm, bis das Bromphenolblau auf ¾ der bis zum Boden des Gels. Zerlegen Gerät, post-Fleck-Gel mit 1x SYBR-Gold-Lösung in 1x TBE und visualisieren auf UV-Transilluminator Feld (Abbildung 2). HINWEIS: Gel zur Reinigung des adenylierte oligo in einer ähnlichen Weise wie oben beschrieben, wenn &quot;kein Eingangs RNA&quot; Kontrollen, was zu einer hohen Menge an PCR-Produkt im Vergleich zu Proben, die mit Eingangs RNA. </li></ol></li></ol> 2. Linker-Ligation, um 3&#39;-Ende des miRNA <ol><li> 3 &#39;Die Ligation <ol><li> Montieren Sie folgende Komponenten auf Eis in der aufgeführten Reihenfolge: 1,0 ul 50% (w / v) PEG 8000, 0,5 &amp;# 956; l 10x RNA-Ligase-Puffer (500 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM MgCl 2, 10 mM DTT), 1,0 ul adenylierte 3&#39;-Linker (100 &amp; mgr; M), 0,5 ul RNase-Inhibitor, 0,5-8,0 &amp; mgr; g Gesamt-RNA, 0,5 &amp; mgr; l T4-RNA-Ligase 2, Nuklease-freiem H 2 O auf ein Endvolumen von 5 &amp; mgr; l. </li><li> Mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren, wenn die Lösung zu viskos, um Wirbel aufgrund der hohen Konzentration von PEG 8000. Nachdem gründlich gemischt, legen die Reaktion in einem Thermocycler mit einem beheizbaren Deckel. Stellen Sie den Block auf 16 ° C, und Inkubation für 4 h. HINWEIS: Die Reaktion kann bis zu einem Endvolumen von 20 &amp; mgr; l ohne Verlust der Ligationseffizienz skaliert werden. Reaktion 4 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C, um im wesentlichen identische Ligationseffizienz zu erhalten. </li></ol></li><li> Gel Purification <ol><li> Folgende 3 &#39;Ligation, mischen die Reaktion mit einem gleichen Volumen 2x RNA-Ladepuffer. Hitze bis 70 ° C für 5 min, und Schnapp kühl auf Eis. </li&gt; <li> Führen Sie das Beispiel auf einem 15% Polyacrylamid-Gel für PAGE Reinigung. <ol><li> Vorbereiten einer 15% igen Polyacrylamidgel, enthaltend 7 M Harnstoff, in einer Weise ähnlich zu der zuvor in Schritt 1.5 beschrieben. </li><li> Vorlauf das Gel bei 24 V / cm Gel Breite für mindestens 30 min. Schalten Sie Stromversorgung, bündig Brunnen, Lastprobe und Lauf Gel bei gleichen Spannung wie Vorlauf. </li><li> Laden Sie die Probe und führen Sie den PAGE, bis die Bromphenolblau hat gerade das Gel verlassen. Das gewünschte Produkt migrieren wird in der Nähe des Xylencyanol. </li></ol></li></ol></li><li> Färbung, Visualisierung und Excision <ol><li> Zerlegen Sie Gel-Apparatur und Ort Gel in sauberen Tablett mit 1x Laufpuffer (TBE), 1x SYBR-Gold, und Rock für 15 min. </li><li> Entfernen Gel aus Färbeschale und visualisieren auf UV-Transilluminator Box mit sauberen Plastikfolie abgedeckt. Das Ligationsprodukt sollte etwa 45 Nukleotide lang sein. </li><li> Auszuschneiden die Region mit dem Ligationsprodukt mit einem sauberen razor Klinge und in 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li></ol></li><li> Produkt Isolierung und Niederschlag <ol><li> Pierce unten von 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit einer 30 G-Nadel und legen Sie die durchbohrten Rohr in einem zweiten sauberen, Low-Retention, 