Aus dem National Institute of Mental Health: Das beschriebene Projekt wurde von Preis Anzahl R01MH079751 (F. Peruzzi PI) unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich der Verantwortung der Autoren und nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des National Institute of Mental Health oder des National Institute of Health.

Das folgende Protokoll beschreibt die Standard-Verfahren, um RNA aus GFK und Profil microRNAs mit fertigen PCR-Platten isolieren. Beachten Sie, dass die organische Extraktionsphase ist optional, und daß ein Träger-RNA wird während der Extraktion gewährleistet eine maximale Rückgewinnung der RNA zu der Probe gegeben. Folglich gibt es keine Notwendigkeit, um die RNA zu quantifizieren. Insgesamt kann ein Durchschnitt von 6-8 Platten an einem Tag ausgeführt werden, wenn die cDNA am Tag zuvor (ca. 2 h) synthetisiert. Analyse der Daten wird ausgeführt, wenn alle Proben profiliert und in die Software geladen. Abhängig von der Anzahl von Proben / Gruppen oder deren Kombination für den Vergleich kann die Datenanalyse von einem bis zu mehreren Stunden dauern. 1. RNA-Extraktion Bei -80 ° C in Aliquoten bis zur Analyse der RNA-Extraktion von CSF-Proben durchgeführt, gefroren gelagert. Für dieses Verfahren die Mirvana Paris Isolation Kit verwendet wurde, nach Angaben des Herstellers Instrumentections für die Gesamt-RNA Isolation. Bitte beachten Sie, dass, obwohl Bereicherung für kleine RNA-Spezies mit diesem Kit möglich ist, wird dieser Schritt nicht durchgeführt und die RNA-Extraktionsverfahren ist nach dem Gesamt-RNA Isolation Schritt beendet. Darüber hinaus, obwohl die Mirvana Paris Isolation Kit (wie andere kommerziell erhältliche RNA Isolation Kits) keine organischen Extraktions nicht verlangen, ein Protokoll für dieses Verfahren finden Sie unten. Das Protokoll für die RNA-Extraktion erfolgt in zwei Schritten: 1.1. Bio-Extraction (nicht bei Verwendung Mirvana Paris RNA-Extraktions-Kits erforderlich) 1.2.2. Gesamt-RNA Isolierung 1.1. Bio-Extraktion 1.1.1. Bereiten Reagenzien <ol><li> In 375 ul 2-Mercaptoethanol zu 2x Denaturierung Lösung, und speichern Sie sie bei 4 ° C </li></ol> 1.1.2. Bereiten Sie die CSF <ol><li> Auftauen jedes Aliquot CSF auf Eis vor der RNA-Extraktion. 1 ug MS2 RNA Träger zu 0,5 ml CSF aufgetaut und vorsichtigmischen. Beachten Sie, dass, wenn die organischen Extraktions weggelassen wird, wird die MS2 Träger der in 1.2.2.1 unten beschrieben Probe vor der RNA-Isolierung hinzugefügt werden. </li><li> Mischungs 0,5 ml 2x Denaturierungslösung bei Raumtemperatur zu der CSF. </li><li> 1 ml der Säure-Phenol: Chloroform zu der CSF plus 2x Denaturierung Lösung: achten Sie darauf, den Boden entzogen Phase, die Säure-Phenol: Chloroform, nicht die wässrigen Puffer, der oben auf der Mischung liegt. Zusätzlich ist zu beachten, dass Säure-Phenol: Chloroform enthält Phenol, das ein Gift und ein Reizmittel, Schutzhandschuhe und andere persönliche Schutzausrüstung ist bei der Arbeit mit diesem Reagenz. </li><li> Vortex für 30-60 Sek. mischen. Zur Vereinfachung sind die 2 ml der Probe / Denaturierungslösung / Säure-Phenol: Chloroform-Mischung in zwei 1,5 ml-Eppendorf-Röhrchen aufgeteilt. </li><li> Zentrifugieren für 5 min bei maximaler Geschwindigkeit (10.000 × g) bei Raumtemperatur. </li><li> Die wässrige (obere) Phase vorsichtig entfernen, ohne die untere Phase oder der Interphase zu stören und es auf einfrisches Röhrchen. Beachten Sie die Lautstärke zurückgewonnen. </li></ol> 1.2. RNA-Isolierung Es wird empfohlen, eine eigene Bank, Satz Pipetten und Racks für den Umgang mit RNA-Proben zu haben. Der Arbeitsbereich und Werkzeuge werden durch die Verwendung RNase Zap Spray dekontaminiert und wischt vor jedem Experiment. 1.2.1. Bereiten Reagenzien: <ol><li> In 21 ml 100% Ethanol zu miRNA Waschlösung 1 und 40 ml 100% Ethanol zum Waschlösung 2/3. Bitte beachten Sie, dass miRNA Waschlösung 1 enthält Guanidiumthiocyanat, die eine potenziell gefährliche Substanz ist. </li></ol> 1.2.2. Gesamt-RNA Isolierung <ol><li> In 1,25 Volumina von Raumtemperatur 100% Ethanol zu der wässrigen Phase von der organischen Extraktion und gründlich mischen. </li><li> Legen Sie eine Filterpatrone in einen der Röhrchen. </li><li> Pipette nicht mehr als 700 ul des Lysats / Ethanol-Mischung auf die Filterpatrone. </li><li> Zentrifugieren für 30 s bei maximalerGeschwindigkeit. Anwenden der Mischung von mehr als 700 &amp;mgr; l in aufeinanderfolgenden Anwendungen auf dem gleichen Filter. Entsorgen Sie die Durchfluss nach jeder Zentrifugation und speichern Sie die Röhrchen für den Waschschritten. </li><li> Bewerben 700 ul miRNA Waschlösung 1 auf die Filterpatrone und Zentrifuge für 15 sec bei maximaler Geschwindigkeit. Verwerfen Sie den Durchfluss durch von der Röhrchen und ersetzen Sie die Filterpatrone in die gleiche Röhrchen. </li><li> Bewerben 500 ul Waschlösung 2/3 und Zentrifuge für 15 sec bei maximaler Geschwindigkeit. Verwerfen Sie den Durchfluss durch von der Röhrchen und ersetzen Sie die Filterpatrone in die gleiche Röhrchen. Tragen Sie eine zweite 500 ul Waschlösung 2/3 und Zentrifuge für 15 sec bei maximaler Geschwindigkeit. Verwerfen Sie den Durchfluss durch von der Röhrchen und ersetzen Sie die Filterpatrone in die gleiche Röhrchen. Drehen die Anordnung für 1 min bei Maximalgeschwindigkeit um Restfluid aus dem Filter zu entfernen. </li><li> Übertragen Sie die Filterpatrone in eine frische Röhrchen. Bewerben 100 &amp; mu; L vorgewärmten (95 ° C) Nuklease-freies Wasser auf die Mitte des Filters, und schließen Sie den Deckel. Zentrifugieren für 30 Sekunden bei maximaler Geschwindigkeit, um die RNA zu erholen. </li><li> Sammeln Sie das Eluat, RNA und speichern sie bei -80 ° C für spätere Anwendungen. </li><li> Quantifizieren 1 ul RNA unter Verwendung des Nanodrop 2000c Spektrophotometer. Beachten Sie, dass RNA-Quantifizierung kann ausgelassen