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifuge 5 min bei ~ 15.000 x g. </li><li> Visuell zu bestätigen, dass die gesamte Gelscheibe hat durch das Loch in der inneren Röhre bewegt. Falls erforderlich, verwenden Sie ein sauberes Pipettenspitze, einige Gelfragmente näher an das Loch zu schieben. </li><li> Entsorgen Sie die leere 0,5-ml-Röhrchen und fügen 400 ul Hochsalzsäulenpuffer (HSCB 400 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1% SDS) an die Acrylamid Gülle. Rockröhre (n) bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Übertragen Aufschlämmung auf einen 0,22 Mikron Zelluloseacetat-Spin-Säule unter Verwendung einer großen Bohrung Pipettenspitze. Zentrifuge für 3 min bei Raumtemperatur bei ~ 15.000 xg, um weg von Acrylamid-Gel-Matrix sammeln alle Flüssigkeit. </li><li> Übertragen Sie die Flüssigkeit auf eine saubere, Low-Retention, 1,5-ml-Röhrchen enthaltening 1 ul 20 mg / ml Glykogen. Hinzufügen eines gleichen Volumens an Isopropanol und 1/10 Volumen Natriumacetat. Mix-Lösung durch Umdrehen des Röhrchens mehrmals dem Niederschlag in -80 ° C Gefrierschrank für 20 min. </li><li> Zentrifuge bei voller Geschwindigkeit bei 4 ° C für 20 min, um die Nukleinsäure zu pelletieren. Überstand entfernen und waschen in 70% Ethanol. Luft trocknen Pellet für 10 min bei Raumtemperatur und direkt zum 5 &#39;Ligationsschritt. </li></ol></li></ol> 3. Linker-Ligation zu 5&#39;-Ende der miRNA-3 &#39;Linker Hybrid <ol><li> Zu pelle Nukleinsäure, fügen die folgenden Komponenten: 2 &amp; mgr; l PEG 8000 (50% w / v), 0,5 ul 10x-RNA-Ligase-Puffer, 0,5 ul ATP (10 mM), 0,5 &amp; mgr; l N, N-RNA-Oligo (100 &amp; mgr; M) und H 2 O auf ein Endvolumen von 4 &amp; mgr; l. HINWEIS: Die Zusammensetzung der &quot;NN-RNA-Oligo&quot; ist wie folgt: 5&#39;-invertierte Didesoxy-TCUACAGUCCGACGAUCNN3 &#39;und wurde von dem Hersteller über HPLC gereinigt. </li><li> Mischendiese Probe durch Auf- und Abpipettieren wiederholt. Dies für einige Zeit (bis zu 5 min), um zu gewährleisten, dass das Pellet wurde vollständig neu solubilisiert worden. Wenn erneute Solubilisierung ist problematisch, erwärmen die Probe kurz (3-5 min) bis 37 ° C und wieder Pipettieren gemischt. </li><li> Sobald das Pellet wieder in Lösung gebracht, wird der Inhalt in einen sauberen PCR-Röhrchen, enthaltend 1 &amp; mgr; l einer 1: 1 Mischung von RNase-Inhibitor und T4 RNA Ligase 1 (5 Einheiten). Wieder mischen und Abpipettieren. </li><li> Inkubieren der Reaktion in einem Thermocycler bei 37 ° C für 4 Std. Gehen Sie sofort zum cDNA-Synthese. </li></ol> 4. Reverse Transkription / cDNA Synthesis <ol><li> Fügen Sie die folgenden Komponenten in den 5 &#39;Ligation-Reaktion: 2 ul 5x RT-Puffer, 0,75 &amp; mgr; l 100 mM DTT, 1 ul Illumina RT Primer 5&#39;-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#39; (1 &amp; mgr; M) und 0,5 ul dNTPs (10 mM). </li><li> Mischen durch Pipettieren und Wärme auf 65 ° C für 5 min. Dann langsam auf der Bank t abkühlenop. </li><li> Sobald Reaktion auf Raumtemperatur, das Röhrchen auf Eis gekühlt und mit 0,5 &amp; mgr; l jeweils von Reverse