werden, wenn eine RNA-Träger während der RNA-Extraktion der Probe zugegeben werden. In diesem Fall 8 ul RNA der cDNA-Synthese unterzogen, wie unten beschrieben. </li></ol> 2. miRNA-Profil: qRT-PCR-Protokoll Das Protokoll für die miRNA Profilierung besteht aus zwei Schritten: <ol><li> Erststrang-cDNA-Synthese </li><li> Echtzeit-PCR-Amplifikation </li></ol> 2.1. Erststrang-cDNA-Synthese 2.1.1. Verdünnen Matrizen-RNA <ol><li> Einzustellen jeder der Matrizen-RNA-Proben auf eine Konzentration von 5 ng / &amp;mgr; l unter Verwendung von Nuklease freiem Wasser. Wenn derRNA wurde nicht quantifiziert (siehe Schritt 1.2.2.9), dann 8 ul RNA für die cDNA-Synthese verwendet </li></ol> 2.1.2. Bereiten Reagenzien <ol><li> Tauen Sie vorsichtig die 5x Reaktionspuffer und Nuklease freiem Wasser, und sofort auf Eis legen. </li><li> Mischen durch Vortexen. Die RNA Spike-in durch Zugabe von 40 ul Nuklease freiem Wasser auf dem Rohr und vortexen, lassen Sie es auf Eis für 15-20 min. Unmittelbar vor der Anwendung zu entfernen, die das Enzym-Mix aus der Tiefkühltruhe, mischen durch Schwenken der Röhrchen und setzen auf Eis. Spin down alle Reagenzien. </li></ol> 2.1.3. Reverse-Transkriptions-Reaktion Setup <ol><li> Vorbereitung der erforderlichen Menge an RT-Arbeitslösung in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen oder dgl. (in den Anteilen in Tabelle 1 angegeben, mit Ausnahme der RNA-Matrize), vortexen (1-2 Sekunden bei Höchstgeschwindigkeit), kurz Spin-down ( verwenden wir eine Mini-Eppendorf-Zentrifuge mit Festdrehzahl, 10 sec) und legen Sie es auf Eis. Beachten Sie, dass die RNA UniSp6 Spitze-In vor der RT-Reaktion zu der Probe gegeben (siehe Tabelle 1). </li><li> Dispense RT Arbeitslösung in nucleasefreiem PCR-Röhrchen. </li><li> Verzichten Matrizen-RNA in jedes Röhrchen. Hinweis: denken Sie daran, 10% Überschussvolumen / jedes Reagenz für Pipettier-und / oder Roboter-Totvolumen berechnen. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Panel I Volumen (ul) </td><td> Panel I + II Volumen (ul) </td></tr><tr><td> 5x Reaktionspuffer </td><td> 4.4 </td><td> 8.8 </td></tr><tr><td> Nuklease freiem Wasser </td><td> 9.9 </td><td> 19,8 </td></tr><tr><td> Enzym-Mix </td><td> 2.2 </td><td> 4.4 </td></tr><tr><td> UniSp6 RNA Spike-In-Vorlage </td><td> 1.1 </td><td> 2.2 </td></tr><tr><td> Vorlage Gesamt-RNA (5 ng / ul) </td><td> 4.4 </td><td> 8.8 </td></tr&gt; <tr><td> Gesamtvolumen </td><td> 22 </td><td> 44 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Reverse-Transkriptions-Reaktion-Setup. </li></ol> 2.1.4. Mix-und Spin-Reagenzien <ol><li> Mischen Sie die Reaktion durch schon (1-2 sec) Vortexen, um sicherzustellen, daß alle Reagenzien werden gründlich gemischt. Nach dem Mischen Spin-Down (Mini Eppendorf-Zentrifuge mit Festdrehzahl, 10 sec). </li></ol> 2.1.5. Inkubieren und Wärme inaktivieren <ol><li> Programmieren Sie eine PCR-Maschine wie folgt: </li><li> Inkubation für 60 min bei 42 ° C </li><li> Wärme-Inaktivierung der reversen Transkriptase für 5 min bei 95 ° C </li><li> Sofort kühlen auf 4 ° C </li><li> Lagerung bei 4 ° C oder gefrier Hinweis: Das Protokoll kann zu diesem Zeitpunkt unterbrochen werden. Die unverdünnte cDNA kann bei -20 ° C für bis zu 5 Wochen (optional bei 4 ° C bis zu 4 Tage) gehalten werden. </li></ol><pclass = &quot;jove_step&quot;&gt; 2.2. Echtzeit-PCR-Amplifikation 2.2.1. Bereiten Reagenzien für die Real-time PCR <ol><li> Zeigen cDNA (aus Schritt 2.1.5) auf Eis. </li><li> Tauwetter Nuklease freiem Wasser und PCR Master Mix auf Eis. Schützen Sie die PCR Master Mix Röhrchen aus Licht, indem sie mit Alufolie abdecken. Unmittelbar vor der Anwendung mischen die PCR Master Mix durch Vortexen 1-2 sec in einem Mini-Zentrifuge und drehen sich mit 1.500 xg unten für 1 min. </li></ol> 2.2.2. Kombinieren Sie SYBR Green Master Mix, Wasser und cDNA und in den PCR-Platten Folgende Vorgehensweise wird empfohlen, um niedrige Konzentrationen von cDNA aus den Rohroberfläche haften zu vermeiden: <ol><li> Vor dem Entfernen der Plattendichtung, kurz drehen Sie die Platte (n) in einer Kühlzentrifuge bei 1.500 g für 1 min. </li><li> In einem 15 ml konischen Röhrchen verbinden 2x PCR Master Mix und Wasser. Panel I: 2,000 ul 2x Master-Mix und 1980 ul Wasser; Panel I + II: 4.000 ul 2x Master-Mix und 3960 μ; L Wasser. </li><li> In 20 ul cDNA (Panel I) oder 40 ul cDNA (Panel I + II) und mischen. </li><li> Vorsichtig mischen durch Vortexen 1-2 sec und Spin in einer Kühlzentrifuge bei 1.500 g für 1 min. </li><li> Setzen Sie die PCR Master Mix / cDNA-Mix in einer Mehrkanalpipette Reservoir. Sie haben ein Reservoir, das die Länge des Mehrkanal-Pipette zu identifizieren. Dies hält den Pegel der Lautstärke hoch genug, so dass für gleiche Volumen Aliquots in der gesamten Mehrkanal. Dies ist kritisch gegenüber der letzten Teilmengen. </li><li> Dispense 10 ul PCR Master Mix / cDNA mischen, um jede Vertiefung der 384-well-Platte mit einem 16-Kanal-Pipette. </li><li> Verschließen Sie die Platte mit optischen Abdichtung. </li><li> Spin Platte kurz in einer Kühlzentrifuge (1500 g für 1 min), um die Lösungen zu mischen, und entfernen Sie Luftblasen. Hinweis: Das Experiment kann an dieser Stelle angehalten werden. Bewahren Sie die Reaktionen von Licht für bis zu 24 Stunden geschützt bei 4 ° C. </li></ol> 2.2.3. Echtzeit-PCR Führen Sie Echtzeit-PCR-Amplifikation und Schmelzkurvenanalyse nach den in Tabelle 2 aufgeführten Parameter. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Prozessschritt </td><td> Einstellungen, Roche LC480 </td></tr><tr><td> Polymerase Aktivierung / Denaturierung </td><td> 95 ° C, 10 min </td></tr><tr><td> Verstärkung </td><td> 45 Zyklen bei Amplification 95 ° C, 10 sec 60 ° C, 1 Min. Ramp-Rate 1,6 ° C / sec Optische Lese </td></tr><tr><td> Schmelzkurvenanalyse </td><td> Ja </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Echtzeit-PCR-Zyklusbedingungen mit dem Roche LightCycler 480. 