Transkriptase und RNase-Inhibitor. Mischen durch Pipettieren und in Thermocycler für die Erweiterung Schritt in den Anweisungen des Herstellers angegeben. </li><li> Sobald vollständige Add 5 ul Nuklease-freies H 2 O, um das Endvolumen der cDNA-Bibliothek bis zu 15 &amp; mgr; l zu bringen. </li></ol> 5. Bibliothek Vorbereitung <ol><li> Zur Indexierung PCR, montieren die folgende Reaktion auf Eis: 6 ul 5x Phusion Puffer, 1 ul dNTPs (10 mM), 0,9 &amp; mgr; l DMSO, 0,75 &amp; mgr; l 5&#39;-Primer (25 uM), 0,75 &amp; mgr; 3 &#39;Primer (25 uM), 3 &amp; mgr; l cDNA-Bibliothek (variabler Konzentration in Abhängigkeit von der Menge der Eingabe), 0,5 ul Phusion Polymerase (1 Einheit), Nuklease-freiem H 2 O auf ein Endvolumen von 30 ul. Wähle die Primer-Sequenzen, um die Kompatibilität mit der Schablone und der Sequenzierungsplattform gewährleistenWahl. <ol><li> Führen Sie die PCR-Reaktion mit den folgenden Einstellungen: anfängliche Denaturierung bei 98 ° C für 3 min, für die ersten 4 Zyklen Denaturierung 98 ° C für 15 sec, Temperung bei 50 ° C für 15 sec, erstrecken sich bei 72 ° C für 15 sec . HINWEIS: Je nach der Menge des Ausgangsmaterials, variieren die Gesamt PCR-Zyklus-Nummern. Typischerweise ist für einen Eingang 1-2 ug Gesamt-RNA, sind insgesamt 13 PCR-Zyklen ausreicht, um die miR-Seq-Bibliothek zu erzeugen. </li><li> Durchführung nachfolgenden Zyklen, beispielsweise Zyklen 5-12, in einem Zwei-Schritt-Weise, wo die Hybridisierung und Verlängerung Zyklen werden vereinigt und bei 70 ° C für 30 sec und der Denaturierung wieder 98 ° C für 15 sec. HINWEIS: Das Reaktionsvolumen beträgt 30 ul Pausieren der PCR-Programm zu ermöglichen, und nehmen Sie die 10 ul Aliquot in vorbestimmten Zykluszahlen für Aussehen des gewünschten Produkts zu überwachen. Typischerweise Zyklen 10, 13 und 16 sind für die Prüfung von einer RNA-Probe ausgewählt. </li></ol></li><li> Vorbereiteneine 8% nicht-denaturierenden Acrylamid-Gel durch Mischen von 2 ml 40% Acrylamid, 1 ml 10x TBE, und H 2 O auf 10 ml. Dann fügen Sie 100 ul 10% APS und 10 ul TEMED. Gießen Gel und lassen Set. <ol><li> Vorlauf das Gel bei 12 V / cm Gel Breite für 30 min. Flush Brunnen. 1 ul 10x-Ladepuffer (15% Ficoll-400, 66 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1% (w / v) SDS, 0,01% (w / v) Bromphenolblau), mit 10 ul Probe in jede Vertiefung der Abmessungen 5 mm x 1 mm x 15 mm. Typischerweise kann jeder Vertiefung bis zu 30 &amp; mgr; l-Proben zu laden. Ausführen des Muster Gel bei 10 V / cm Gel Breite in 1x TBE-Puffer, bis der Bromphenolblau-Farbstoff läuft gerade aus dem Boden des Gels. </li><li> Färben und Visualisieren Gel wie in Schritt 2.3 beschrieben. </li><li> Verbrauchsteuern Das 146 Basenpaar-Band und eluieren über Nacht in 0,25 ml HSCB in einer Weise ähnlich dem, was in Abschnitt 2.4 beschrieben. Auszufällen DNA in einem gleichen Volumen an Isopropanol und 1/10 Volumen Natriumacetat. Wash Pellet in 70% Ethanol und Resuspension in TE-Puffer. </li><li> Quantifizieren Sie die Bibliothek mit PicoGreen nach den Empfehlungen des Herstellers. </li></ol></li></ol>

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The authors declare no competing financial interests.

Die hierin beschriebene Methode verwendet mehrere Schlüsselvariablen Ligationseffizienzen, nämlich hohe Konzentrationen an PEG, die Verwendung von randomisierten Linker und hohe Konzentration von Linkern 2,6,9 maximieren. Dieser Ansatz ermöglicht zuverlässig quantitative Sequenzierung Bibliotheken aus Gesamt-RNA-Proben 2. Wir haben mehrere Titrationen von Eingangs RNA durchgeführt und dabei festgestellt, dass die vorangehende Methodik eignet sich am besten für die Gesamt-RNA Mengen in der 1-8...

Hochdurchsatz-Sequenzierung basierte Methoden sind weit verbreitet, viele biologische Proben in den letzten Jahren erheblich erweitern unser Verständnis der molekularen Komplexität biologischer Systeme 3,4 angewendet. Allerdings Vorbereitung RNA-Proben für Hochdurchsatz-Sequenzierung oft vermittelt spezifische Vorurteile inhärent angewandten Methode, die Begrenzung der potenziellen Nutzen dieser mächtigen Techniken. Diese Methode bestimmte Vorurteile sind gut für die Ligation-basierten, kleine RNA-Bibliothek Vorbereitungen 1,2,5,6 dokumentiert. Diese Vorspannungen ergeben 1.000-fache Variation liest Nummern äquimolaren synthetische miRNAs, wodurch Inferenz miRNA Fülle von Sequenzdaten wild variable und fehleranfällig. Studien, die sich auf die Eigenschaften des Phagen T4 abgeleitetes RNA Ligasen haben dokumentiert, dass die Enzyme weisen Nucleotid-basierte Präferenzen 7, die als vorgespannte Bibliotheken in Hochdurchsatz-Sequenzierung Experimenten manifestieren <sup&gt; 1,2,8. Um die Vorspannungen von RNA Ligasen verliehen minimieren, verschiedene Strategien eingesetzt wurden; makromolekulare Verdrängung 9, Randomisierung der Nukleotidsequenz des Adapters, die proximal zu der Ligationsstelle 6 ist, und unter Verwendung hoher Konzentrationen von Ligations Adapter 2. Durch eine Kombination dieser drei Ansätze haben wir einen Arbeitsablauf für unvoreingenommene Herstellung von kleinen RNA-Bibliotheken für Hochdurchsatz-Sequenzierung (Abbildung 1) kompatibel entwickelt. Für direkte Vergleiche zwischen aktuellen Protokolle und unser optimiertes Verfahren entnehmen Sie bitte unserem aktuellen Bericht 2 beziehen. Diese optimierte Verfahren ergibt Ligationsgrade von mehr als 95% an beiden 3 &#39;und 5&#39; Schritte und ermöglicht die unvoreingenommene Ligation von kleinen RNA-Molekülen aus synthetischen und biologischen Proben 2.

<table><tbody><tr><td>3&#039; Linker (5&#039; phosphorylated, 3&#039; blocked)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td></td></tr><tr><td>5&#039; Linker</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>5&#039; blocked, HPLC purified</td></tr><tr><td>T4RNL2 (1-249 K227Q)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0351S</td><td>Specialized for ligation of pre-adenylated DNA adapters</td></tr><tr><td>10x Ligation buffer (without ATP)</td><td>New England Biolabs</td><td>Included with M0351S</td><td></td></tr><tr><td>10x Ligation buffer (with ATP)</td><td>New England Biolabs</td><td>Included with M0204L</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene glycol (mol. Wt. 8,000)</td><td>New England Biolabs</td><td>Included with M0204L</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>We have found water collected from a distillation apparatus to be of equvalent quality.</td></tr><tr><td>T4RNL1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204L</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III RT kit</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Phusion PCR kit</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Illumina RP1 primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>Sequence information available from Illumina</td></tr><tr><td>Illumina RT primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>Sequence information available from Illumina</td></tr><tr><td>Illumina index primer(s)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>Sequence information available from Illumina</td></tr><tr><td>40% Acrylamide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP14081</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethyethylenediamine (TEMED)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>2x Denaturing RNA loading buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>Included with M0351S</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>SpinX Centricon tubes</td><td>Costar</td><td>CLS8161</td><td></td></tr><tr><td>Low retention microfuge tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>Sybr Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>Adenylation kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2610L</td><td></td></tr></tbody></table>

highly efficient ligation of small rna molecules for microrna quantitation by high-throughput sequencing