2.3. Echtzeit-PCR-Daten-Analyse Echtzeit-PCR-Daten-Analyse mit dem Exiqon Genex Professional 5.0 getan, nach ter empfahl Anweisungen. Der Genex Schritt-für-Schritt-Anleitung kann heruntergeladen werden <a href="http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf">http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf</a> Datenanalyse besteht aus drei Schritten: <ol><li> Import von Daten </li><li> Vorverarbeitung von Daten </li><li> Die statistische Analyse </li></ol> 2.3.1. Import von Daten <ol><li> In der Roche LightCycler 480 wählen Sie die 2. Ableitung Analyseverfahren und die Berechnung der Cq-Werte. Die Daten werden als Tabelle exportiert und als Textdateien gespeichert. </li><li> Um die Daten, offene Genex importieren und klicken Sie auf den Exiqon Import-Assistenten und klicken Sie auf &quot;Start&quot;. Folgen Sie den Anweisungen, um Format, Instrumenten-und Plattenlayout-Datei (en) auswählen. Beachten Sie, dass Platte Layout-Dateien (Excel-Dateien) werden von der Exiqon Website (heruntergeladen <a href="http://www.exiqon.com/plate-layout-files">http://www.exiqon.com/plate-layout-files</a> ). </li><li> Bedeutungt Panels I und II und klicken Sie auf &quot;Weiter&quot;. </li><li> Das nach der Datei-Import erzeugte Tabelle enthält vordefinierte Spalten. Proben Namen können bearbeitet werden und Klassifikation Spalten hinzugefügt oder in diesem Schritt entfernt werden. Klicken Sie auf &quot;Weiter&quot;, wenn Sie fertig sind. </li><li> Daten speichern und laden, um Daten-Editor. </li></ol> 2.3.2. Vorverarbeitung von Daten <ol><li> Wie von Exiqon und Genex empfohlen, beim Vergleich mehrerer Platten das erste, was zu tun ist, um die Daten zwischen den Platten durch die Wahl unter-Plattenkalibrierung von der Vorverarbeitung Menü kalibrieren. </li><li> Es wird empfohlen, miRNA-Arrays in dreifacher Ausfertigung Läufen gefahren. Wenn ein miRNA ist nicht vorhanden, in mindestens zwei von drei Replikaten es als nonexpressed eingestellt werden. </li><li> Im nächsten Schritt wird in der Vorverarbeitung, stellen einen Schnitt aus. Eine Schnittwert festlegen, dass Daten mit einem Schwellenwert-Zyklus (C t) höher als dieser Wert, werden verworfen. In den vorliegenden Experimenten mit Rückenmarksflüssigkeit Probe wurde der Cut-off bei 39 gesetzt. Therefore werden alle Proben mit einem C t höher als 39 in den drei Replikate verworfen. Wenn ein miRNA einen C t&gt; 39 für eine Sonde (eine Nachbildung von drei) wird, dass das Lesen mit dem Durchschnitt der C t für die anderen zwei Sonden ausgetauscht werden, sofern sie beide unter 39. </li><li> Definieren Referenzgenen. Genex Professional verfügt über die Option, geNorm und / oder Normfinder nutzen, um Referenzgene zu identifizieren. Wählen Sie eine Liste von miRNAs, die ähnliche Cq-Werte über alle Proben haben und führen geNorm und / oder Normfinder. Nach dieser Analyse in dem hier angegebenen Beispiel miR-622 und miR-1266 hatte die gleichmäßige Werte für die Proben und wurden als Referenzgenen gewählt (Fig. 1). </li><li> Als nächstes werden Daten unter Verwendung der Referenzgenen normalisiert und die erhaltenen Werte entsprechen der &amp;Dgr; t </li><li> Wenn die cDNA-Synthese-Reaktionen wurden dreifach durchgeführt, zu diesem Zeitpunkt die Werte gemittelt werden. </li><li> Bestätigen Blatt erneutbewegen leer und fast leeren Spalten. In der Vorlauf Fenster wählen Sie &quot;Bestätigen Blatt&quot; und als auf der leeren Spalten löschen Linie gelten. In der Zeile darunter, wählte den gewünschten Prozentsatz der gültigen Daten und klicken Sie auf Anwenden. Wählen Sie zB 100%, wenn Sie nur miRNAs, die für alle Proben zu vergleichen wollen. </li><li> Griff fehlenden Daten. Wählen Sie &quot;Fehlende Daten&quot; aus der Vorverarbeitung Menü und wählte eine der Optionen, um fehlende Daten zu verarbeiten. Dieser Schritt ist erforderlich. Beachten Sie, dass Genex erhalten Sie Fehler, wenn Sie versuchen, Dateien, die nicht behandelte fehlenden Daten enthalten laden. </li><li> Bestimmen relative Quantifizierung zwischen Gruppen von Proben (dh. Experiment versus Kontrolle). Die relative Quantifizierung von Gruppen unter Verwendung des ΔΔ C t-Methode berechnet. In Genex, klicken Sie auf die Registerkarte Vorverarbeitung und wählen Sie die relative Quantifizierung. In dem Fenster wählen Sie die Referenzgruppe und schlug an. Beachten Sie, dass für den grafischen Darstellungen und / oder für weitere statistische Analysen, expression Daten sollten auf einer logarithmischen Skala umgewandelt werden. In der Vorlauf-Menü Log2. </li></ol> 2.3.3. Statistische Analyse Genex-Software ermöglicht eine breite Palette von statistischen Analysen, einschließlich T-Test und ANOVA. <ol><li> Lade die endgültige MDF-Datei in Genex und offene Daten-Manager. Es ist wichtig, die korrekte Muster oder Gruppen von Proben, für die statistische Analyse durchgeführt wird ausgewählt. </li><li> Wählen Sie &quot;Statistik&quot; und wählte das Symbol für den gewünschten Test. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Ausführen&quot; im Fenster der Systemsteuerung. Ergebnisse speichern als Excel-oder MDF-Dateien. </li></ol> 2.3.4. Expression-Profiling MicroRNAs und Proben klassifiziert werden können, geclustert und auf hitze Karten und Dendrogrammen visualisiert, wie folgt <ol><li> Lade die endgültige MDF-Datei in Genex und offene Daten-Manager. Verwenden Sie dieses Fenster, um Gruppen von Proben oder miRNAs auswählen und erstellen. Klicken Sie auf &quot;Übernehmen&quot;, wenn Sie fertig sind. </li> &lt;li&gt; In der linken oberen Ecke wählen Cluster und klicken Sie auf das Symbol Heatmap </li><li> Im Kontrollfenster klicken Sie auf &quot;Ausführen&quot;. Die Heatmap können in verschiedenen Formaten wie TIFF oder BMP gespeichert werden, es kann auch kopiert und modifiziert werden, wie gebraucht. </li></ol>