Mirna Klonierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung, genannt miR-Seq, steht allein als Transkriptom-weiten Ansatz für miRNAs mit Einzel-Nukleotid-Auflösung zu quantifizieren. Diese Technik nimmt miRNAs durch Anbringen 3 &#39;und 5&#39;-Oligonukleotid-Adapter zu miRNA-Moleküle und können de novo miRNA Entdeckung. Die Kopplung mit leistungsstarken nächsten Generation Sequenzierung Plattformen hat miR-Seq war maßgeblich an der Studie der miRNA Biologie. Allerdings haben erhebliche Verzerrungen durch Oligonukleotid-Ligation Schritte eingeleitet miR-Seq davor als eine genaue Quantifizierung Werkzeug eingesetzt verhindert. Frühere Studien zeigen, dass Vorurteile in aktuellen miR-Seq Methoden oft zu ungenauen miRNA Quantifizierung führen mit Fehlern bis zu 1.000-fach für einige miRNAs 1,2. Um diese Verzerrungen durch RNA-Ligation vermittelt zu lösen, haben wir ein kleines RNA Ligationsverfahren, die in Ligationsgrade von über 95% sowohl in 3 &#39;und 5&#39; Ligationsschritte ergibt entwickelt. Benchmarking diese imbewiesen Bibliothek Bauweise mit äquimolaren oder differentiell gemischten synthetischen miRNAs, konsequent ergibt liest Nummern mit weniger als zweifache Abweichung vom Erwartungswert. Darüber hinaus ermöglicht diese Hocheffizienz miR-Seq Methode genaue genomweiten miRNA Profiling von in vivo Gesamt-RNA-Proben 2.

Die erwarteten Ergebnisse für die vorstehenden Verfahren sollte zunächst Beobachtung einer einzelnen Nukleotid-Verschiebung (Anstieg) in der Größe der DNA-Oligonukleotid, das unter Adenylierung von Mth RNA-Ligase (Abbildung 2). Nach 3 &#39;Ligation, Visualisierung des Acrylamid-Gel zeigt (siehe Abbildung 3) scharfe Gewichtsbändern mit hohem Molekular deutlich in der 100-300 Nukleotidbereich des Gels. Dies zeigt, dass die RNA-Probe verwendet wird ist von hoher Qualität (ni...

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Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

Hoch effiziente Ligation kleine RNA-Moleküle für MicroRNA Quantifizierung von Hochdurchsatz-Sequenzierung

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

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Biology

11.8K Aufrufe.  University of Colorado, Boulder. MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs. 

Serie: Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most interestingly, sRNAs are also found outside of cells and are stably present in all biological fluids. As such, extracellular sRNAs represent a novel class of disease biomarkers and are likely involved in cell signaling and intercellular communication networks. To assess their potential as biomarkers, sRNAs can be quantified in plasma, urine, and other fluids. Nevertheless, to fully understand the impact of extracellular sRNAs as endocrine signals, it is important to determine which carriers are transporting and protecting them in biological fluids (e.g., plasma), which cells and tissues contribute to extracellular sRNA pools, and cells and tissues capable of accepting and utilizing extracellular sRNA. To accomplish these goals, it is critical to isolate highly pure populations of extracellular carriers for sRNA profiling and quantification. We have previously demonstrated that lipoproteins, particularly high-density lipoproteins (HDL), transport functional microRNAs (miRNA) between cells and HDL-miRNAs are significantly altered in disease. Here, we detail a new protocol that utilizes tandem HDL isolation with density-gradient ultracentrifugation (DGUC) and fast-protein-liquid chromatography (FPLC) to obtain highly pure HDL for downstream profiling and quantification of all sRNAs, including miRNAs, using both high-throughput sequencing and real-time PCR approaches. This protocol will be a valuable resource for the investigation of sRNAs on HDL.