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	<li>Pacifici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+miRNA+profile+in+HIV-encephalitis.">Cerebrospinal fluid miRNA profile in HIV-encephalitis.</a> J. Cell. Physiol. 10, (2012).</li><li>Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+widespread+regulation+of+microRNA+biogenesis,+function+and+decay.">The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay.</a> Nat. Rev. Genet.. 11, 597-610 (2010).</li><li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+signatures+in+human+cancers.">MicroRNA signatures in human cancers.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 857-866 (2006).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microRNAs+in+serum:+a+novel+class+of+biomarkers+for+diagnosis+of+cancer+and+other+diseases.">Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.</a> Cell Res. 18, 997-1006 (2008).</li><li>De Smaele, E., Ferretti, E., Gulino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+biomarkers+for+CNS+cancer+and+other+disorders.">MicroRNAs as biomarkers for CNS cancer and other disorders.</a> Brain Res. 1338, 100-111 (2010).</li><li>Heneghan, H. M., Miller, N., Kerin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNAs+as+biomarkers+and+therapeutic+targets+in+cancer.">MiRNAs as biomarkers and therapeutic targets in cancer.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 10, 543-550 (2010).</li><li>Kosaka, N., Iguchi, H., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNA+in+body+fluid:+a+new+potential+biomarker+for+cancer+diagnosis+and+prognosis.">Circulating microRNA in body fluid: a new potential biomarker for cancer diagnosis and prognosis.</a> Cancer Sci. 101, 2087-2092 (2010).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers.">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435, 834-838 (2005).</li><li>Shah, A. A., Leidinger, P., Blin, N., Meese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA:+small+molecules+as+potential+novel+biomarkers+in+cancer.">miRNA: small molecules as potential novel biomarkers in cancer.</a> Curr. Med. Chem. 17, 4427-4432 (2010).</li><li>Blondal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+sample+and+miRNA+profile+quality+in+serum+and+plasma+or+other+biofluids.">Assessing sample and miRNA profile quality in serum and plasma or other biofluids.</a> Methods. 59, 1-6 (2013).</li><li>Jensen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two+commercial+global+miRNA+expression+profiling+platforms+for+detection+of+less+abundant+miRNAs.">Evaluation of two commercial global miRNA expression profiling platforms for detection of less abundant miRNAs.</a> BMC Genomics. 12, 435 (2011).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

MicroRNAs sind kleine nicht-kodierende RNAs, die die Genexpression regulieren, durch die Hemmung der Translation und / oder die Förderung der mRNA-Abbau 2. Aufgrund ihrer hohen Stabilität in zellfreien Bedingungen haben microRNAs in vielen Körperflüssigkeiten nachgewiesen worden. Außerdem hat deutliche Expressionsprofil miRNAs mit Stufe und / oder Progression bei einer Vielzahl von menschlichen Krebsarten 3-9 korreliert. Es gibt verschiedene Tools zur Verfügung, u...

MicroRNAs gehören zu der Familie der kleinen (21-23 nt Länge) nicht-kodierenden RNAs die Genexpression posttranskriptional regulieren. Mikro-RNAs in den extrazellulären Raum, in dem sie erscheinen, relativ stabil zu sein, sezerniert werden. Während Bestimmung von Veränderungen in der miRNA-Expression kann ein wichtiger Schritt zur Identifizierung von Biomarkern sein, die Durchführung miRNA-Profile und Handhabung einer großen Menge von Daten kann einschüchternd sein. Hier beschreiben wir ein Protokoll von Änderungen in miRNA-Expression in der Zerebrospinalflüssigkeit von einem empfindlichen Echtzeit-PCR (für andere Körperflüssigkeiten) zu bestimmen. Wir beschreiben auch die Verwendung von Software für die Datenanalyse, einschließlich der statistischen Auswertung und grafische Darstellung der Ergebnisse. Das gesamte Verfahren ist relativ einfach und unkompliziert und in Abhängigkeit von der Anzahl der Proben, die profiliert werden und die Anzahl von Echtzeit-PCR-Maschinen verfügbar sind, auch relativ schnell. Der experimentelle Teil erfordert Genauigkeit bei der HandhabungRNA und Pipettieren in 384-Well-Platten, während der Datenanalyse Abschnitt mit Genex erfordert einige Grundkenntnisse in Informatik und Statistik.