This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.

Isolierung von Lipoproteinen hoher Dichte für Non-coding Small RNA Quantification

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Forschung

Biochemie

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the research and pharmaceutical communities. To study miRNAs, it is essential that the quantification of microRNA levels is accurate and robust. By comparing wild-type to small RNA deficient mouse embryonic stem cells (mESC), we revealed a lack of accuracy and robustness in previous published multiplex qRT-PCR techniques. Here, we describe an optimized method, including purifying away excessive primers from previous multiplex steps before singleplex real time detection, which dramatically increases the accuracy and robustness of the technique. Furthermore, we explain how performing the technique on a microfluidic chip at nanoliter volumes significantly reduces reagent costs and permits time effective high throughput miRNA expression profiling.

Here we describe an optimized multiplex reverse transcriptase quantitative PCR (qRT-PCR) protocol in combination with a microfluidic platform as a cost and time effective high-throughput screening tool for microRNA (miRNA) expression levels, especially when working with limited amounts of sample.

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimierte Multiplex qRT-PCR in Nanoliter-Maßstab auf dem Fluidigm Dynamische ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Biotechnik

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in disease states and provide therapeutic targets and biomarkers. Here, we detail how to accurately quantify microRNAs. Briefly, this method describes isolating microRNAs, ligating them to adaptors suitable for high-throughput sequencing, amplifying the final products, and preparing a sample library. Then, we explain how to align the obtained sequencing reads to microRNA hairpins, and quantify, normalize, and calculate their differential expression. Versatile and robust, this combined experimental workflow and bioinformatic analysis enables users to begin with tissue extraction and finish with microRNA quantification.

Here, we describe a step-by-step strategy for isolating small RNAs, enriching for microRNAs, and preparing samples for high-throughput sequencing. We then describe how to process sequence reads and align them to microRNAs, using open source tools.

Eine vollständige Pipeline zum Isolieren und Sequenzieren von MicroRNAs und deren Analyse mithilfe von Open Source Tools

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

Genetik

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as plant microRNAs (miRNAs) carry a 2&#39;-O-methyl (2&#39;-OMe) modification at their 3&#39;&#160;terminal nucleotide. This modification adds another difficulty as it inhibits 3&#39;&#160;adapter ligation. We previously demonstrated that modified versions of the &#39;TruSeq (TS)&#39;&#160;protocol have less bias and an improved detection of 2&#39;-OMe RNAs. Here we describe in detail protocol &#39;TS5&#39;, which showed the best overall performance. TS5 can be followed either using homemade reagents or reagents from the TS kit, with equal performance.

We present a detailed small RNA library reparation protocol with less bias than standard methods and an increased sensitivity for 2&#39;-O-methyl RNAs. This protocol can be followed using homemade reagents to save cost or using kits for convenience.

Verbesserung der kleinen RNA-Seq: Weniger Voreingenommenheit und bessere Detektion von 2'-O-Methyl RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and animals. Most miRNAs act as negative switches of gene expression targeting key genes. In plants, primary miRNAs (pri-miRNAs) transcripts are generated by RNA polymerase II, and they form varying lengths of stable stem-loop structures called pre-miRNAs. An endonuclease, Dicer-like1, processes the pre-miRNAs into miRNA-miRNA* duplexes. One of the strands from miRNA-miRNA* duplex is selected and loaded onto Argonaute 1 protein or its homologs to mediate the cleavage of target mRNAs. Although miRNAs are key signaling molecules, their detection is often carried out by less than optimal PCR-based methods instead of a sensitive northern blot analysis. We describe a simple, reliable, and extremely sensitive northern method that is ideal for the quantification of miRNA levels with very high sensitivity, literally from any plant tissue. Additionally, this method can be used to confirm the size, stability and the abundance of miRNAs and their precursors.