Table III. List of equipment
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:655px;" width="655">
	<tbody>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:27px;">
			Equipment
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:27px;">
			Company
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:27px;">
			Catalog Number
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Finnpipette Novus Multichannel Pipetter
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Thermo Scientific
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			HH05279
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Finntip Pipette Tips
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Thermo Scientific
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			9400613
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Thermal Cycler C1000
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Biorad
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Biorad
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			TLS0801
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Flat Cap Strips
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Biorad
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			TLS0803
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			LightCycler&#174; 480 Real-Time PCR System
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Roche
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			LightCycler&#174; 480 Sealing Foil
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Roche
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			04 729 757 001
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Refrigerated Centrifuge 5804R
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Eppendorf
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Swing-bucket Rotor, 4-place
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Eppendorf
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			A-4-44
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Bench-Top Mini Centrifuge
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			05-090-100
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Bench-Top Vortex
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			02-681-5
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Matrix Reagent Reservoir, 25 ml
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Thermo Scientific
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			8093
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Thermomixer Confort
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Eppendorf
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Bench-To Mini Centrifuge Sigma 1-15
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Bench-Top Vortex
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Velp Scientifica
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			F202A0173
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

Table IV. List of reagents
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:655px;" width="655">
	<tbody>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:25px;">
			Reagents
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:25px;">
			Company
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:25px;">
			Catalog Number
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Exiqon
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			203300
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Exiqon
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			203400
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Invitrogen
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			10977-015
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Exiqon
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			203608
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			mirVana&#8482; miRNA isolation Kit, 40 isolations
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Ambion
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			AM1556
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			MS2 RNA carrier
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Roche Applied Science
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			10165948001
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			2Betamercaptoethanol 98%
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Sigma Aldrich
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			M3148-25ml
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			Ethanol 100%
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Carlo Erba
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			64-17-5
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			Nuclease free water
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Qiagen
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			1039480
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			RNAse Zap&#174;
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Ambion
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			AM9780
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cerebrospinal fluid microrna profiling using quantitative real time pcr

<html> MicroRNAs (miRNAs) sind eine starke Schicht der Genregulation Führungs RISC zu Seiten mRNAs Ziel befindet und somit durch Modulation ihrer translationale Repression. Änderungen in der miRNA-Expression wurde gezeigt, dass bei der Entwicklung von allen großen komplexen Erkrankungen beteiligt sein. Darüber hinaus zeigten neuere Erkenntnisse, dass miRNAs an die extrazelluläre Umgebung sezerniert werden und in die Blutbahn und anderen Körperflüssigkeiten, wo sie mit hoher Stabilität zirkulieren kann. Die Funktion eines solchen zirkulierenden miRNAs bleibt weitgehend ungeklärt, aber systematische Hochdurchsatz-Methoden, wie z. B. miRNA-Profiling Arrays haben zur Identifizierung von miRNA-Signaturen in verschiedenen pathologischen Bedingungen, einschließlich der neurodegenerativen Erkrankungen und einige Krebsarten führen. In diesem Zusammenhang ist die Identifizierung von miRNA-Expressionsprofils in der Cerebrospinalflüssigkeit, wie in unserer jüngsten Studie berichtet, macht miRNAs attraktive Kandidaten für Biomarker-Analyse. _content &quot;&gt; Es gibt verschiedene Tools für die Profilierung von microRNAs, wie Microarrays zur Verfügung, quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) und deep sequencing. Hier beschreiben wir eine empfindliche Methode, um microRNAs in Liquor durch quantitative Echtzeit-PCR-Profil. Wir verwendet die Exiqon microRNA ready-to-use PCR menschlichen Platten I und II V2.R, die ermöglicht den Nachweis von 742 einzigartige menschliche microRNAs. Wir führten die Arrays in dreifacher Ausfertigung läuft und wir verarbeitet und analysiert Daten mit der Genex Professional 5 Software. Über dieses Protokoll, haben wir erfolgreich in verschiedenen Arten von Zelllinien und Primärzellen, Liquor, Plasma und Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Geweben Profil microRNAs.

Die Ergebnisse dieser Studie wurden bereits veröffentlicht worden 1. Abbildung 1 zeigt die Ergebnisse aus der Analyse der Kandidatenreferenz microRNAs mit geNorm Anwendung. Dementsprechend zwei microRNAs, miR-622 und miR-1266, wurden als Referenzgene identifiziert und wurden verwendet, um miRNA Werte normalisieren. Für die CSF-Studie hatten wir drei Gruppen von Proben: HIV-(n = 10), HIVE (n = 4) und HIV + ohne Enzephalitis (HIV +, n = ...

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Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

Wir beschreiben ein Protokoll der Echtzeit-PCR, um microRNAs in der Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit (CSF) zu profilieren. Mit Ausnahme von RNA-Extraktionsprotokollen kann der Vorgang um RNA aus anderen Körperflüssigkeiten, Zellkulturen oder Gewebeproben extrahiert verlängert werden.

Liquor microRNA Profiling mittels quantitativer Real-Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

cerebrospinal-fluid-microrna-profiling-using-quantitative-real-time

Research

JoVE Journal

Medicine

15.3K Aufrufe.  LSU Health Sciences Center.  Wir beschreiben ein Protokoll der Echtzeit-PCR, um microRNAs in der Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit (CSF) zu profilieren. Mit Ausnahme von RNA-Extraktionsprotokollen kann der Vorgang um RNA aus anderen Körperflüssigkeiten, Zellkulturen oder Gewebeproben extrahiert verlängert werden. 

Serie: Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Evaluation von Nanopartikel-Aufnahme in Tumoren in Echtzeit über Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Forschung

Medizin

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

MicroRNA-Detektion in Prostatatumoren durch quantitative real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Movement Retraining using Real-time Feedback of Performance

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular patterns responsible for governing the movement performance. This motor learning can be enhanced through a number of methods that are utilized in research and clinical settings alike. In general, verbal feedback of performance in real-time or knowledge of results following movement is commonly used clinically as a preliminary means of instilling motor learning. Depending on patient preference and learning style, visual feedback (e.g. through use of a mirror or different types of video) or proprioceptive guidance utilizing therapist touch, are used to supplement verbal instructions from the therapist. Indeed, a combination of these forms of feedback is commonplace in the clinical setting to facilitate motor learning and optimize outcomes.
Laboratory-based, quantitative motion analysis has been a mainstay in research settings to provide accurate and objective analysis of a variety of movements in healthy and injured populations. While the actual mechanisms of capturing the movements may differ, all current motion analysis systems rely on the ability to track the movement of body segments and joints and to use established equations of motion to quantify key movement patterns. Due to limitations in acquisition and processing speed, analysis and description of the movements has traditionally occurred offline after completion of a given testing session.
This paper will highlight a new supplement to standard motion analysis techniques that relies on the near instantaneous assessment and quantification of movement patterns and the display of specific movement characteristics to the patient during a movement analysis session. As a result, this novel technique can provide a new method of feedback delivery that has advantages over currently used feedback methods.

Retraining abnormal movement patterns following injury or disease is a key component of physical rehabilitation. Recent advances in technology have permitted accurate assessment of movement during a variety of tasks, with near instantaneous quantification of results. This provides new opportunities for modification of faulty movement patterns in real time.

Movement Umschulung mit Echtzeit-Feedback von Performance

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules that regulate HSCs. In these transplant model systems, the function of HSCs is determined by the ability of these cells to engraft and reconstitute lethally irradiated recipient mice. Commonly, the donor cell contribution/engraftment is measured by antibodies to donor- specific cell surface proteins using flow cytometry. However, this method heavily depends on the specificity and the ability of the cell surface marker to differentiate donor-derived cells from recipient-originated cells, which may not be available for all mouse strains. Considering the various backgrounds of genetically modified mouse strains in the market, this cell surface/ flow cytometry-based method has significant limitations especially in mouse strains that lack well-defined surface markers to separate donor cells from congenic recipient cells. Here, we reported a PCR-based technique to determine donor cell engraftment/contribution in transplant recipient mice. We transplanted male donor bone marrow HSCs to lethally irradiated congenic female mice. Peripheral blood samples were collected at different time points post transplantation. Bone marrow samples were obtained at the end of the experiments. Genomic DNA was isolated and the Y chromosome specific gene, Zfy1, was amplified using quantitative Real time PCR. The engraftment of male donor-derived cells in the female recipient mice was calculated against standard curve with known percentage of male vs. female DNAs. Bcl2 was used as a reference gene to normalize the total DNA amount. Our data suggested that this approach reliably determines donor cell engraftment and provides a useful, yet simple method in measuring hematopoietic cell reconstitution in murine bone marrow transplantation models. Our method can be routinely performed in most laboratories because no costly equipment such as flow cytometry is required.

Determining donor cell engraftment presents a challenge in mouse bone marrow transplant models that lack well-defined phenotypical markers. We described a methodology to quantify male donor cell engraftment in female transplant recipient mice. This method can be used in all mouse strains for the study of HSC functions.