This method demonstrates use of the northern hybridization technique to detect miRNAs from total RNA extract.

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Analyse der tRNA-Dynamik mit AQRNA-seq

AQRNA-seq for Quantifying Small RNAs

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate quantification of the pool of small RNAs. The AQRNA-seq library preparation procedure described here involves the use of custom-designed sequencing linkers and a step for reducing methylation RNA modifications that block reverse transcription processivity, which results in an increased yield of full-length cDNAs. In addition, a detailed implementation of the accompanying bioinformatics pipeline is presented. This demonstration of AQRNA-seq was conducted through a quantitative analysis of the 45 tRNAs in Mycobacterium bovis BCG harvested on 5 selected days across a 20-day time course of nutrient deprivation and 6 days of resuscitation. Ongoing efforts to improve the efficiency and rigor of AQRNA-seq will also be discussed here. This includes exploring methods to obviate gel purification for mitigating primer dimer issues after PCR amplification and to increase the proportion of full-length reads to enable more accurate read mapping. Future enhancements to AQRNA-seq will be focused on facilitating automation and high-throughput implementation of this technology for quantifying all small RNA species in cell and tissue samples from diverse organisms.

Autor im Rampenlicht: Die Rolle von AQRNA-seq bei der Kartierung kleiner RNAs und der Entschlüsselung von Protein-Translationsmechanismen

Absolute quantification RNA sequencing (AQRNA-seq) is a technology developed to quantify the landscape of all small RNAs in biological mixtures. Here, both the library preparation and data processing steps of AQRNA-seq are demonstrated, quantifying changes in the transfer RNA (tRNA) pool in Mycobacterium bovis BCG during starvation-induced dormancy.

AQRNA-seq zur Quantifizierung kleiner RNAs

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

Liquor microRNA Profiling mittels quantitativer Real-Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Medizin

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs during early development are technically challenging due to the limiting cell number. Moreover, many approaches require a miRNA of interest to be defined in assays such as northern blotting, microarray, and qPCR. Therefore, the expression of many miRNAs and their isoforms have not been studied during early development. Here, we demonstrate a protocol for small RNA sequencing of sorted cells from early mouse embryos to enable relatively unbiased profiling of miRNAs in early populations of neural crest cells. We overcome the challenges of low cell input and size selection during library preparation using amplification and gel-based purification. We identify embryonic age as a variable accounting for variation between replicates and stage-matched mouse embryos must be used to accurately profile miRNAs in biological replicates. Our results suggest that this method can be broadly applied to profile the expression of miRNAs from other lineages of cells. In summary, this protocol can be used to study how miRNAs regulate developmental programs in different cell lineages of the early mouse embryo.

We describe a technique for profiling microRNAs in early mouse embryos. This protocol overcomes the challenge of low cell input and small RNA enrichment. This assay can be used to analyze changes in miRNA expression over time in different cell lineages of the early mouse embryo.

Vorbereitung kleiner RNA-Bibliotheken für die Sequenzierung von frühen Mausembryonen

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Hoch effiziente Ligation kleine RNA-Moleküle für MicroRNA Quantifizierung von Hochdurchsatz-Sequenzierung

Zusammenfassung

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Isolierung von Lipoproteinen hoher Dichte für Non-coding Small RNA Quantification

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimierte Multiplex qRT-PCR in Nanoliter-Maßstab auf dem Fluidigm Dynamische ArrayTM IFCs

Eine vollständige Pipeline zum Isolieren und Sequenzieren von MicroRNAs und deren Analyse mithilfe von Open Source Tools

Verbesserung der kleinen RNA-Seq: Weniger Voreingenommenheit und bessere Detektion von 2'-O-Methyl RNAs

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

AQRNA-seq zur Quantifizierung kleiner RNAs

AQRNA-seq zur Quantifizierung kleiner RNAs

AQRNA-seq zur Quantifizierung kleiner RNAs

Liquor microRNA Profiling mittels quantitativer Real-Time PCR

Vorbereitung kleiner RNA-Bibliotheken für die Sequenzierung von frühen Mausembryonen