Mittels quantitativer real-time PCR zum Donor Cell Engraftment in einem Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Modell fest

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with high-throughput cell positioning technology. The targeted tumor cell populations are first preprogrammed to immobilization into an array format, and labeled with green fluorescent cytosolic dyes. Following the cell array formation, antibody drugs are added in combination with human whole blood. Propidium iodide (PI) is then added to assess cell death. The cell array is analyzed with an automatic imaging system. While cytosolic dye labels the targeted tumor cell populations, PI labels the dead tumor cell populations. Thus, the percentage of target cancer cell killing can be quantified by calculating the number of surviving targeted cells to the number of dead targeted cells. With this method, researchers are able to access time-dependent and dose-dependent cell cytotoxicity information. Remarkably, no hazardous radiochemicals are used. The WCA presented here has been tested with lymphoma, leukemia, and solid tumor cell lines. Therefore, WCA allows researchers to assess drug efficacy in a highly relevant ex&#160;vivo condition.

The whole blood cytotoxicity assay (WCA) is a cytotoxicity assay developed by incorporating high-throughput cell positioning technology with fluorescence microscopy and automated image processing. Here, we describe how lymphoma cells treated with an anti-CD20 antibody can be analyzed real-time in human whole blood to provide quantitative cellular cytotoxicity analysis.

Echtzeit-Zytotoxizitätsassays in menschlichem Vollblut

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic biomarkers. However, methods for quantitative proteomic characterization of patient-derived tumors and in particular their cellular subpopulations are largely lacking. Here we describe an experimental set-up that allows quantitative analysis of proteomes of cancer cell subpopulations derived from either liquid or solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry followed by bioinformatic data analysis. To enrich specific cellular subsets, liquid tumors are first immunophenotyped by flow cytometry followed by FACS-sorting; for solid tumors, laser-capture microdissection is used to purify specific cellular subpopulations. In a second step, proteins are extracted from the purified cells and subsequently combined with a tumor-specific, SILAC-labeled spike-in standard that enables protein quantification. The resulting protein mixture is subjected to either gel electrophoresis or Filter Aided Sample Preparation (FASP) followed by tryptic digestion. Finally, tryptic peptides are analyzed using a hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer, and the data obtained are processed with bioinformatic software suites including MaxQuant. By means of the workflow presented here, up to 8,000 proteins can be identified and quantified in patient-derived samples, and the resulting protein expression profiles can be compared among patients to identify diagnostic proteomic signatures or potential drug targets.

In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

Quantitative massenspektrometrische Analyse von Krebs-Zellen-Proteome Abgeleitet von Liquid und soliden Tumoren

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Real-time X-ray Imaging of Lung Fluid Volumes in Neonatal Mouse Lung

At birth, the lung undergoes a profound phenotypic switch from secretion to absorption, which allows for adaptation to breathing independently. Promoting and sustaining this phenotype is critically important in normal alveolar growth and gas exchange throughout life. Several in vitro studies have characterized the role of key regulatory proteins, signaling molecules, and steroid hormones that can influence the rate of lung fluid clearance. However, in vivo examinations must be performed to evaluate whether these regulatory factors play important physiological roles in regulating perinatal lung liquid absorption. As such, the utilization of real time X-ray imaging to determine perinatal lung fluid clearance, or pulmonary edema, represents a technological advancement in the field. Herein, we explain and illustrate an approach to assess the rate of alveolar lung fluid clearance and alveolar flooding in C57BL/6 mice at post natal day 10 using X-ray imaging and analysis. Successful implementation of this protocol requires prior approval from institutional animal care and use committees (IACUC), an in vivo small animal X-ray imaging system, and compatible molecular imaging software.

We present a protocol to assess the rate of alveolar fluid clearance or pulmonary edema in neonatal mouse lung using X-ray imaging technology.

Echtzeit-Röntgenbildgebung von Lungenflüssigkeitsvolumen in Neonatal Mauslunge

At birth, the lung undergoes a profound phenotypic switch from secretion to absorption, which allows for adaptation to breathing independently. Promoting ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Beurteilung von Lungenmetastasen in Maus-Mammatumormodelle durch quantitative Echtzeit-PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic uses.
Exosomes have recently been shown to contain microRNAs (miRs). MiRs themselves have arisen as valuable biomarkers for diagnostic purposes. As specimen collection in clinics and hospitals is quite variable, miRNA isolation from whole bile varies substantially. To achieve robust, accurate and reproducible miRNA profiles from collected bile samples in a simple manner required the development of a high-quality protocol to isolate and characterize exosomes from bile. The method requires several centrifugations and a filtration step with a final ultracentrifugation step to pellet the isolated exosomes. Electron microscopy, Western blots, flow cytometry and multi-parameter nanoparticle optical analysis, where available, are crucial characterization steps to validate the quality of the exosomes. For the isolation of miRNA from these exosomes, spiking the lysate with a non-specific, synthetic miRNA from a species like Caenorhabditis elegans, i.e., Cel-miR-39, is important for normalization of RNA extraction efficiency. The isolation of exosome from bile fluid following this method allows the successful miRNA profiling from bile samples stored for several years at -80 &#176;C.

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

Isolation und Profilierung von microRNA-haltigen Exosomen von Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

Erweiterte Zeitraffer-Intravital Imaging von Echtzeit-Vielzellige Dynamics im Tumormikromilieu

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...